豬腹瀉病毒一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測法的建立及應(yīng)用

王一丹，楊發(fā)龍，陳弟詩，向華，任玉鵬

豬腹瀉病毒一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測法的建立及應(yīng)用

1西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2四川省動物疫病預(yù)防控制中心，成都 610041

【】建立一種可同時檢測豬流行性腹瀉病毒（PEDV）野毒株、豬A群輪狀病毒（GARV）、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）、豬阿爾法冠狀病毒（SADS-CoV）及豬捷申病毒（PTV）5種豬腹瀉病毒的一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測法。為豬腹瀉病的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供高效靈敏的工具?！尽繉?PEDV 多個基因型毒株ORF3基因比對分析，以PEDV野毒株為模板，對疫苗株ORF3基因穩(wěn)定缺失區(qū)域設(shè)計特異性探針，并在兩端保守區(qū)域設(shè)計上下游引物；在靠近GARV G3、G4、G5和G9型 NSP5基因5′端保守堿基區(qū)域設(shè)計引物及探針，并加入簡并堿基。同時，分別選擇PDCoV M基因、PTV 5′UTR序列、SADS-CoV N基因等保守基因設(shè)計特異性引物及探針，用于多重?zé)晒舛縋CR方法的建立。對引物、探針濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化；用RStudio參照代碼繪制ROC曲線，確定檢測方法的敏感度值、特異度值及曲線下面積AUC，并計算Youden指數(shù)，最終確定檢測臨界值；從陽性核酸中擴增靶基因，并克隆至pEASY-T1載體。通過體外轉(zhuǎn)錄，獲得5種標(biāo)準(zhǔn)品分別命名為：cRNA-PEDV、cRNA-GARV、cRNA-PDCoV、cRNA-PTV和cRNA-SADS-CoV。對檢測方法的敏感性、特異性和重復(fù)性等進(jìn)行評估；并與同類方法對臨床樣本的檢測符合率進(jìn)行比較?！尽康玫搅?種病原檢測的最佳引物、探針濃度和最佳退火溫度。根據(jù)ROC曲線確定PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV臨界CT值分別為：35.78、34.25、34.98、34.60和35.70；5種病原的檢測下限均可達(dá)到1×102copies/μL，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，擴增效率在96.3%—104%之間；該方法對PEDV CV777疫苗株、PEDV AJ1102疫苗株、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬霍亂沙門氏菌（）、多殺性巴氏桿菌（）、大腸桿菌（）、豬鏈球菌（）和葡萄球菌（）等多種菌毒株均不檢出，具有良好的特異性；經(jīng)重復(fù)性檢驗，組內(nèi)變異系數(shù)在0.22%—3.08%之間，組間變異系數(shù)在0.89%—4.0%之間；對242份臨床樣本檢測并與同類方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，符合率分別為：PEDV 97.9%、GARV 98.8%、PDCoV 100%、PTV98.3%和SADS-CoV100%，Kappa值均大于0.9。對PEDV野毒株的檢測準(zhǔn)確性高于同類方法。此外，對臨床樣本檢測結(jié)果顯示，當(dāng)前四川省腹瀉豬群中尚無SADS-COV檢出；但PEDV、GARV、PDCoV和PTV仍持續(xù)流行，其總體陽性率分別達(dá)到：10.7%（26/242）、13.6%（33/242）、18.2%（44/242）和14.5%（35/242），且各腹瀉病原之間存在不同形式和程度的混合感染，使感染豬腹瀉病情加劇。故需進(jìn)一步加強幾種豬腹瀉病毒在本地區(qū)豬群中流行情況調(diào)查和遺傳變異規(guī)律研究，為制定更具針對性的防控措施提供依據(jù)?！尽勘狙芯砍晒⒘艘环N同時檢測PEDV野毒、PDCoV、SADS-CoV和 GARV、PTV多基因型的一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR，為豬腹瀉病的快速鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了一種高效靈敏的工具。

一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR；豬腹瀉相關(guān)病毒；鑒別診斷；檢測臨界值

0 引言

【研究意義】豬病毒性腹瀉是國內(nèi)外生豬健康養(yǎng)殖過程中常見的一類重要疫病。在引起豬腹瀉的病毒中，α冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）和呼腸孤病毒科的豬A群輪狀病毒（porcine group A rotavirus, GARV）在國內(nèi)外分布最廣，常引起豬只劇烈腹瀉，導(dǎo)致仔豬存活率和育肥豬飼料轉(zhuǎn)化率下降。調(diào)查顯示，2015—2018年國內(nèi)22個省市543份樣本中，PEDV和GARV核酸檢測陽性率分別達(dá)到66.85%（363/543）和20.07%（109/543），尤其是PEDV抗體陽性率達(dá)到100%[1]。同時，近年還出現(xiàn)了兩種新型豬冠狀病毒，豬急性腹瀉綜合征病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV）和豬δ冠狀病毒（porcine delta coronavirus, PDCoV），也可引起仔豬腹瀉，且極易與PEDV或GARV發(fā)生混合感染，并顯著提高死亡率[2]。尤其是PDCoV在我國各地豬群中流行趨勢逐步上升，2015—2019年，在山東[3]、河南[4]、廣東[5]、廣西[6]和四川[7]等地樣本中均有檢出，部分豬群中核酸陽性率達(dá)36.43%（94/258）。此外，小RNA病毒科的豬捷申病毒（porcine teschovirus, PTV）也可引起仔豬嚴(yán)重的神經(jīng)性腦炎和腹瀉癥狀，與PEDV或PDCoV的混合感染率可高達(dá)62.53%[1]，增加了豬腹瀉病因的復(fù)雜性。在已報道的13個血清型中，PTV1、PTV2、PTV3、PTV6、PTV8和PTV11[8-9]等均可引起仔豬腹瀉[10]。上述5種病毒感染豬只過程中具有極為相似的臨床癥狀和病理變化，還常呈現(xiàn)不同形式的混合感染，使病情加劇，給鑒別診斷和疫病防控帶來困難。因此，建立一種可同時檢測PEDV、GARV、PDCoV、SADS-CoV和PTV的一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR方法對于豬腹瀉病的早期診斷、病原流行病學(xué)調(diào)查和深入研究多病原混合感染機制都至關(guān)重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在豬腹瀉病毒檢測方法研究中，以熒光定量PCR為代表的分子生物學(xué)檢測技術(shù)具有靈敏度高、特異性強和時效性好的優(yōu)點，應(yīng)用最為廣泛[11]。但現(xiàn)有方法仍存在不足，如：對PEDV的檢測，常靶向其保守性較高的M基因[12]和N基因[13]，導(dǎo)致大部分方法不能區(qū)分PEDV野毒株和疫苗株。研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)傳代的PEDV弱毒疫苗株ORF3基因中存在50 bp左右堿基缺失，是區(qū)分強弱毒株的重要分子標(biāo)志[14]。目前基于該基因也已建立部分鑒別PEDV野毒株和疫苗株的RT-PCR和SYBRⅠ實時熒光定量PCR檢測法[15-16]；但在TaqMan熒光定量PCR中研究較少，尤其在多重TaqMan熒光定量PCR中實現(xiàn)對PEDV野毒株的針對性檢測尚未見報道。此外，GARV不同基因型毒株間差異較大，通過一種引物和探針實現(xiàn)對所有基因型GARV的檢出十分困難。據(jù)調(diào)查顯示，GARV G3型、G4型、G5型和G9型在國內(nèi)腹瀉豬中最常見，是當(dāng)前流行GARV的優(yōu)勢基因型[17-18]。因此，理論上可在保證敏感性和特異性前提下設(shè)計引物和探針，實現(xiàn)對GARV優(yōu)勢毒株的同時檢出，減少獸醫(yī)臨床上對GARV的漏檢。此外，雖然當(dāng)前已有部分關(guān)于PDCoV、SADS-CoV和PTV檢測方法的研究，但通過TaqMan熒光定量PCR實現(xiàn)對幾種病毒同時鑒別的方法尚未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】綜合上述5種豬腹瀉相關(guān)病毒的研究現(xiàn)狀并結(jié)合獸醫(yī)臨床診斷實際需求，本研究擬以PEDV ORF3基因、GARV NSP5基因、PDCoV M基因、SADS-CoV N基因和PTV 5′UTR基因為靶基因設(shè)計5對探針及引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，初步確定檢測臨界值，評估其特異性、靈敏性和重復(fù)性，以期建立一種可以同時檢測PEDV野毒株、GARV優(yōu)勢基因型、PDCoV、SADS-CoV和PTV的一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為5種豬病毒性腹瀉病原的快速鑒別診斷、流行病學(xué)調(diào)查和多病原混合感染模式及機制研究提供新型可靠的手段。

1 材料與方法

試驗于2020年4月至2021年8月在西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室及四川省動物疫病預(yù)防控制中心完成。

1.1 菌毒株

研究所用菌毒株主要用于方法建立過程中的基因擴增，反應(yīng)條件優(yōu)化及特異性檢驗，主要包括：PEDV疫苗株和野毒株、GARV 3個基因型核酸、PDCoV、PTV 2個基因型核酸、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬霍亂沙門氏菌（）、豬源巴氏桿菌（）、豬源大腸桿菌（）、豬鏈球菌（）和葡萄球菌（），詳細(xì)信息見表1。

1.2 主要試劑

豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒多聯(lián)快速實時熒光RT-PCR檢測試劑盒購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司（批號：TPR20191102P）；KOD OneTMPCR Master Mix購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit質(zhì)粒小量提取試劑盒購自美國OMEGA生物技術(shù)公司；Trizol核酸提取試劑、Transcription T7 Kit（for siRNA Synthesis）和One Step PrimeScript? RT-PCR Kit（Perfect Real Time）購自TaKaRa公司；pEASY?- Blunt Cloning Kit、Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SADS-CoV N基因（登錄號：MK651076.1）[19]克隆載體（pUC57- SADS-CoV）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 樣本來源及處理

研究所用臨床樣本采自2020—2021年，四川省綿陽、樂至、雅安、巴中、南充等地區(qū)腹瀉豬肛門棉拭子樣本共242份。采集實驗級巴馬小型豬肛門棉拭子用豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒多聯(lián)快速實時熒光RT-PCR檢測試劑盒及參考文獻(xiàn)報道的TaqMan探針熒光檢測法分別對PEDV、GARV、PDCoV[12]、PTV[20]和SADS-CoV[21]進(jìn)行檢測，獲得90份真陰性樣本。所有樣本按1﹕3（v/v）加入無菌 PBS，低溫保存送樣至實驗室。后經(jīng)震蕩混勻，反復(fù)凍融3次，離心取上清，用Trizol法提取總核酸，存于-80℃冰箱備用。

表1 用于特異性試驗的菌毒株信息

1)a：西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室；b：哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司；c：武漢科前生物股份有限公司；d：四川省動物疫病預(yù)防控制中心

1)a: College of Animal medical laboratory of Southwest Minzu University; b: Harbin Harvac biotechnology co. Ltd; c: Wuhan Keqian biology co. Ltd; d: Sichuan Animal Disease Prevention and Control Center

1.4 探針、引物的設(shè)計與合成

使用Megalign將GenBank中已登錄的包括PEDV G1a、G1b、G2a和G2b等4種基因亞型共24個野毒株和減毒疫苗株（CV777DR13AJ1102P-5）的ORF3基因進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，弱毒疫苗株ORF3基因244—295位均存在50—51 bp堿基缺失，這與SU等[22]的研究結(jié)論相符。根據(jù)這一特征，本研究以該區(qū)域為靶點設(shè)計特異性探針（230—255 bp），使其僅針對PEDV野毒株進(jìn)行檢測；上下游引物分別位于ORF3基因178—197位和336—354位保守區(qū)域（表2）。

對GARV引物及探針設(shè)計時，首先對已登錄的4種G型GARV NSP5基因序列比較，發(fā)現(xiàn)靠近5′端約290個堿基同源性可達(dá)（96.3%—100%），是所有基因節(jié)段中最為保守的區(qū)域；以NSP5基因為靶點，根據(jù)其保守區(qū)域設(shè)計引物（103—121 bp、269—286 bp）及探針（242—265 bp），并加入簡并堿基，在理論上確保該方法對G3、G4、G5和G9型GARV毒株的檢出。

此外，對PDCoV M基因、PTV 5′UTR基因、SADS-CoV N基因的保守區(qū)域分別設(shè)計特異性引物及探針，用于多重?zé)晒舛縍T-PCR方法的建立，詳細(xì)信息見表2。同時，分別對上述靶基因全基因序列進(jìn)行擴增，用于cRNA標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建，詳細(xì)信息見表3。所有引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV靶基因擴增引物

表3 熒光定量RT-PCR引物和探針

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將PEDV、GARV、PDCoV、PTV陽性核酸和 pUC57-SADS-CoV 用靶基因擴增引物擴增（表2）。回收純化擴增產(chǎn)物并連接至pEASY?-Blunt Cloning Kit，轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽性克隆菌提取質(zhì)粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

將GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV陽性質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Ⅰ、PEDV用限制性內(nèi)切酶H Ⅰ線性化處理后，用DNA純化試劑盒純化回收，用Transcription T7 Kit 試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為：10×Transcripition Buffer 2 μL、4種dNTP Solution各2 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、T7RNA Polymerase 2 μL、RNase free dH2O 1.5 μL、linear template DNA 6 μL；反應(yīng)程序為：42℃，2 h。反應(yīng)結(jié)束后，加5 μL RNase free DNaseⅠ，37℃ 30 min，用Trizol法純化cRNA。將標(biāo)準(zhǔn)品分別命名為：cRNA-PEDV、cRNA-GARV、cRNA-PDCoV、cRNA- PTV和cRNA-SADS-CoV。用NanoDorp2000測定cRNA濃度，用RNase free dH2O將cRNA濃度統(tǒng)一調(diào)整到5×108copies/μL并等體積混勻備用，混勻后各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1×108copies/μL。cRNA拷貝數(shù)用以下公式計算：

copies/μL

1.6 一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

用5種病毒cRNA標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，分別對各引物濃度（0.04—4 μmol·L-1）、探針濃度（0.04—4 μmol·L-1）、退火溫度（50℃—60℃）進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)程序為：42℃ 5 min，95℃ 10 s；95℃ 5 s，退火 30 s，采集熒光信號，40個循環(huán)。

1.7 檢測臨界值的確定

將每種病毒cRNA等量混合并稀釋到101、102、103拷貝各30份，再分別與真陰性樣本總RNA按1﹕1（v/v）等體積混合，作為真陽性樣本。分別用本研究建立的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法對真陰性樣本及cRNA真陽性樣本進(jìn)行檢測，用RStudio參照代碼繪制ROC曲線（Receiver operating characteristic curve，ROC曲線），確定檢測方法的敏感度值（sensitivity, Se值）、特異度值（specificity, Sp值）及曲線下面積AUC，并計算Youden指數(shù)（Youden index）（Youden index=Se+Sp-1）。Youden指數(shù)較大值所對應(yīng)的數(shù)值為檢測臨界值。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將各病毒cRNA標(biāo)準(zhǔn)品等體積混合后，進(jìn)行101—108稀釋，并進(jìn)行一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR反應(yīng)，以拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，CT值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算擴增效率。E=[10-(1/slope)-1] ×100%。

1.9 敏感性測試

cRNA標(biāo)準(zhǔn)品混合物10倍倍比稀釋，進(jìn)行一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR反應(yīng)，評價該方法的靈敏性。

1.10 特異性檢驗

用多重TaqMan熒光定量RT-PCR方法對PEDV（SCXM株、SWUN-D1株、SWUN-D2株、CV777疫苗株、AJ1102疫苗株）、GARV（G3、G5、G9型）、PDCoV、PTV（3、6型）、cRNA-SADS-CoV、TGEV、CSFV、PRV、PRRSV、、、和等13種豬常見的細(xì)菌病毒進(jìn)行檢測，用真陰性核酸作陰性對照，無菌水為空白對照，進(jìn)行特異性檢驗。

1.11 重復(fù)性試驗

分別用102、104、106拷貝的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品混合物稀釋液，在第1、7、30天分別進(jìn)行3次重復(fù)試驗，計算組內(nèi)和組間變異系數(shù)，評價方法的重復(fù)性。

1.12 臨床樣本檢測

用本研究建立的一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR法對采自2020—2021年四川省5個地區(qū)242份肛門棉拭子樣本進(jìn)行檢測。同時，用商品化試劑盒及參考文獻(xiàn)報道的同類方法再次檢測臨床樣本進(jìn)行復(fù)核，比較不同方法[12,20-21]的檢測效果和符合率。

2 結(jié)果

2.1 最佳反應(yīng)條件

分別對引物、探針濃度及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳反應(yīng)體系為：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 25 μL，TaKaRa Ex Taq HS 1 μL，PrimeScripeRT Enzyme Mix Ⅱ 1 μL，PEDV（引物0.56 μmol·L-1，探針0.36 μmol·L-1），GARV（引物0.2 μmol·L-1，探針0.1 μmol·L-1），PDCoV（引物0.2 μmol·L-1，探針0.32 μmol·L-1），PTV（引物0.32 μmol·L-1，探針0.12 μmol·L-1），SADS-CoV（引物0.36 μmol·L-1，探針0.12 μmol·L-1），Total RNA 7.5 μL，RNase Free dH2O 3.3 μL；最佳退火溫度58℃。

2.2 檢測臨界值

根據(jù)繪制的ROC曲線結(jié)果顯示（圖1），本方法對PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV的CT臨界值分別為：35.78（Sp值0.93、Se值0.87、Youden指數(shù)0.8）、34.25（Sp值0.78、Se值0.84、Youden指數(shù)0.62）、34.98（Sp值0.80、Se值0.95、Youden指數(shù)0.75）、34.60（Sp值0.92、Se值0.7、Youden指數(shù)0.62）、35.70（Sp值0.90、Se值為0.77、Youden指數(shù)0.67）。AUC值均大于0.8，表明檢測準(zhǔn)確性良好。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

5種豬腹瀉病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，結(jié)果顯示，各組拷貝數(shù)與CT值有良好的線性關(guān)系，擴增效率較高：PEDV（2= 0.9901，E=104%），GARV（2= 0.9976，E=102%），PDCoV（2= 0.9961，E=102%），PTV（2= 0.9984，E=98.7%），SADS-CoV（2= 0.9993，E=96.3%）。

2.4 敏感性試驗

根據(jù)敏感性測試結(jié)果并結(jié)合檢測臨界值判定，PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV最低檢測限均可達(dá)到1×102copies/μL（圖3）；其中，對SADS-CoV檢測時，1×101copies/μL樣本對應(yīng)CT值為37.42（表4），但通過ROC曲線確定的臨界CT值為35.11，表明該方法無法檢測到1×101copies/μL的SADS-CoV cRNA。

a. PEDV; b. GARV; c. PDCoV; d. PTV; e. SADS-CoV

表4 一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR敏感性

2.5 重復(fù)性試驗

重復(fù)性試驗結(jié)果如表5所示，PEDV組內(nèi)變異系數(shù)為1.06%—2.64%，組間變異系數(shù)為0.47%—2.07%；GARV組內(nèi)變異系數(shù)為0.22%—2.31%，組間變異系數(shù)為0.89%—1.99%； PDCoV組內(nèi)變異系數(shù)為1.95%—2.46%，組間變異系數(shù)為1.03%—4.0%；PTV組內(nèi)變異系數(shù)為0.42%—1.76%，組間變異系數(shù)為0.91%—3.80%；SADS-CoV組內(nèi)變異系數(shù)為1.16%—3.08%，組間變異系數(shù)為0.77%—1.78%。以上數(shù)據(jù)表明，一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR具有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)性。

a. PEDV；b. GARV；c. PDCoV；d. PTV；e. SADS-CoV

表5 一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR重復(fù)性CT值分析

a. PEDV; b. GARV; c. PDCoV; d. PTV; e. SADS-CoV

2.6 特異性試驗

特異性試驗結(jié)果顯示，該方法只檢出PEDV野毒株、GARV（G3、G5、G9型）、PDCoV、PTV（3、6型）、cRNA-SADS-CoV，對PEDV弱毒疫苗株及其他豬常見病原均無非特異性擴增曲線（圖4），結(jié)果表明該方法特異性良好。

2.7 臨床樣本檢測

用本研究建立的一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR法對2020—2021年四川省5個地區(qū)242份腹瀉豬樣本進(jìn)行檢測。同時用商品化熒光定量試劑盒及文獻(xiàn)報道方法[12, 20-21]與本方法進(jìn)行檢測符合率比較。結(jié)果顯示，對PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV符合率分別為：97.9%（=0.9）、98.8%（=0.95）、100%（=1）、98.3%（=0.93）和100%（=1）（表6）。其中，商品化試劑盒比本研究建立方法，多檢出5份PEDV陽性樣本，漏檢3份GARV陽性樣本和4份PTV陽性樣本。筆者進(jìn)一步對上述樣本中，PEDV ORF3基因、GARV NSP5基因和PTV 5′ UTR序列分別進(jìn)行了普通PCR擴增和測序分析（引物序列見表2）。結(jié)果顯示，本方法未檢出的5個PEDV ORF3基因與CV777 弱毒株（登錄號：GU372744.1）基因序列同源性均高于99%，且存在堿基缺失，表明樣本中存在PEDV疫苗毒且對試劑盒檢測結(jié)果造成了干擾。對GARV NSP5基因和PTV 5′ UTR基因的測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析表明，與GenBank中登錄序列同源性均高于97%。表明本研究建立的一步法多重?zé)晒舛繖z測法對GARV和PTV的檢測靈敏度更高。

1. PEDV SCXM株；2. PEDV SWUN-D1株；3. PDCoV；4. PEDV SWUN-D2株；5-7. GARV（G3、G5、G9型）；8. cRNA-SADS-CoV；9-10. PTV（3、6型）；11-30. PEDV（CV777株、AJ1102株）、TGEV、CSFV、PRV、PRRSV、S.choleraesuis、P.multocida、E.coli、S.suis、S.aureus、健康豬樣本、無菌水

表6 一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR與同類方法比較的檢測

此外，根據(jù)本次調(diào)查，在四川省5個地區(qū)均無SADS-CoV檢出；但PEDV、GARV、PDCoV和PTV群體陽性率分別：60%（3/5）、80%（4/5）、60%（3/5）和60%（3/5），總體陽性率分別為：10.7%（26/242）、13.6%（33/242）、18.2%（44/242）和14.5%（35/242）（表7）。此外， PEDV和GARV混合感染率為2.5%（6/242），PEDV和PDCoV混合感染率為6.2%（15/242），PDCoV和PTV混合感染率為2.9%（7/242），PEDV、GARV和PDCoV混合感染率為1.7%（4/242）。上述結(jié)果表明，目前PEDV、GARV、PDCoV和PTV在四川地區(qū)腹瀉豬群中仍廣泛存在，且還出現(xiàn)不同程度的混合感染，加劇豬腹瀉發(fā)病率和死亡率，需要進(jìn)一步對該地區(qū)豬腹瀉病原感染情況和遺傳變異特征進(jìn)行調(diào)查，制定更具針對性的防控措施。

3 討論

3.1 一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR在病原檢測中的優(yōu)勢

在所有病毒檢測技術(shù)中，以熒光定量PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)不論在檢測靈敏度、特異性或穩(wěn)定性方面都具有明顯優(yōu)勢。尤其是TaqMan熒光定量PCR，通過探針與模板靶向結(jié)合釋放熒光信號，增強了反應(yīng)的特異性，實現(xiàn)了對病毒核酸拷貝數(shù)的定量檢測。經(jīng)比較研究，TaqMan熒光定量PCR的檢測限通常能達(dá)到101—102copies/μL，分別是SYBR Green ?染料法熒光定量PCR和普通PCR的100倍和1 000倍[23]。但TaqMan熒光定量PCR也存在試劑及耗材價格貴，單次試驗成本高的不足。若將多對引物及探針加入同一反應(yīng)體系，實現(xiàn)一次試驗對多病原的檢測，則可大幅縮短操作時間，減少聚合酶的消耗量。此外，將反轉(zhuǎn)錄酶加入TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系，實現(xiàn)RNA反轉(zhuǎn)錄和cDNA擴增的一體化，這也是許多RNA病毒檢測方法研究過程或商品試劑盒中的常見做法[24]。其優(yōu)點在于可有效簡化加樣程序，減少污染，縮短檢測時間?；诖?，本研究針對5種具有相似臨床特征的豬腹瀉病毒建立了一種一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法，優(yōu)化獲得其最佳反應(yīng)體系和條件，可用于批量樣本中5種豬腹瀉病毒的快速檢測、鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

表7 臨床樣本陽性檢出率

3.2 多重TaqMan熒光定量PCR靶基因的選擇

靶基因的選擇是影響TaqMan熒光定量PCR靈敏性和特異性的重要因素之一。在本試驗設(shè)計過程中，除選擇對PEDV自然感染毒株和減毒疫苗株有鑒別作用的ORF3基因為靶點外[22]，還分別對GARV、G3、G4、G5和G9型多個毒株的11個基因節(jié)段進(jìn)行了比較，在NSP5基因靠近5′ 端區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個約290個堿基的保守區(qū)域（同源性為96.3%—100%），以此為靶點設(shè)計特異性引物和探針，理論上確保了對G3、G4、G5和G9型GARV毒株的檢出。此外，對PTV 13種血清型基因比對發(fā)現(xiàn)，5′UTR 相對保守，僅存在少數(shù)位點的突變，可作為靶基因來設(shè)計引物和探針，同時加入簡并堿基提高了方法的敏感性。PDCoV M基因和SADS-CoV N基因也是冠狀病毒檢測常用的保守靶基因[21,25]，不同毒株間同源性都在96%以上。故本研究選用上述靶基因建立檢測法，在完成對PEDV、GARV、PDCoV、SADS-CoV和PTV同時鑒別檢測的基礎(chǔ)上，最大程度保證本方法對不同毒株的檢出率，尤其是對PEDV野毒株的針對性檢出和對GARV優(yōu)勢基因型的檢出。

3.3 同類檢測方法對臨床樣本中病原檢出率的比較分析

本研究中，用該方法和同類方法同時檢測臨床樣本，結(jié)果對PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV的檢測符合率分別為：97.9%（k=0.9）、98.8%（k=0.95）、100%（k=1）、98.3%（k=0.93）和100%（k=1）。此外，本研究建立的一步法多重?zé)晒舛縍T-PCR比商品化試劑盒多檢出5份PEDV陽性樣本，經(jīng)測序分析為PEDV疫苗株；而本方法對GARV和PTV也具有更高的檢測靈敏性。對2020—2021年四川部分地區(qū)豬腹瀉病因調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PEDV、GARV、PDCoV和PTV仍廣泛存在，且還出現(xiàn)不同程度的混合感染，加劇豬腹瀉病毒發(fā)病率和死亡率，提示該地區(qū)還需進(jìn)一步對豬腹瀉病原的流行病學(xué)及遺傳變異特征進(jìn)行調(diào)查，制定更具針對性的防控措施。

3.4 ROC曲線在檢測臨界值確定中的應(yīng)用分析

在TaqMan熒光定量PCR檢測方法建立過程中，檢測臨界值的確定是難點之一。在大部分研究階段，檢測臨界值主要根據(jù)對倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的檢測CT值來確定，即通常默認(rèn)檢測下限對應(yīng)的CT值為臨界點，或默認(rèn)臨界CT值為40。但從統(tǒng)計學(xué)角度看，這種方式不夠嚴(yán)謹(jǐn)，易受多種試驗因素影響導(dǎo)致臨界值偏高或偏低[26]。ROC曲線即受試者工作特征曲線，是反映檢測方法敏感度和特異度連續(xù)變量的綜合指標(biāo)。在曲線繪制過程中，將連續(xù)變量設(shè)定多個不同的臨界點，分別計算Se和Sp值，以Se值為縱坐標(biāo)，1-Sp值為橫坐標(biāo)繪制ROC曲線，Se值與Sp值成反比，而最佳臨界點對應(yīng)的特異度與敏感度均為最佳，即曲線最左上方Y(jié)ouden指數(shù)最大的切點[27]。在臨床上，ROC曲線已被用于評估多種診斷方法的最佳臨界點[28]。如：LAAMIRI等[27]基于ROC曲線分析，確定了針對4種禽呼吸道病毒的多重TaqMan熒光定量PCR檢測法的臨界CT值和檢測下限，為ROC曲線在熒光定量PCR檢測臨界值確定中的應(yīng)用提供了參考。本研究基于上述原理，根據(jù)多重TaqMan熒光定量RT-PCR方法對真陽性和真陰性樣本的檢測結(jié)果，通過ROC曲線分析確定了檢測方法臨界CT值分別為：PEDV 35.78、GARV 34.25、PDCoV 34.98、PTV 34.60 和 SADS-CoV 35.70。此外，構(gòu)建的ROC曲線中AUC值均大于0.8，表明檢測方法準(zhǔn)確性良好[27]。

4 結(jié)論

建立了一種可同時檢測PEDV野毒株、PDCoV、SADS-CoV、PTV以及GARV多種優(yōu)勢基因型的一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測法。經(jīng)驗證，該方法具有良好的特異性和敏感性；初步應(yīng)用于臨床樣本檢測取得理想的效果。該方法的建立為豬腹瀉病毒的快速鑒別診斷和流行情況監(jiān)測提供了可靠工具，對豬腹瀉病的預(yù)防控制具有重要意義。同時，研究所采用的ROC曲線法確定臨界CT值，可為今后其他同類方法的建立和研究提供理論參考。

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One-Step Multiple TaqMan Real-time RT-PCR for Simultaneous Detection of Swine Diarrhea Viruses

1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Southwest Minzu University, Chengdu 610041;2Sichuan Provincial Center for Animal Disease Prevention and Control, Chengdu 610041

【】 The aim of this study was to establish a one-step multiplex real-time RT-PCR method to simultaneously detect and quantify five swine diarrhea related viruses, PEDV, GARV, PDCoV, SADS-CoV and PTV, so as to provide an efficient and sensitive tool for rapid diagnosis and epidemiological investigation of porcine diarrhea.【】The ORF3 gene sequences of several genotypes of PEDV were analyzed, and then the primers and probes were designed for detection of PEDV field strains by referring to the ORF3 genes, which contained deletion mutations in attenuated strains. The 5'-end conserved region of NSP5 genes of GARV G3, G4, G5 and G9 strains were analyzed for design of probes and primers. The specific primers and probes targeting to the conserved regions of PDCoV M, PTV 5'UTR and SADS-CoV N genes were designed for detection of the pathogens. The ROC curves were completed by referring to parameters that were set in RStudio. The specificity value, sensitivity value, and areas under the curves (AUC) and Youden value were calculated according to ROC curves to determine the cut-off CT value.The amplified fragments were cloned into pEASY-T1 vector. The standards prepared throughtranscription were named as cRNA-PEDV, cRNA-GARV, cRNA-PDCoV, cRNA-PTV and cRNA-SADS-CoV. The sensitivity, specificity and repeatability of one-step multiplex real-time RT-PCR were evaluated. Coincidence rate between this and another similar method were compared in the detection of clinical samples. 【】 Both the annealing temperature and optimal concentrations of primers and probes were obtained for detection of the five pathogens. According to the ROC curve, the CT cut off values for detection of PEDV, GARV, PDCoV, PTV, and SADS-CoV were set as 35.78, 34.25, 34.98, 34.60, and 35.70, respectively. The detection sensitivity of this method for the five pathogens could reach 1×102copies/μL. The standard curves had a good linear relationship and the amplification efficiency was between 96.3% and 104%. The established method could not detect the PEDV vaccine strains and other swine infecting viruses and bacteria including TGEV, CSFV, PRV, PRRSV,,,,and. The repeatability test showed the range of intra-assay and inter-assay coefficients of variability: 0.22% to 3.08% and 0.89% to 4.0%, respectively. The detection coincidence rates of the established detection method and another similar method for the five pathogens in 242 clinical samples were 97.9%, 98.8%, 100%, 98.3% and 100% for PEDV, GARV, PDCoV, PTV and SADS-CoV, respectively. The Kappa values were all higher than 0.9. The method had advantage over a commercial diagnostic kit for detection of PEDV wild strains in accuracy. Detection results with clinical samples showed that positive rates of PEDV, GARV, PDCoV and PTV was 10.7% (26/242), 13.6% (33/242), 18.2% (44/242) and 14.5% (35/242), respectively, demonstrating the prevalence state of the four pathogens in Sichuan province in the years. SADS-CoV was not detectable in any areas, but the phenomenon of coinfection with different diarrhea causing viruses was common. Therefore, it was necessary to strengthen the surveillance of several porcine diarrhea viruses in Sichuan province for preventive control. 【】In this study, a one-step multiplex real-time RT-PCR was established for simultaneous detection of PEDV wild strains, PDCoV, SADS-COV and GARV, PTV multiple genotypes, which provided an efficient and sensitive tool for the differential diagnosis and epidemiological investigation of swine diarrhea disease.

one-step multiple TaqMan real-time RT-PCR; swine diarrhea related virus; differential diagnosis; cut off value

2021-09-22；

2022-01-23

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金（2020NQN29）

王一丹，E-mail：872502834@qq.com。通信作者任玉鵬，E-mail：renyupeng1986@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）