茶黃素調(diào)節(jié)AMPK/SIRT1/NF-κB信號(hào)通路對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用

郭文帆， 楊學(xué)鈺， 鄭雪君， 盧吉高， 楊 勇, 李會(huì)東

(河北省張家口市第二醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科， 河北 張家口 075000)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，是老齡化社會(huì)中導(dǎo)致老年人膝關(guān)節(jié)疼痛、功能下降和殘疾的常見原因。KOA的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，現(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)炎癥在KOA的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，其有助于KOA疼痛的發(fā)生[1]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)通路在協(xié)助細(xì)胞存活抑制炎癥和細(xì)胞凋亡以及刺激抗氧化劑合成方面起著不可或缺的作用，此外，上調(diào)SIRT1表達(dá)可通過靶向抑制核因子-κB(NF-κB)乙?；M(jìn)而抑制促炎因子的表達(dá)[2]。已研究發(fā)現(xiàn)紅花黃可通過調(diào)節(jié)AMPK/SIRT1/NF-κB通路改善TNF-α 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥[3]。茶黃素是紅茶發(fā)酵過程產(chǎn)生的一種多酚物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用[4]。并且已有研究發(fā)現(xiàn)茶黃素可以抑制原代小鼠軟骨細(xì)胞中由叔丁基過氧化氫 (TBHP) 引起的合成代謝和分解代謝失衡，并可通過Keap1/Nrf2/HO-1軸改善軟骨細(xì)胞凋亡和衰老水平，此外，口服茶黃素還可改善骨關(guān)節(jié)炎(OA)小鼠骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[5]。但對(duì)于茶黃素對(duì)KOA的治療作用尚無有報(bào)道，本研究通過向大鼠右膝關(guān)節(jié)注射碘乙酸鈉(MIA)建立KOA大鼠模型，探討茶黃素對(duì)KOA大鼠的治療作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料:76只雄性SD大鼠，(200±20)g，購自北京華益健康藥物研究中心，許可證號(hào)：SYXK(京)2019-0035。 將動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度(22±2)℃、濕度(60-80)%和12h/12h明暗交替的房間內(nèi)，自由飲食飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑:茶黃素(B20140)購自上海源葉生物科技有限公司；塞來昔布膠囊(H20213717，0.2g)購自北大醫(yī)藥股份有限公司；AMPK抑制劑Compound C( HY-13418A)購自MCE公司；IL-1β(RA20422)、TNF-α(RA20035)和COMP(RA20863)ELISA試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；SOD(A001-3-2)和MDA(A003-1-2)試劑盒購自南京建成；抗體AMPKα(ab32047)、NF-κB p65(ab32536)、SIRT1(ab110304)、GAPDH(ab8245)和辣根過氧化物酶 (HRP) 偶聯(lián)的二抗(ab6721)購自英國abcam公司。p-NF-κB p65(PA5-118566)、p-AMPKα(PA5-104982)購自Theremo Fisher公司。

1.3造模與分組:76只大鼠取13只作為空白組，其余大鼠通過0.3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉后，于右膝關(guān)節(jié)注射50μL，濃度為0.01mg/μL的MIA，空白組注射等量的生理鹽水[6]。兩周后觀察大鼠行為學(xué)變化，并從空白組和造模大鼠中隨機(jī)抽取3只，HE染色觀察右側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨的病理變化，使用Mankin和lequesne MG評(píng)分確定造模成功與否，當(dāng)Mankin 和lequesne MG評(píng)分顯著升高時(shí)，表示造模成功。Mankin 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估軟骨表面損傷(0～6分)、細(xì)胞性喪失(0～3分)、基質(zhì)染色喪失(0～4分)、潮痕完整性喪失(0～1分)；lequesne MG評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。將剩余造模成功的60只大鼠隨機(jī)分為6組：模型組、茶黃素低劑量組(20mg/kg)、茶黃素中劑量組(40mg/kg)、茶黃素高劑量組(80mg/kg)、塞來昔布組(陽性藥，18mg/kg(根據(jù)臨床有效劑量折算))、抑制劑組，每組10只。剩余10只為空白組。除空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水，茶黃素低、中、高劑量組以及塞來昔布組分別灌胃相應(yīng)劑量的藥物。抑制劑組除給予80mg/kg茶黃素外需尾靜脈注射0.2mg/kg AMPK抑制劑Compound C(根據(jù)購買說明書給藥)，其余組尾靜脈注射等體積生理鹽水，每天給藥一次，連續(xù)給藥4周。給藥4周后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置1h后離心收集血清，-20℃保存?zhèn)溆?。取右?cè)膝關(guān)節(jié)軟骨，表型觀察其病理改變，一半經(jīng)多聚甲醛固定24h后使用10%乙二胺四乙酸脫鈣后脫水包埋。另一半放入-80℃中備用。

表1 lequesne MG評(píng)分

1.4大鼠機(jī)械疼痛閾值檢測:大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后1天記為第1天。大鼠機(jī)械疼痛閾值檢測在第15天(造模后1天)，第29天(給藥第14天)和第43天(給藥第28天)進(jìn)行。大鼠在金屬籠中適應(yīng)30min后使用不同彎曲力的細(xì)絲刺激大鼠右肢足底二、三跖骨處，出現(xiàn)縮足反應(yīng)時(shí)記錄為陽性，當(dāng)記錄為陰性時(shí)，呈對(duì)數(shù)遞增刺激力度。初始刺激力度為2.0g，刺激時(shí)間為 8s，每只大鼠連續(xù)刺激3次，間隔為30s。記錄產(chǎn)生陽性反應(yīng)的最小刺激強(qiáng)度為機(jī)械疼痛閾值。

1.5測量大鼠關(guān)節(jié)寬度并觀察大鼠行為學(xué)變化:在第15天、29天和43天時(shí)使用游標(biāo)卡尺測量大鼠膝關(guān)節(jié)寬度，評(píng)估關(guān)節(jié)腫脹程度，并觀察大鼠行為學(xué)變化，給藥結(jié)束后1天進(jìn)行l(wèi)equesne MG評(píng)分。

1.6蘇木精-伊紅 (HE) 染色觀察大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)變化:大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨脫鈣后，脫水、石蠟包埋，之后進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化，并進(jìn)行Mankin 評(píng)分。

1.7ELISA法測定血清炎癥因子(IL-1β 、 TNF-α 和COMP):取各組大鼠血清，通過使用各自ELISA試劑盒檢測血清中IL-1β、TNF-α、COMP水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8WST-1法和硫代巴比妥酸法分別檢測氧化應(yīng)激標(biāo)志物SOD和MDA水平:1.7剩余血清通過使用WST-1法和硫代巴比妥酸法分別檢測大鼠血清SOD和MDA水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9Western Blot檢測蛋白表達(dá):取大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨提取總蛋白，BCA測定總蛋白濃度。使用SDS-PAGE分離目的蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后與一抗p-AMPKα、AMPKα、SIRT1、p-NF-κB p65、NF-κB p65和GAPDH在4℃下孵育過夜，后與二抗室溫孵育1h，加入ECL顯色觀察蛋白條帶，Image J軟件評(píng)估蛋白條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠造模成功評(píng)判:與空白組相比，造模大鼠Mankin和lequesne MG評(píng)分顯著升高，HE染色顯示造模大鼠染色不均勻，細(xì)胞排列紊亂，表面粗糙，排列不均勻，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，潮痕不明顯，顯示造模成功，見表2。

表2 各組大鼠軟骨組織Mankin和lequesne MG評(píng)分

2.2各組大鼠疼痛閾值及關(guān)節(jié)寬度變化情況:與空白組相比，第15天時(shí)，模型組、茶黃素低、中、高劑量組、塞來昔布組和抑制劑組大鼠疼痛閾值顯著降低，關(guān)節(jié)寬度顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，第29天和第43天，茶黃素低、中、高劑量組以及塞來昔布組大鼠疼痛閾值顯著升高，關(guān)節(jié)寬度減少(P<0.05)；與茶黃素高劑量組相比，抑制劑組大鼠疼痛閾值顯著降低，關(guān)節(jié)寬度增加(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠疼痛閾值及關(guān)節(jié)寬度變化情況

2.3各組大鼠軟骨組織的病理形態(tài)學(xué)觀察:空白組大鼠軟骨結(jié)構(gòu)完整，足底正常，各骨層HE染色清晰均勻，表面光滑無裂隙，軟骨細(xì)胞分布均勻，無聚集；模型組軟骨層較薄，大鼠足底腫脹，HE染色不均勻，細(xì)胞排列紊亂，表面粗糙，排列不均勻，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，潮痕不明顯；茶黃素低、中、高劑量組以及塞來昔布組大鼠足底腫脹較模型組明顯減輕，軟骨表面損傷輕微，染色更均勻，軟骨細(xì)胞可見；抑制劑組較茶黃素高劑量組軟骨細(xì)胞數(shù)量較少，表面較粗糙，染色不均勻。各組Mankin和lequesne MG評(píng)分顯示，與空白組相比，模型組Mankin和lequesne MG評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，茶黃素低、中、高劑量組以及塞來昔布組大鼠Mankin和lequesne MG評(píng)分顯著降低(P<0.05)，而抑制劑組Mankin和lequesne MG評(píng)分高于茶黃素高劑量組(P<0.05)，見圖1和表4。

圖1 各組大鼠HE染色病理觀察(×200)

表4 各組大鼠軟骨組織Mankin和lequesne MG評(píng)分

2.4各組大鼠血清IL-1β、TNF-α 、COMP、MDA、SOD水平:與空白組相比，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α 、COMP和MDA水平均顯著升高，SOD水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，茶黃素低、中、高劑量組和塞來昔布組IL-1β、TNF-α 、COMP和MDA水平均顯著降低，SOD水平顯著升高(P<0.05)；與茶黃素高劑量組相比，抑制劑組大鼠血清IL-1β、TNF-α 、COMP和MDA水平均顯著升高，SOD水平顯著降低(P<0.05)，見表5和表6。

表5 各組大鼠血清IL-1β TNF-α和COMP水平

表6 各組大鼠血清MDA和SOD水平

2.5各組大鼠p-AMPKα、AMPKα、SIRT1、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達(dá)情況:與空白組相比，模型組大鼠p-AMPKα/AMPKα、SIRT1表達(dá)水平均顯著降低，p-NF-κB p65/NF-κB p65水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，茶黃素低、中、高劑量組和塞來昔布組p-AMPKα/AMPKα、SIRT1表達(dá)水平均顯著升高，p-NF-κB p65/NF-κB p65水平顯著降低(P<0.05)；與茶黃素高劑量組相比，抑制劑組p-AMPKα/AMPKα、SIRT1表達(dá)水平均顯著降低，p-NF-κB p65/NF-κB p65水平顯著升高(P<0.05)，見圖2和表7。

表7 各組大鼠p-AMPKα AMPKα SIRT1 p-NF-κB p65 NF-κB p65蛋白表達(dá)

圖2 各組大鼠p-AMPKα、AMPKα、SIRT1、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達(dá)注：A：空白組；B：模型組；C：茶黃素低劑量組；D：茶黃素中劑量組；E：茶黃素高劑量組；F：塞來昔布組；G：抑制劑組

3 討 論

KOA的主要病理是關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨和關(guān)節(jié)部位軟組織中不可逆的退行性改變。本研究通過將MIA注射到大鼠膝關(guān)節(jié)誘導(dǎo)大鼠KOA模型，該模型與人類骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛和生化/結(jié)構(gòu)變化最為相似[6]。向大鼠膝關(guān)節(jié)注射MIA兩周后，大鼠膝關(guān)節(jié)HE染色不均勻，細(xì)胞排列紊亂，表面粗糙，排列不均勻，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，潮痕不明顯，且Mankin和lequesne MG評(píng)分顯著升高，顯示造模成功。COMP的濃度已被證明是關(guān)節(jié)炎早期軟骨病變的候選指標(biāo)[7]。此外，認(rèn)為減輕氧化應(yīng)激能有效改善KOA癥狀，已報(bào)道，SOD水平與KOA疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，而MDA水平與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[8]。本研究探討了茶黃素對(duì)KOA大鼠的治療作用。結(jié)果表明茶黃素低、中、高劑量組可顯著升高KOA大鼠疼痛閾值和SOD水平，減小大鼠關(guān)節(jié)寬度，降低Mankin和lequesne MG評(píng)分COMP和MDA水平，另外還可改善KOA大鼠足底腫脹，使HE染色更均勻，軟骨細(xì)胞增多，表面損傷減輕。表明茶黃素可以改善KOA大鼠的關(guān)節(jié)疼痛并對(duì)KOA大鼠具有治療作用。

AMPK是一種廣泛表達(dá)且高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被稱為細(xì)胞能量傳感器，能夠抑制氧化應(yīng)激和炎癥[9]。AMPK/SIRT1/NF-κB信號(hào)通路在炎癥發(fā)生過程中其重要作用，SIRT1的激活依賴于AMPK，AMPK上調(diào)SIRT1的蛋白表達(dá)，并在病理?xiàng)l件下抑制炎癥，此外，SIRT1也通過抑制其下游靶點(diǎn)NF-κB進(jìn)而減少促炎細(xì)胞因子(例如，IL-1β和TNF-α)的分泌，在抗炎中發(fā)揮作用。由于炎癥因子在KOA軟骨的破壞性改變和對(duì)軟骨骨結(jié)構(gòu)變化的修飾中起重要作用，并會(huì)加重疼痛反應(yīng)，因此，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生(IL-1β和TNF-α)是治療KOA最重要的目標(biāo)[10]。另外，已有研究發(fā)現(xiàn)兒茶素可通過AMPK/SIRT1/NF-κB信號(hào)通路抑制TNF-α誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞促炎細(xì)胞因子(IL-1α，IL-1β，IL-6)的產(chǎn)生而減弱炎癥的發(fā)生[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶黃素可以增加AMPKα磷酸化、SIRT1表達(dá)水平，降低IL-1β、TNF-α的分泌以及NF-κB p65蛋白磷酸化水平，提示茶黃素可通過AMPK/SIRT1/NF-κB信號(hào)通路抑制KOA大鼠炎癥進(jìn)而發(fā)揮對(duì)KOA大鼠的治療作用。隨后加入AMPK抑制劑Compound C經(jīng)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)抑制劑組可減弱茶黃素對(duì)KOA大鼠的治療作用，因此證實(shí)，茶黃素通過調(diào)節(jié)AMPK/SIRT1/NF-κB信號(hào)通路對(duì)KOA大鼠起治療作用。

綜上所述，茶黃素對(duì)KOA大鼠具有明顯的治療作用，其通過激活A(yù)MPK和SIRT1蛋白水平，抑制NF-κB水平，減輕炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。證明AMPK/SIRT1/NF-κB信號(hào)通路可作為治療KOA的新靶標(biāo)，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。