m6A甲基化酶相關(guān)基因在牛骨骼肌生成中的表達(dá)

楊昕冉，馬鑫浩，杜嘉偉，昝林森,2

m6A甲基化酶相關(guān)基因在牛骨骼肌生成中的表達(dá)

楊昕冉1，馬鑫浩1，杜嘉偉1，昝林森1,2

1西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2國(guó)家肉牛改良中心，陜西楊凌 712100

【】近年來(lái)，RNA m6A甲基化修飾在肌肉發(fā)育中的作用不斷被發(fā)現(xiàn)，通過(guò)探究m6A甲基化酶相關(guān)基因，包括，，，和，在牛肌肉組織以及骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（skeletal muscle satellite cells, SMSCs）增殖和分化過(guò)程中的表達(dá)，同時(shí)分析體外成肌分化過(guò)程中m6A甲基化水平的變化，為闡明m6A修飾在骨骼肌發(fā)育中的作用及機(jī)制提供參考?！尽渴褂脤?shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)m6A甲基化酶相關(guān)基因在新生和成年牛不同部位骨骼肌中的表達(dá)。隨后在秦川牛肉用新品系背最長(zhǎng)肌中分離SMSCs，通過(guò)生長(zhǎng)曲線、免疫熒光和RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證SMSCs的增殖和成肌分化功能，使用RT-qPCR檢測(cè)m6A甲基化酶相關(guān)基因在SMSCs增殖期24、36、48、60、72 h和分化第0、2、4、6、8天中的時(shí)序表達(dá)譜。最后利用LC-MS/MS和Dot blot技術(shù)檢測(cè)SMSCs分化過(guò)程中m6A甲基化水平的變化?！尽俊⒑偷萴6A甲基化轉(zhuǎn)移酶基因在成年牛背最長(zhǎng)肌、前腿肌和后腿肌中的表達(dá)量均顯著低于新生牛（＜0.01）。和等m6A去甲基化酶基因在成年牛后腿肌中的表達(dá)更高（＜0.01），在成年牛背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)也較高（＜0.01）。分離的SMSCs具有良好的生長(zhǎng)狀態(tài)且可正常成肌分化。在SMSCs增殖期，表達(dá)逐漸下降，但在增殖后期時(shí)明顯提高。在增殖期的表達(dá)變化差異不明顯，則在增殖48 h后表達(dá)逐漸降低。而和在增殖期的時(shí)序表達(dá)類似，60 h之前變化不顯著，但在72 h時(shí)顯著提高。在SMSCs成肌分化過(guò)程中，、和的表達(dá)模式基本一致，分化前期上升，隨后下降，在分化末期表達(dá)增加。而的表達(dá)隨分化進(jìn)行逐漸增加，則在分化前4天表達(dá)上升，隨后不斷下降。此外，在SMSCs分化過(guò)程中，mRNA的整體m6A水平下降（＜0.01）?！尽縨6A甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶在新生牛和成年牛骨骼肌中的表達(dá)變化存在較為明顯的差異，表明m6A修飾可能對(duì)秦川牛骨骼肌的發(fā)育具有重要作用。同時(shí)，這些m6A相關(guān)甲基化酶可能參與調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化。這一發(fā)現(xiàn)為研究m6A甲基化修飾調(diào)控骨骼肌生成的作用及機(jī)制提供理論依據(jù)。

m6A；m6A甲基化酶；牛；骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞；細(xì)胞增殖；成肌分化

0 引言

【研究意義】畜禽的產(chǎn)肉量和肉品質(zhì)離不開骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育及其遺傳特性。骨骼肌也是機(jī)體重要的運(yùn)動(dòng)和能量代謝組織，對(duì)于維持機(jī)體代謝平衡和穩(wěn)態(tài)起到重要作用。因此，研究骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律對(duì)于提高肉用動(dòng)物生產(chǎn)性能和開展肌肉生理病理學(xué)研究十分重要。此外，利用分子育種技術(shù)改良產(chǎn)肉性能是培育優(yōu)良肉牛品種的重要途徑，挖掘更多關(guān)鍵的分子標(biāo)記對(duì)肉牛的定向選育也具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】骨骼肌生成是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，從肌衛(wèi)星細(xì)胞激活到成肌細(xì)胞增殖最終到終末分化階段，這一過(guò)程除了受到關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控外，一些表觀遺傳如DNA甲基化、組蛋白修飾等也發(fā)揮著重要的作用[1]。而m6A(N-甲基腺嘌呤，N-methyladenosine）甲基化修飾作為近幾年的研究熱點(diǎn)，其在牛骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育中的作用及分子機(jī)制尚不清楚。作為mRNA中最常見(jiàn)的甲基化修飾，m6A主要富集在mRNA的啟動(dòng)子區(qū)、終止密碼子區(qū)以及特定motif內(nèi)。m6A甲基化修飾被證明具有可逆性，由包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3（methyltransferase 3, METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14（methyltransferase 14, METTL14）和腎細(xì)胞瘤1-結(jié)合蛋白（Wilms’ tumor 1-associating protein, WTAP）等組成甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化RNA上腺苷酸發(fā)生m6A修飾，同時(shí)脂肪量與肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity-associated protein, FTO）和Alk B同源蛋白5（AlkB homolog 5, ALKBH5）等去甲基化酶可以對(duì)已發(fā)生m6A修飾的堿基進(jìn)行去甲基化修飾[2-5]。越來(lái)越多的證據(jù)表明m6A修飾通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控RNA的穩(wěn)定性、定位、運(yùn)輸、剪切和翻譯進(jìn)而在調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)、細(xì)胞周期、胚胎干細(xì)胞重編程、個(gè)體發(fā)育等方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[6-9]。近年來(lái)，m6A在肌生成過(guò)程中的重要調(diào)控作用也逐漸被揭開。研究發(fā)現(xiàn)FTO通過(guò)發(fā)揮去m6A甲基化作用正向調(diào)控mTOR-PGC-1α信號(hào)通路調(diào)節(jié)線粒體的合成進(jìn)而促進(jìn)肌生成[10]。METTL3可以通過(guò)催化下游mRNA發(fā)生m6A修飾，進(jìn)而促進(jìn)小鼠原代成肌細(xì)胞和C2C12細(xì)胞的分化[11]。此外，已有研究報(bào)道了豬、牛、鵝等畜禽動(dòng)物肌肉組織發(fā)育及成肌細(xì)胞分化中的轉(zhuǎn)錄組m6A甲基化修飾圖譜[12-15]，揭示m6A在畜禽肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中的潛在調(diào)控作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】但m6A甲基化修飾在牛肌肉發(fā)育中的試驗(yàn)研究鮮見(jiàn)報(bào)道，同時(shí)其在體外調(diào)控肌細(xì)胞增殖與分化的功能和機(jī)制仍不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】秦川牛是我國(guó)良種黃牛的代表性品種，具有耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)細(xì)嫩、大理石花紋明顯、遺傳性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[16]，但也存在生長(zhǎng)速度較慢、后軀發(fā)育不充分、產(chǎn)肉性能有待提高等缺點(diǎn)。本研究即以秦川肉牛骨骼肌組織和骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（SMSCs）為研究對(duì)象，探究、、、和等m6A甲基化基因在秦川肉牛不同部位骨骼肌以及體外SMSCs增殖和分化過(guò)程中的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)SMSCs成肌分化過(guò)程中的m6A甲基化水平。一方面為秦川肉牛的遺傳改良和分子育種提供理論依據(jù)，另一方面從RNA甲基化這一新的表觀遺傳修飾角度研究其對(duì)骨骼肌生成的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年11月至2021年8月在西北農(nóng)林科技大學(xué)國(guó)家肉牛改良中心平臺(tái)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 組織采集和細(xì)胞分離、培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化

試驗(yàn)所用牛只為西北農(nóng)林科技大學(xué)國(guó)家肉牛改良中心良種繁育場(chǎng)培育的秦川牛肉用新品系（以下簡(jiǎn)稱“秦川肉牛”），分別選取3頭身體健康、狀態(tài)良好的新生和成年秦川肉牛（36月齡，均為母牛），分別采集其背最長(zhǎng)肌、前腿肌和后腿肌組織樣品，置于-80℃保存待用。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離于上述新生秦川肉牛的背最長(zhǎng)肌[17]。取2 g肌肉組織剪碎，在含有20 mmol·L-1中性蛋白酶、1X膠原蛋白酶II和5 mmol·L-1MgCl2的HEPES緩沖液中37℃消化30 min，加入含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）終止消化，依次過(guò)100和40 μm的細(xì)胞篩，濾液在300×、4℃下離心10 min，收集沉淀且重懸于完全培養(yǎng)基中。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%—100%密度時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每?jī)商爝M(jìn)行一次換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%密度時(shí)，將含有20%FBS和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基換成含有2%馬血清和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，誘導(dǎo)成肌分化。

1.3 RNA提取與cDNA合成

使用Trizol法提取組織和細(xì)胞中的總RNA，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA的純度和濃度，OD 260/280比值在1.8—2.0的RNA被認(rèn)為純度良好，放于-80℃保存?zhèn)溆??？俁NA的提取方法參考實(shí)驗(yàn)室之間的報(bào)道[18]。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A，Takara，大連）將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，其中去除DNA反應(yīng)體系為：依次加入2.0 μL 5X gDNA Eraser Buffer、1.0 μL gDNA Eraser、1 000 ng總RNA和RNase-free dH2O補(bǔ)足10 μL，42℃反應(yīng)2 min。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：在上述反應(yīng)液中依次加入4.0 μL 5X PrimeScript Buffer、4.0 μL RNase-free dH2O、1.0 μL RT Primer Mix和1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix，共計(jì)20 μL，37℃反應(yīng)15 min，85℃中15 s終止反應(yīng)。cDNA放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）

使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII （Tli RNase H Plus）（RR820A，Takara，大連）熒光定量試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。15 μL的反應(yīng)體系為：7.5 μL TB Green Premix Ex Taq（2X）、各0.5 μL的上下游引物、1.5 μL cDNA模板（10倍稀釋）和5.0 μL RNase-free H2O，95℃預(yù)變性30 s，95℃ 3 s、60℃ 30 s、40個(gè)循環(huán)。使用為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品均設(shè)置不少于3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用2?ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。RT-qPCR所用的引物見(jiàn)表1。

1.5 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線檢測(cè)

細(xì)胞在10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)至90%—100%密度時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將細(xì)胞接種至96孔板，在細(xì)胞生長(zhǎng)的第12、24、36、48、60、72和84小時(shí)分別加入10 μL CCK-8（C0005，TargetMOI, 美國(guó)），每次處理后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中37℃反應(yīng)2 h，將細(xì)胞取出，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm時(shí)的吸光度（OD值），每組設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。細(xì)胞培養(yǎng)期間，每2 d進(jìn)行換液。

1.6 免疫熒光

取出細(xì)胞，PBS清洗2次后，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗。加入0.2% TritonX-100通透10 min。PBS洗2遍，加入含有1%牛血清白蛋白、10% 驢血清和0.3 mol·L-1甘氨酸的PBS室溫封閉1 h。然后使用特異性一抗在4℃過(guò)夜孵育，PBS再清洗3遍后，加入對(duì)應(yīng)的二抗37℃孵育2 h。用PBS清洗后加入0.1% DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色15 min。最后清洗后加入PBS保持細(xì)胞濕潤(rùn)，即刻在熒光顯微鏡（Olympus IX71，日本）下拍照。所使用的一抗為：anti-MYOD1（ab16148, Abcam）、anti-PAX7（ab187339, Abcam）和anti-MYHC（GTX20015, GeneTex），二抗為：Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit IgG（ab150074, Abcam）和488-conjugated goat anti-mouse IgG（ab150113, Abcam）。

表1 RT-qPCR所用引物

1.7 LC-MS/MS

按照mRNA純化試劑盒PolyATtract mRNA Isolation Systems Kit（Z5300，Promega，美國(guó)）的操作指南純化總RNA，得到mRNA。將100—200 ng mRNA用含有25 mmol·L-1NaCl和2.5 mmol·L-1ZnCl2的核酸酶P1在42℃消化2 h，然后加入1 mol·L-1NH4HCO3和0.5 U堿性磷酸酶37℃消化2 h，過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)平臺(tái)為西北農(nóng)林科技大學(xué)大型儀器設(shè)備共享平臺(tái)——園藝科學(xué)研究中心，使用的儀器是Agilent 1290 Infinity II - 6470（Agilent Technology, 美國(guó)）。基于標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，進(jìn)而計(jì)算N-甲基腺苷（m6A）和腺苷酸（A）的比值。

1.8 Dot blot

將純化后的mRNA稀釋至100—200 ng·μL-1，95℃下變性3 min。在Hybond-N+膜（GE Healthcare，美國(guó)）上滴加1 μL mRNA，紫外交聯(lián)15 min。用5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入m6A特異性抗體（202003，Synaptic Systems，德國(guó)）4℃過(guò)夜孵育。然后用二抗（HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG, D110058, Sangon Biotech）室溫孵育1 h，1x TBST清洗3次后，采用化學(xué)發(fā)光法顯影。顯影后的膜用0.02%亞甲藍(lán)（0.3 mol·L-1醋酸鈉配制）染色30 min。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 7.00軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析并生成圖片。分別用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)和單/雙因素方差分析（One/Two-way ANOVA）比較兩組和多組之間的差異，以＜0.05為差異顯著，＜0.01為差異極顯著，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。

2 結(jié)果

2.1 m6A甲基化酶相關(guān)基因在秦川肉牛不同部位骨骼肌中的表達(dá)分析

為了檢測(cè)m6A甲基化酶相關(guān)基因在肉牛不同部位肌肉中的表達(dá)水平，分別采集新生牛和成年牛的背最長(zhǎng)肌、前腿肌和后腿肌組織，并提取總RNA。RT-qPCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn)m6A甲基轉(zhuǎn)移酶、和在成年牛不同部位骨骼肌中的表達(dá)量均顯著低于新生牛（圖1-A—C，＜0.05），并且在新生牛背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量明顯高于前腿肌和后腿?。▓D1-A—C，＜0.05）。m6A去甲基化酶在不同月齡牛背最長(zhǎng)肌和前腿肌中的表達(dá)無(wú)顯著差異，而在成年牛后腿肌中的表達(dá)顯著高于新生牛（圖1-D，＜0.05），同時(shí)在新生牛后腿肌中的表達(dá)最低。另一個(gè)m6A去甲基化酶在成年牛背最長(zhǎng)肌和后腿肌中的表達(dá)均顯著高于新生牛，而在前腿肌中則相反（圖1-E，＜0.01）。有意思的是，與新生牛相比，和在成年牛后腿肌中的表達(dá)有著上升的趨勢(shì)，這個(gè)結(jié)果與上述m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶、和的結(jié)果相反，說(shuō)明這5個(gè)m6A甲基化酶相關(guān)基因可能參與后腿肌的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控，且與它們發(fā)揮的m6A甲基化修飾作用一致。

2.2 秦川肉牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（SMSCs）的增殖狀態(tài)檢測(cè)

為了進(jìn)一步研究m6A甲基化酶相關(guān)基因在體外骨骼肌細(xì)胞中的表達(dá)模式，在新生牛背最長(zhǎng)肌中分離了骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（SMSCs）。從圖2-A中可以看到，將SMSCs接種到6孔板培養(yǎng)后，細(xì)胞可以正常增殖，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞密度隨時(shí)間逐漸增加。SMSCs的生長(zhǎng)曲線也基本呈現(xiàn)“S”型，從前期緩慢生長(zhǎng)到中期快速增長(zhǎng)，在72 h時(shí)細(xì)胞基本長(zhǎng)滿且達(dá)到生長(zhǎng)平臺(tái)期（圖2-B）。配對(duì)盒基因7（paired box 7，PAX7）和成肌分化因子1（myogenic differentiation 1，MYOD1）是SMSCs的標(biāo)記基因，常被用來(lái)鑒定SMSCs[19-20]。因此，為了鑒定本研究分離的細(xì)胞為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，在細(xì)胞生長(zhǎng)至48 h時(shí)，使用免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞增殖期MYOD1和PAX7的表達(dá)。如圖2-C所示，MYOD1（綠色熒光）和PAX7（紅色熒光）均有表達(dá)，而且可以明顯看出MYOD1的熒光較弱，表達(dá)較低。這些結(jié)果可以初步確定本研究分離的細(xì)胞為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，且具有正常的增殖能力。

A：秦川肉牛SMSCs增殖期不同生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)的表型觀察；B：秦川肉牛SMSCs的生長(zhǎng)曲線；C：秦川肉牛SMSCs生長(zhǎng)48 h時(shí)PAX7和MYOD1的免疫熒光檢測(cè)

2.3 秦川肉牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（SMSCs）的成肌分化鑒定

骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵在于肌細(xì)胞的分化，即成肌細(xì)胞融合形成多核肌管，進(jìn)而形成肌纖維的能力。為了驗(yàn)證本研究分離的SMSCs具有成肌分化的特性，細(xì)胞密度至90%—100%時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)成肌分化，記為第0天（D0）。誘導(dǎo)分化的結(jié)果如圖3-A所示，細(xì)胞長(zhǎng)滿后逐漸融合形成肌管，分化第2天已有較短的肌管開始出現(xiàn)，呈長(zhǎng)條狀。隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng)，肌管的長(zhǎng)度和亮度也隨之增加。分化D4和D6肌管明顯增多；但在分化晚期第8天，細(xì)胞逐漸停止融合，與D6相比，肌管數(shù)量和長(zhǎng)度并沒(méi)有明顯增加。多核肌管會(huì)特異性表達(dá)肌球重鏈蛋白（myosin heavy chain，MYHC），筆者通過(guò)免疫熒光檢測(cè)了SMSCs分化過(guò)程中肌管標(biāo)志基因MYHC的表達(dá)。如圖3-B所示，分化第2天，MYHC的熒光微弱，表達(dá)水平低，肌管形成較少；到分化第4天，MYHC蛋白熒光明顯增強(qiáng)，肌管大量出現(xiàn)；在分化第6天，可以明顯看到肌管變長(zhǎng)。隨后分別提取了SMSCs分化第0、2、4、6、8天的總RNA，對(duì)、、和等與骨骼肌成肌分化密切相關(guān)的特異性轉(zhuǎn)錄因子和成肌基因進(jìn)行了相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)和的表達(dá)在D4達(dá)到最高，隨后逐漸下降；的表達(dá)隨分化的進(jìn)行不斷增加，而的表達(dá)在分化前6 d不斷上升，在第8天的表達(dá)有所下降，這些基因的時(shí)序表達(dá)趨勢(shì)與骨骼肌成肌分化的規(guī)律基本相符（圖3-C）。這些結(jié)果表明本試驗(yàn)成功分離出了牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，且SMSCs具有正常的增殖和成肌分化能力，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

A：秦川肉牛SMSCs成肌分化第0、2、4、6、8天的表型觀察；B：秦川肉牛SMSCs成肌分化過(guò)程中MYHC的熒光檢測(cè)；C：骨骼肌生成特異性基因（MYOD1、MYOG、MYF6和MYH3）在秦川肉牛SMSCs成肌分化過(guò)程中的表達(dá)量檢測(cè)。不同的大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01），不同的小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）。下同

2.4 m6A甲基化酶相關(guān)基因在SMSCs增殖過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)譜

為了研究m6A甲基化修飾對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的潛在影響，首先對(duì)上述5個(gè)m6A甲基化酶相關(guān)基因在SMSCs增殖期的不同時(shí)間點(diǎn)（24、36、48、60和72 h）進(jìn)行了時(shí)序表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量在增殖過(guò)程中不斷降低，但在72 h細(xì)胞接近長(zhǎng)滿時(shí)顯著升高（圖4-A），說(shuō)明與SMSCs的增殖負(fù)相關(guān)，可能發(fā)揮負(fù)調(diào)控的作用。和則是在48 h前表達(dá)有所上升，而后降低，與不同的是，在72 h時(shí)表達(dá)再次上升（圖4-B和C）。去甲基化酶和在SMSCs增殖期的表達(dá)模式基本一致，前期保持穩(wěn)定表達(dá)，表達(dá)水平基本不變，而在72 h高表達(dá)（＜0.01，圖4-D和E）。結(jié)果中發(fā)現(xiàn)、、和均在細(xì)胞接近長(zhǎng)滿時(shí)的表達(dá)明顯上升，表明m6A修飾可能主要在SMSCs增殖末期發(fā)揮作用。

A：METTL3在SMSCs增殖中的時(shí)序表達(dá)譜；B：METTL14；C：WTAP；D：FTO；E：ALKBH5

2.5 m6A甲基化酶相關(guān)基因在SMSCs成肌分化過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)譜

使用RT-qPCR檢測(cè)了上述5個(gè)m6A相關(guān)酶基因在SMSCs成肌分化不同時(shí)間點(diǎn)（D0、D2、D4、D6、D8）的時(shí)序表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲基轉(zhuǎn)移酶、和的表達(dá)趨勢(shì)一致，均在分化開始后表達(dá)升高，第2天后表達(dá)降低，到分化晚期D8時(shí)又顯著增加達(dá)到最高表達(dá)水平（圖5-A—C）。但其中的表達(dá)量變化較為不明顯（圖5-C）。去甲基化酶FTO則是在分化前中期維持穩(wěn)定的表達(dá)量（＞0.05），在分化晚期D8高表達(dá)（＜0.01）（圖5-D）。有趣的是，在SMSCs增殖和分化過(guò)程中的表達(dá)模式非常相似（圖4-D和圖5-D）。而的表達(dá)在分化前期不斷增加，在D4達(dá)到高表達(dá)，隨后逐漸下降，但均較D0的水平高（圖5-E）。不管是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶還是m6A去甲基化酶均在分化前期表達(dá)增加，但m6A甲基轉(zhuǎn)移酶在分化中期的表達(dá)明顯降低，m6A去甲基化酶則基本維持了高表達(dá)，這很可能說(shuō)明了m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和m6A去甲基化酶對(duì)SMSCs的分化具有重要且相反的調(diào)控作用。

2.6 SMSCs分化過(guò)程中m6A水平分析

從以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，m6A甲基化酶相關(guān)基因在SMSCs增殖和分化過(guò)程中存在顯著變化的表達(dá)模式，表明它們可能調(diào)控骨骼肌生成。基于這些結(jié)果，筆者進(jìn)一步分析了SMSCs分化過(guò)程中（D0、D2、D4）m6A甲基化修飾水平的變化。LC-MS/MS和Dot blot的結(jié)果均顯示分化第4天的m6A水平顯著低于D0和D2（圖6）。結(jié)合m6A甲基化酶相關(guān)基因在分化過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)模式，可以推測(cè)分化后m6A水平降低可能與m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和在分化D4表達(dá)下降，以及m6A去甲基化酶和表達(dá)不斷增加的趨勢(shì)有關(guān)。同時(shí)也表明了m6A甲基化修飾可能負(fù)調(diào)控SMSCs的成肌分化。

3 討論

3.1 m6A甲基化研究進(jìn)展及其在骨骼肌發(fā)育中的研究意義

雖然m6A甲基化修飾早在20世紀(jì)70年代就被發(fā)現(xiàn)[21]，但由于檢測(cè)儀器和方法學(xué)的限制，其具體的分子功能和作用機(jī)制卻一直處于未知階段。而隨著m6A甲基化修飾動(dòng)態(tài)可逆模式的發(fā)現(xiàn)[4]和m6A-seq技術(shù)的開發(fā)[22-23]，m6A修飾發(fā)揮的生物學(xué)功能不斷被揭示，RNA甲基化修飾也成為近十年的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，m6A在多種生物學(xué)過(guò)程中的功能不斷被發(fā)現(xiàn)，包括在豬、羊、雞、鵝等畜禽動(dòng)物肌肉和脂肪生長(zhǎng)發(fā)育中的重要作用也逐漸被揭開[12-14, 24]，但其在牛體內(nèi)和體外的研究仍鮮少報(bào)道。而由于我國(guó)肉牛業(yè)起步較晚，本土的地方黃牛品種一直飽受生長(zhǎng)速度慢、產(chǎn)肉性能較國(guó)外優(yōu)良肉牛品種差距較大等因素的困擾，因此，如何提高地方黃牛的產(chǎn)肉量和肉品質(zhì)是國(guó)內(nèi)肉牛育種工作者亟待解決的共同問(wèn)題。本研究選用國(guó)內(nèi)良種黃?！卮ㄈ馀檠芯繉?duì)象，成功建立了秦川牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（SMSCs）體外培養(yǎng)和成肌分化的模型。研究m6A甲基化酶、、和m6A去甲基化酶、在秦川牛骨骼肌組織以及SMSCs增殖和分化中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诓煌瑫r(shí)期的骨骼肌組織以及體外細(xì)胞肌生成過(guò)程中的表達(dá)表現(xiàn)出不同程度的差異，暗示參與m6A修飾的這些基因可能調(diào)控牛骨骼肌生成。通過(guò)分析SMSCs成肌分化前后的m6A水平變化，進(jìn)一步表明m6A甲基化修飾可能在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮潛在的調(diào)控作用。

A：在SMSCs成肌分化中的時(shí)序表達(dá)譜；B：；C：；D：；E：

A: Temporal mRNA expression profile ofduring SMSCs myogenic differentiation; B:; C:; D:; E:

圖5 m6A甲基化酶相關(guān)基因在SMSCs成肌分化過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)譜

Fig. 5 Temporal expression profile of m6A methylation-related genes during SMSCs myogenic differentiation

A：使用LC-MS/MS檢測(cè)SMSCs成肌分化過(guò)程中m6A水平；**表示P＜0.01、差異極顯著。B：使用Dot blot技術(shù)檢測(cè)SMSCs分化過(guò)程中的m6A修飾水平，亞甲藍(lán)用于顯示mRNA的上樣量

3.2 骨骼肌組織中m6A甲基化酶相關(guān)基因的表達(dá)

為了研究m6A甲基化酶相關(guān)基因在牛骨骼肌中的表達(dá)水平，筆者檢測(cè)了其在背最長(zhǎng)肌、前腿肌和后腿肌中的表達(dá)量。可以很明顯地發(fā)現(xiàn)甲基化酶和去甲基化酶在骨骼肌中表達(dá)模式的不同，與新生牛相比，甲基化酶、和在成年牛骨骼肌中的表達(dá)明顯降低，而去甲基化酶和的表達(dá)則表現(xiàn)出上升的結(jié)果，這很好地說(shuō)明這些基因是通過(guò)其對(duì)m6A甲基化修飾的作用來(lái)影響骨骼肌發(fā)育。最新的研究發(fā)現(xiàn)、、和在雞的胸肌和腿肌中表達(dá)均隨發(fā)育時(shí)期而逐漸上升，而則是在胚胎中期高表達(dá)，到胚胎后期至出殼后表達(dá)降低[25]。另一項(xiàng)在豬脂肪組織中的研究表明，METTL3在瘦肉型長(zhǎng)白豬脂肪組織中的表達(dá)高于肥胖型金華豬，而FTO則相反[26]。這些不同的結(jié)果說(shuō)明m6A甲基化酶相關(guān)基因的表達(dá)可能具有品種和種間差異，但都能體現(xiàn)出這些基因具有參與調(diào)控肌肉發(fā)育的合理可能性，并且甲基化酶與去甲基化酶基因表達(dá)模式的差異結(jié)果在很大程度上反映了m6A修飾調(diào)控肌肉發(fā)育的潛在作用。

3.3 SMSCs增殖過(guò)程中m6A甲基化酶相關(guān)基因的表達(dá)

骨骼肌的發(fā)育離不開肌細(xì)胞的增殖、分化與再生，為了更好地探究m6A相關(guān)基因可能的作用，筆者成功分離了牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞并鑒定其具有成肌分化的能力，進(jìn)而在體外研究這5個(gè)基因在SMSCs增殖和分化中的表達(dá)，探究m6A修飾對(duì)肌生成的功能。已有研究發(fā)現(xiàn)METTL3能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的增殖[27-28]，同時(shí)促進(jìn)多種癌細(xì)胞的增殖[29-31]；METTL14同樣可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖[32]；WTAP更是被發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)影響B(tài)CL-2、CCNA2、CDK2等基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞的增殖和凋亡[33-35]，且與本研究中在牛SMSCs增殖中后期表達(dá)下降的結(jié)果一致的是，WTAP在平滑肌細(xì)胞增殖過(guò)程中表達(dá)也逐漸降低[36]；但丁浩等[25]的研究發(fā)現(xiàn)在雞原代成肌細(xì)胞增殖后期表達(dá)上升。產(chǎn)生這些不同表達(dá)趨勢(shì)的原因可能與品種差異和細(xì)胞種類、來(lái)源有關(guān)。而FTO被發(fā)現(xiàn)可以抑制白血病細(xì)胞的增殖[37]；ALKBH5可抑制干細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞的增殖[38-39]。這些研究都說(shuō)明了這5個(gè)m6A相關(guān)基因均具有調(diào)控細(xì)胞增殖的能力，其都是通過(guò)發(fā)揮它們的m6A甲基化調(diào)控功能來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)在SMSCs增殖期中先降低再升高，在細(xì)胞增殖期不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)趨勢(shì)不明顯，而和基本保持著上升的增長(zhǎng)趨勢(shì)，這些結(jié)果都與雞原代成肌細(xì)胞中的研究一致[25]。這些基因在SMSCs增殖期中表達(dá)水平的顯著變化說(shuō)明了m6A甲基化可能也參與調(diào)控SMSCs的增殖，其中具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3.4 SMSCs分化過(guò)程中m6A甲基化酶相關(guān)基因的表達(dá)和m6A甲基化水平的變化

在胚胎期，肌細(xì)胞的增殖決定了骨骼肌的發(fā)育；而出生后骨骼肌的發(fā)育則主要依賴于成肌分化形成的肌纖維的增多增大。因此，研究m6A修飾在成肌分化中的作用也尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，METTL3對(duì)骨骼肌分化具有重要的作用，但不同的研究者卻發(fā)現(xiàn)了不同的結(jié)果，KUDOU[11]發(fā)現(xiàn)siMETTL3抑制C2C12細(xì)胞成肌分化，而GHELLER[40]發(fā)現(xiàn)敲低METTL3促進(jìn)C2C12細(xì)胞的分化。本研究表明METTL3在SMSCs成肌分化過(guò)程中維持穩(wěn)定表達(dá)且在分化后期達(dá)到高表達(dá)，提示了METTL3可能促進(jìn)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化。唐中林課題組發(fā)現(xiàn)干擾METTL14后，促進(jìn)C2C12細(xì)胞的增殖，抑制C2C12分化[13]，并且最后表明了m6A修飾參與豬的骨骼肌發(fā)育調(diào)控。而筆者的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在牛SMSCs成肌分化中的表達(dá)先上升再下降最后又上升至高表達(dá)水平的差異表達(dá)模式。本研究中和的結(jié)果與其雞原代成肌細(xì)胞分化中的結(jié)果一致，但是在雞成肌細(xì)胞分化中后期低表達(dá)則與本研究中維持穩(wěn)定表達(dá)的結(jié)果不同[25]。FTO最早被發(fā)現(xiàn)是與肥胖密切相關(guān)的基因[41-42]，中科院楊運(yùn)桂課題組最早揭示FTO的m6A去甲基化作用是脂肪生成必需的，并且在其中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣且重要的現(xiàn)象，敲除FTO在抑制小鼠脂肪沉積的同時(shí)，降低了小鼠的肌肉重量[43]。隨后在小鼠體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了FTO可通過(guò)其m6A去甲基化酶的作用促進(jìn)成肌分化[10]，另外其中與本研究的結(jié)果一致的是，F(xiàn)TO在小鼠原代成肌細(xì)胞和C2C12細(xì)胞成肌分化過(guò)程中的表達(dá)增加[10]。通過(guò)這些研究，可以推測(cè)FTO促進(jìn)牛SMSCs的成肌分化。另一個(gè)m6A去甲基化酶ALKBH5被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控心肌細(xì)胞的增殖與心肌再生[44]，多個(gè)研究也發(fā)現(xiàn)了ALKBH5可以與METTL3形成相互作用的機(jī)制去調(diào)控心肌細(xì)胞命運(yùn)和成骨分化[45-46]。此外，在雞成肌細(xì)胞分化過(guò)程中和的表達(dá)趨勢(shì)與其在牛SMSCs中表達(dá)逐漸增加的結(jié)果基本一致[25]，進(jìn)一步表明這2個(gè)m6A去甲基化酶可能具有促進(jìn)牛骨骼肌分化的功能。m6A水平在成肌分化后顯著降低，這個(gè)結(jié)果也與小鼠原代成肌細(xì)胞和C2C12細(xì)胞中的研究結(jié)果一致[40]，表明m6A修飾可能負(fù)調(diào)控成肌分化。再綜合以上的研究結(jié)果，推測(cè)成肌分化中m6A水平的變化可能與、和的表達(dá)模式相關(guān)。本研究初步探究了m6A甲基化修飾在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)模式，其結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步探究m6A修飾以及甲基化酶基因?qū)ε９趋兰∩傻淖饔煤头肿訖C(jī)制研究提供數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)檢測(cè)5個(gè)經(jīng)典的m6A甲基化酶基因在新生和成年秦川肉牛不同部位骨骼肌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)m6A甲基化酶、、和m6A去甲基化酶、在牛骨骼肌中的表達(dá)模式呈現(xiàn)較為明顯的差異，在成年牛骨骼肌中m6A甲基化酶表達(dá)下降，而去甲基化酶表達(dá)上升。此外，在SMSCs增殖和分化過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)譜表明m6A甲基化酶相關(guān)基因均有著明顯的差異表達(dá)模式，同時(shí)結(jié)合筆者發(fā)現(xiàn)的SMSCs成肌分化后m6A整體水平降低的結(jié)果，共同提示了、、和在調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化中具有潛在重要作用。

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Expression Pattern of m6A Methylase-Related Genes in Bovine Skeletal Muscle Myogenesis

YANG XinRan1, MA XinHao1, DU JiaWei1, ZAN LinSen1, 2

1College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi;2National Beef Cattle Improvement Center, Yangling 712100, Shaanxi

【】 The role of RNA m6A methylation modification in muscle development has been continuously discovered in recent years. The aim of this study was to explore the mRNA expression of m6A methylases, including,,,, and, in bovine muscle tissue and in the proliferation and differentiation of skeletal muscle satellite cells (SMSCs). Meanwhile, the changes of m6A level during SMSCs myogenic differentiation in vitro were analyzed. This study could provide a reference for clarifying the role and mechanism of m6A modification in skeletal muscle development.【】 The expression of m6A methylases in skeletal muscle of newborn and adult cattle was detected by real-time quantitative PCR (RT-qPCR). Then, SMSCs were isolated from the Longissimus dorsi muscle of Qinchuan beef cattle. The proliferation and myogenic differentiation of SMSCs were verified by cell growth curve, immunofluorescence and RT-qPCR, and the temporal expression profiles of m6A methylases in proliferation (24 h, 36 h, 48 h, 60 h, and 72 h) and differentiation (Day 0, 2, 4, 6, and 8) of SMSCs were detected by RT-qPCR. Finally, the m6A levels during SMSCs differentiation were detected using LC-MS/MS and dot blot assays.【】 The mRNA expression levels of m6A methyltransferases, including,, and, in the Longissimus dorsi muscle, forelegs muscle and hind legs muscle of adult cattle were significantly lower than those of newborn cattle (＜0.01). The mRNA expression of demethylases such asand＜0.01), andwas higher in the Longissimus dorsi muscle of adult cattle (＜0.01).The isolated SMSCs had the functions of normal growth, proliferation and myogenic differentiation. The expression ofdecreased gradually in SMSCs proliferation, but increased significantly at 72 h. The expression ofdid not change significantly, whilereached the highest level at 48 h, and then decreased gradually. The temporal expression profiles ofandwere similar in the proliferative phase. They did not change obviously before 60 h and increased significantly at 72 h. The expression patterns of,andwere consistent during SMSCs differentiation, with an increase in the early stage of differentiation, followed by a decrease, and an increase in the late stage of differentiation. The expression ofincreased gradually with differentiation.The expression ofincreased during the first 4 days of differentiation and then continuously decreased. Furthermore, the overall m6A level of mRNA declined during the myogenic differentiation in SMSCs (＜0.01). 【】The expression changes of m6A methyltransferases and demethylases in skeletal muscle of newborn and adult cattle were significantly different, suggesting that m6A modification might have an important role in the development of skeletal muscle in Qinchuan cattle. Meanwhile, these m6A methylases might regulate the proliferation and differentiation of bovine SMSCs. These results provide a theoretical basis for the study of the role and molecular mechanism of m6A methylation modifications in regulating skeletal myogenesis.

N-methyladenosine (m6A); m6A methylase; cattle; skeletal muscle satellite cells; cell proliferation; myogenic differentiation

2021-09-30；

2022-04-12

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0501700）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31972994）、國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-37）

楊昕冉，E-mail：yangxinran93@nwafu.edu.cn。通信作者昝林森，E-mail：zanlinsen@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）