原兒茶酸對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠炎癥反應(yīng)及血管生成的作用機(jī)制研究

潘 敏， 王曉莉， 胡 婷， 付 瓊， 殷金鳳， 黃超林

(1.四川省成都市第二人民醫(yī)院， 四川 成都 610000 2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 四川 成都 610000)

子宮內(nèi)膜異位癥(heterotopia endometriosis，EMS)為子宮內(nèi)膜腺體或間質(zhì)在子宮外腔的沉降，與不規(guī)則子宮出血、不孕、性交困難和慢性盆腔疼痛相關(guān)[1]。5-50%的有生育問題的夫婦會(huì)患該病，10-20%的育齡婦女患有該病[2,3]。雖然該病在女性中很常見，但是目前對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的病因和病理生理學(xué)的了解尚不清楚。現(xiàn)存在幾種不同的學(xué)說來解釋子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制，其中逆月經(jīng)理論是認(rèn)可度最高的理論，即子宮內(nèi)膜細(xì)胞在月經(jīng)期間通過輸卵管回流到腹膜腔，植入并啟動(dòng)子宮內(nèi)膜異位病變的形成[4]。因此，根據(jù)其發(fā)病機(jī)制尋找有效的治療藥物對(duì)患者的康復(fù)非常有意義。原兒茶酸(Protocatechuic acid，PA)是一種天然酚酸，廣泛存在于日常的飲食和中草藥[5]。近年來，現(xiàn)代藥理學(xué)對(duì)原兒茶酸的藥理活性進(jìn)行了大量研究，其具有廣泛的藥理活性，如抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、抗菌、抗病毒、抗癌、抗骨質(zhì)疏松、鎮(zhèn)痛、抗衰老等活性，具有保護(hù)肝臟、腎臟和生殖功能的作用[6]。近期有研究報(bào)道[7]，原兒茶酸通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，改善呋喃暴露大鼠下丘腦-垂體-性腺軸功能的缺陷。推測(cè)原兒茶酸可能對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的治療也有一定作用。因此本研究擬建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，觀察原兒茶酸對(duì)模型大鼠子宮內(nèi)膜損傷、炎癥反應(yīng)的影響，揭示其與ERK/VEGF/MMP通路之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑:原兒茶酸(北京百靈威科技有限公司，批號(hào)：2954-52-1)、孕三烯酮膠囊(北京紫林藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H19980020)、蛋白提取試劑盒(批號(hào)：P0027)及BCA試劑盒(批號(hào)：P0011)(上海碧云天公司)、兔源GAPDH抗體、羊抗兔二抗、抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)抗體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抗體、血管生成素 1(Ang-1)抗體、血管生成素 2(Ang-2)抗體、總細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(t-ERK1/2)及磷酸化總細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(p-ERK1/2)抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)及白介素1β(IL-1β)ELISA檢測(cè)試劑盒(北京沃萊士生物科技有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選擇動(dòng)情期、未生育SPF級(jí)SD大鼠54只，均為雌性，體質(zhì)量(220±20)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物使用許可證SYXK(京)2017-0033。SD大鼠均飼養(yǎng)環(huán)境保持安靜、整潔、通風(fēng)，溫度約25℃，自由飲食，定期更換墊料，對(duì)鼠籠清潔、消毒。

1.3模型建立:參考王金霞[8]等的方法，通過自體移植法建立EMS大鼠，將雌性成年大鼠(未生育)腹腔注射5%水合氯醛進(jìn)行麻醉，劑量為0.07mL/kg。麻醉大鼠后，常規(guī)術(shù)前消毒，切開下腹部暴露子宮，挑離右側(cè)子宮角，切除約1cm子宮段，取5mm×5mm大小的子宮內(nèi)膜片，使其表面上皮對(duì)著腹壁，將四角與腹壁肌肉縫合，然后常規(guī)關(guān)腹，青霉素預(yù)防感染。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水及進(jìn)食。術(shù)后4周移植物外觀隆起透亮小包，表面有血管，內(nèi)部充滿積液。移植的子宮內(nèi)膜成活并沿腹壁表面再生，提示建模成功。

1.4分組處理:選取EMS模型大鼠54只隨機(jī)均分為6組，包括空白組、模型組、孕三烯酮組0.5mg·kg-1·d-1、PA(高、中、低)劑量組(劑量分別為1.5mg·kg-1·d-1、1mg·kg-1·d-1及0.5mg·kg-1·d-1)，另取9只正常大鼠作為正常組。PA各個(gè)劑量組和孕三烯酮組每天灌胃給藥1次，模型組每天給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥28d。

1.5指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1大鼠異位子宮內(nèi)膜體積測(cè)量及標(biāo)本采集:造模8周后，開腹觀察異位子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)情況，測(cè)量體積，記為V1，縫合腹部，以藥物灌胃治療7d，末次給藥24h后，再次開腹觀察異位子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)情況，測(cè)量體積，記為V2，計(jì)算大鼠的病灶體積。 末次給藥結(jié)束24h后，靜脈采血3mL，各組大鼠尾靜脈取血約3mL，4℃靜置過夜，2000rpm/min轉(zhuǎn)速，離心15min，取上清液，備用。處死大鼠，抽取腹腔積液3mL；剖取子宮，生理鹽水洗凈血污后，剪取1g組織，備用。

1.5.2ELISA檢測(cè)腹腔液炎性因子:取出上清液，使用TNF-α、IL-6及IL-1βELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β水平，具體操作參照說明書步驟。

1.5.3Western blot檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織Ang-1、Ang-2、t-ERK1/2、p-ERK1/2、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá):取2.4.1凍存子宮組織約0.3 g，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后，各組分別取20μg蛋白樣品進(jìn)行電泳。再將分離蛋白轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜，根據(jù)目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量截取目的蛋白，進(jìn)行蛋白標(biāo)記。加入5%的脫脂奶粉室溫封閉2h，分別加入Ang-1、Ang-2、t-ERK1/2、p-ERK1/2、VEGF、MMP-2和MMP-9一抗溶液(1∶1000)，4℃孵育過夜，使用TBST漂洗3次，加入羊抗兔二抗溶液，室溫孵育2h。凝膠成像儀采集圖像，Image J軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS26.0分析。符合正態(tài)分布且方差齊的多組數(shù)據(jù)使用方差分析聯(lián)合LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié) 果

2.1原兒茶酸對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥病灶體積的影響:與空白組比較，模型組大鼠第14、42d的病灶體積顯著升高；與模型組相比，原兒茶酸低劑量組、原兒茶酸中劑量組、原兒茶酸高劑量組、孕三烯酮組大鼠第14、42d的病灶體積顯著降低(P<0.05)。與原兒茶酸低劑量組相比，原兒茶酸中劑量組、原兒茶酸高劑量組、孕三烯酮組大鼠第14、42d的病灶體積顯著降低(P<0.05)；與原兒茶酸中劑量組相比，原兒茶酸高劑量組、孕三烯酮組大鼠第14、42d的病灶體積顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 原兒茶酸對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥病灶體積的影響

2.2原兒茶酸對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥腹腔液炎癥因子的影響:與空白組比較，模型組大鼠腹腔液炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β均顯著升高；與模型組相比，原兒茶酸低劑量組、原兒茶酸中劑量組、原兒茶酸高劑量組、孕三烯酮組大鼠腹腔液炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β均顯著降低(P<0.05)。與原兒茶酸低劑量組相比，原兒茶酸中劑量組、原兒茶酸高劑量組、孕三烯酮組大鼠腹腔液炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β均顯著降低(P<0.05)；與原兒茶酸中劑量組相比，原兒茶酸高劑量組、孕三烯酮組大鼠腹腔液炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 原兒茶酸對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥腹腔液炎癥因子的影響

2.3原兒茶酸對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜組織Ang-1和Ang-2蛋白表達(dá)的影響:與空白組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織Ang-1、Ang-2蛋白表達(dá)均顯著升高；與模型組相比，原兒茶酸低劑量組、原兒茶酸中劑量組、原兒茶酸高劑量組、孕三烯酮組大鼠子宮內(nèi)膜組織Ang-1、Ang-2蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。與原兒茶酸低劑量組相比，原兒茶酸中劑量組、原兒茶酸高劑量組、孕三烯酮組大鼠子宮內(nèi)膜組織Ang-1、Ang-2蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；與原兒茶酸中劑量組相比，原兒茶酸高劑量組、孕三烯酮組大鼠子宮內(nèi)膜組織Ang-1、Ang-2蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜組織Ang-1和Ang-2蛋白表達(dá)A：Ang-1和Ang-2蛋白電泳圖；B：Ang-1蛋白表達(dá)量；C：Ang-2蛋白表達(dá)量

2.4原兒茶酸對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥組織中ERK/VEGF/MMP通路的影響:與空白組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜異位癥組織中p-ERK1/2、VEGF 、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)均顯著升高；與模型組相比，原兒茶酸低劑量組、原兒茶酸中劑量組、原兒茶酸高劑量組、孕三烯酮組大鼠子宮內(nèi)膜異位癥組織中p-ERK1/2、VEGF 、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。與原兒茶酸低劑量組相比，原兒茶酸中劑量組、原兒茶酸高劑量組、孕三烯酮組大鼠子宮內(nèi)膜異位癥組織中p-ERK1/2、VEGF 、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；與原兒茶酸中劑量組相比，原兒茶酸高劑量組、孕三烯酮組大鼠子宮內(nèi)膜異位癥組織中p-ERK1/2、VEGF 、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥組織中t-ERK1/2、p-ERK1/2、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)A：t-ERK1/2、p-ERK1/2、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白電泳圖；B-F：t-ERK1/2、p-ERK1/2、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量

3 討 論

原兒茶酸對(duì)機(jī)體的多種疾病均具有炎癥和氧化應(yīng)激抑制的作用[9,10]，但是其在子宮內(nèi)膜異位癥中是否具有治療功能尚未可知。張玉珠等[11]研究報(bào)道，原兒茶酸明顯的減脂多糖對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜的病理?yè)p害，濃度依賴性抑制小鼠子宮內(nèi)膜組織中致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌。遺憾的是，原兒茶酸在子宮內(nèi)膜異位癥中的治療作用并未進(jìn)行相關(guān)研究。為了填補(bǔ)這一空白，本研究成功建立了子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，觀察原兒茶酸對(duì)模型大鼠是否有治療效果，結(jié)果顯示：子宮內(nèi)膜異位癥大鼠在第14d、42d時(shí)病灶體積明顯變大，TNF-α、IL-6、IL-1β分泌增多，異位子宮內(nèi)膜組織血管生成因子Ang-1、Ang-2表達(dá)升高，這證明大鼠的子宮內(nèi)膜異位癥模型制造成功。深入研究，給予不同濃度的原兒茶酸治療，發(fā)現(xiàn)模型大鼠的病灶明顯減少了，致炎因子的分泌量也降低了，Ang-1、Ang-2的水平也下降了，并且這些作用與原兒茶酸具有濃度依賴性，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了原兒茶酸對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的治療潛力。大鼠子宮內(nèi)膜異位癥涉及炎癥、血管生成，其參與的分子有炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子IL-1、IL-6、TNF-α及PCT、SAA、CRP等，血管生成相關(guān)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可溶性受體-1(sFlt-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管生成素(Ang)，而本文中檢驗(yàn)的指標(biāo)TNF-α、IL-6、IL-1β代表炎癥的變化，Ang-1、Ang-2指標(biāo)表示血管生成的變化。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種有效的血管生成誘導(dǎo)劑，被確定與腫瘤血管生成相關(guān)[12]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在蛋白水解、降解以及血管生成過程中降低細(xì)胞黏附，促進(jìn)細(xì)胞遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。ERK是絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號(hào)級(jí)聯(lián)的成員，參與磷酸化級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)的多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞的遷徙[14]。戴曉曉等[15]在子宮內(nèi)膜異位癥的研究中報(bào)道，ERK/VEGF/MMP9信號(hào)通路參與疾病的致病過程，并且該通路的活性可被熊果酸抑制，以發(fā)揮子宮內(nèi)膜血管生成的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠的異位子宮沒摸組織中p-ERK、VEGF 、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)均上調(diào)，說明了該通路的活性被異常激活，再次揭示了ERK/VEGF/MMP通路激活對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)揮致病作用。原兒茶酸給藥治療，呈現(xiàn)濃度依賴性降低p-ERK1/2、VEGF 、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平，抑制ERK/VEGF/MMP通路的活性，這說明原兒茶酸發(fā)揮子宮內(nèi)膜異位癥的治療效果與失活ERK/VEGF/MMP通路存在一定的相關(guān)性。

綜上所述，原兒茶酸縮小子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的子宮內(nèi)膜損傷面積，抑制炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生這種作用的機(jī)制可能與抑制了ERK/VEGF/MMP通路活性有關(guān)，為原兒茶酸在臨床上用于子宮內(nèi)膜異位癥的治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。