吉林省玉米穗腐病致病鐮孢菌的鑒定與部分菌株對殺菌劑的敏感性

柴海燕，賈嬌，白雪，孟玲敏，張偉，金嶸，吳宏斌，蘇前富

吉林省玉米穗腐病致病鐮孢菌的鑒定與部分菌株對殺菌劑的敏感性

柴海燕1,2，賈嬌2，白雪2，孟玲敏2，張偉2，金嶸1,2，吳宏斌2，蘇前富2

1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長春 130022；2吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130033

【】明確吉林省玉米穗腐病主要致病鐮孢種群分布及殺菌劑對鐮孢菌菌絲生長的抑制效果,為針對性地開展玉米鐮孢穗腐病的防治提供依據(jù)?！尽客ㄟ^組織分離法和分子生物學(xué)方法對2020年采自吉林省36個(gè)市（縣）的149份玉米穗腐病樣品進(jìn)行病原菌分離鑒定，利用禾谷鐮孢復(fù)合種（species complexFGSC）毒素合成相關(guān)基因特異性引物檢測其產(chǎn)生毒素的化學(xué)型，對部分禾谷鐮孢復(fù)合種進(jìn)行致病力測定；采用菌絲生長速率法測定7種殺菌劑對禾谷鐮孢復(fù)合種的抑制效果?！尽糠蛛x獲得233株鐮孢菌，隸屬4個(gè)鐮孢復(fù)合種，含9種鐮孢菌，包括擬輪枝鐮孢（）、布氏鐮孢（）、禾谷鐮孢（）、層出鐮孢（）、亞洲鐮孢（）、厚垣鐮孢（）、藤倉鐮孢（）、木賊鐮孢（）和亞黏團(tuán)鐮孢（），分離頻率依次為33.05%、26.18%、25.32%、12.45%、0.86%、0.86%、0.43%、0.43%和0.43%，其中禾谷鐮孢復(fù)合種分離頻率最高，為52.36%，是吉林省玉米穗腐病的優(yōu)勢致病鐮孢菌。布氏鐮孢、禾谷鐮孢和亞洲鐮孢在禾谷鐮孢復(fù)合種中的占比分別為50.00%、48.36%和1.46%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明禾谷鐮孢復(fù)合種種間、種內(nèi)遺傳多樣性均較為豐富。致病力測定結(jié)果表明52.73%的禾谷鐮孢復(fù)合種為中致病型菌株，東部玉米主產(chǎn)區(qū)分離的禾谷鐮孢致病力最強(qiáng)。毒素化學(xué)型檢測表明，亞洲鐮孢為雪腐鐮刀烯醇（NIV）化學(xué)型，禾谷鐮孢與布氏鐮孢為15-乙?；?脫氧雪腐鐮刀烯醇（15-AcDON）化學(xué)型。7種殺菌劑抑制禾谷鐮孢復(fù)合種菌絲生長的EC50介于0.02—19.45 μg·mL-1，其中咯菌腈（FS）、抑霉唑（FS）、氟硅唑（EC）、戊唑醇（TC）和腈菌唑（EW）對禾谷鐮孢復(fù)合種抑制效果較好且差異不大，EC50小于1.20 μg·mL-1，EC90小于100 μg·mL-1；30%吡唑醚菌酯抑制禾谷鐮孢和布氏鐮孢生長的EC50差異明顯，抑制禾谷鐮孢的EC50是布氏鐮孢的10.24倍?！尽考质〔煌衩桩a(chǎn)區(qū)的玉米穗腐病的優(yōu)勢致病鐮孢不同，東部和西部為禾谷鐮孢和布氏鐮孢，中部為擬輪枝鐮孢。禾谷鐮孢復(fù)合種種間、種內(nèi)遺傳多樣性均較豐富?？┚?、抑霉唑、氟硅唑、戊唑醇和腈菌唑?qū)坦如犳邚?fù)合種的抑菌效果較好且在禾谷鐮孢復(fù)合種間的藥劑敏感性差別不明顯。

玉米；穗腐病；鐮孢菌；禾谷鐮孢復(fù)合種；殺菌劑

0 引言

【研究意義】玉米（）是世界上最重要的農(nóng)作物之一，2021年國家統(tǒng)計(jì)年鑒發(fā)布我國玉米種植面積已達(dá)4 332萬公頃（索引號(hào)：410A04-0402- 202202-0006）。玉米鐮孢穗腐病是世界玉米種植區(qū)普遍發(fā)生的一類真菌性病害，近年來在吉林省發(fā)生程度呈加重趨勢。研究報(bào)道禾谷鐮孢復(fù)合種（species complex，F(xiàn)GSC）、擬輪枝鐮孢（）等是造成玉米鐮孢穗腐病發(fā)生的主要病原菌，且病原菌產(chǎn)生的嘔吐毒素、伏馬毒素、玉米赤霉烯酮等真菌毒素嚴(yán)重危害人、畜安全[1-4]。因此，明確吉林省玉米鐮孢穗腐病致病鐮孢種群及殺菌劑對鐮孢菌的抑制效果，可為監(jiān)測吉林省乃至東北地區(qū)玉米鐮孢穗腐病的發(fā)生流行和有針對性地開展該病害的防治提供科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國內(nèi)外研究鑒定出70余種引起玉米穗腐病的病原真菌[5]，這些真菌通過單獨(dú)或復(fù)合侵染玉米果穗導(dǎo)致穗腐病發(fā)生，且不同地區(qū)的病原菌組成差異極大。國外研究結(jié)果表明，在加拿大、德國、巴西、阿根廷和尼泊爾地區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種和擬輪枝鐮孢是玉米鐮孢穗腐病的優(yōu)勢病原菌，在波蘭、意大利、南非、伊朗擬輪枝鐮孢為優(yōu)勢致病菌，分離頻率達(dá) 32%—58%；美國、奧地利等地區(qū)引起玉米鐮孢穗腐病的主要致病菌是禾谷鐮孢復(fù)合種[6-16]。國內(nèi)研究學(xué)者對甘肅、廣西、黑龍江等21?。ㄗ灾螀^(qū)）的玉米穗腐病致病鐮孢進(jìn)行分離鑒定[17-28]，發(fā)現(xiàn)引起我國玉米鐮孢穗腐病的病原菌呈現(xiàn)出一定的區(qū)域性分布，總體上擬輪枝鐮孢和禾谷鐮孢復(fù)合種在我國各玉米主產(chǎn)省份均占有一定優(yōu)勢，在黑龍江、吉林、遼寧等北方地區(qū)優(yōu)勢更加明顯；尖鐮孢（）和層出鐮孢（）在全國的分布相對局限，層出鐮孢主要分布于我國中部省份，尖鐮孢主要分布于重慶市和云南省，由此可見，在我國中部和南方地區(qū)致病鐮孢種群多樣性更高，尖鐮孢、層出鐮孢等集中分布[29]。禾谷鐮孢復(fù)合種至少由禾谷鐮孢（）、蒲葦鐮孢（）、南方鐮孢（）、布氏鐮孢（）和亞洲鐮孢（）等16個(gè)種構(gòu)成[30-31]，禾谷鐮孢復(fù)合種在形態(tài)上極為相似，但其產(chǎn)毒類型及其分布區(qū)域存在巨大差異[32]。2014年，秦子惠等[32]采用延伸因子基因序列對分離到的禾谷鐮孢復(fù)合種進(jìn)行亞種鑒定，結(jié)果表明我國禾谷鐮孢復(fù)合種由禾谷鐮孢、南方鐮孢和布氏鐮孢構(gòu)成，其中南方鐮孢主要分布于南方生態(tài)區(qū)，布氏鐮孢主要分布于北方生態(tài)區(qū)。2018年，孫華等[33]鑒定結(jié)果表明春玉米區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種為禾谷鐮孢與布氏鐮孢，以布氏鐮孢為主。與此同時(shí)，科研人員探索出一系列關(guān)于玉米穗腐病的防治措施，但噴施殺菌劑仍不失為最快、最有效的防治措施，盧寶慧等[34]測定了13種殺菌劑對禾谷鐮孢菌絲生長的抑制活性，EC50介于0.11—2 202.32 μg·mL-1；郭聰聰?shù)萚35]測定了多菌靈、百菌清、吡唑醚菌酯和氰烯菌酯對禾谷鐮孢菌絲生長的抑制效果，EC50分別為0.25、2.79、5.71和0.46 μg·mL-1。【本研究切入點(diǎn)】吉林省地處世界三大黃金玉米帶之一，有“天下糧倉”的美譽(yù)，玉米播種面積高達(dá)4.27×106hm2，但受“厄爾尼諾”氣候影響，近幾年夏秋多雨現(xiàn)象普遍，易導(dǎo)致玉米鐮孢穗腐病發(fā)生，若種植感病品種則嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量和質(zhì)量，生產(chǎn)上國內(nèi)尚無相關(guān)防治玉米穗腐病的藥劑產(chǎn)品登記，因此及時(shí)監(jiān)測吉林省玉米穗腐病的病原菌種群分布情況、致病力變化及防治藥劑的篩選至關(guān)重要。【擬解決的關(guān)鍵問題】對采自吉林省36個(gè)市（縣）的149份玉米穗腐病樣品進(jìn)行分離鑒定，對部分菌株進(jìn)行致病力、毒素化學(xué)型測定和遺傳多樣性分析，明確吉林省鐮孢菌穗腐病的致病菌組成及分布情況；采用菌絲生長速率法測定氟硅唑、腈菌唑、福美雙、吡唑醚菌酯、咯菌腈、戊唑醇和抑霉唑7種殺菌劑對布氏鐮孢、禾谷鐮孢和亞洲鐮孢等主要鐮孢菌的抑制效果，為有針對性地開展玉米鐮孢穗腐病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：2020年在吉林省玉米主產(chǎn)區(qū)[36]采集149份玉米穗腐病樣品，中部玉米主產(chǎn)區(qū)97份：長春市區(qū)2份、公主嶺市33份、德惠市7份、九臺(tái)市7份、榆樹市2份、農(nóng)安縣7份、松原市區(qū)2份、扶余縣8份、舒蘭市2份、永吉縣3份、雙遼市2份、遼源市3份、東遼縣3份、東豐縣10份、梅河口市1份、前郭爾羅蒙古族自治縣3份、伊通滿族自治縣2份；東部玉米主產(chǎn)區(qū)33份：白山市區(qū)1份、撫松市2份、靖宇縣3份、延吉市1份、敦化市1份、汪清縣3份、安圖縣2份、通化市區(qū)1份、集安市1份、通化縣2份、輝南縣2份、柳河口縣3份、磐石市4份、蛟河市4份、樺甸市3份；西部玉米主產(chǎn)區(qū)19份：大安市7份、洮南市2份、長嶺縣8份、乾安縣2份。

藥劑：400 g·L-1氟硅唑EC（江門市大光明農(nóng)化新會(huì)有限公司），12.5%腈菌唑EW（山東省青島瀚生生物科技股份有限公司），80%福美雙WG（比利時(shí)特胺有限公司），30%吡唑醚菌酯SC（江西禾益化工股份有限公司），1%咯菌腈FS、97%戊唑醇TC（吉林金秋農(nóng)藥有限公司），10%抑霉唑FS（吉林省八達(dá)農(nóng)藥有限公司）。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 L；合成低營養(yǎng)瓊脂（SNA）培養(yǎng)基：KH2PO42.0 g，KNO32.0 g，KCl 1.0 g，MgSO41.0 g，F(xiàn)eSO40.002 g，F(xiàn)eCl30.002 g，MnSO40.002 g，ZnSO40.002 g，葡萄糖1.0 g，蒸餾水1 L。

試劑及常用儀器：新型植物DNA提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix（康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，江蘇）；光學(xué)顯微鏡（CXC41RF，日本OLYMPUS公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（HE-50，日本HIRAYAMA公司）；電泳儀（Power Pac HC）、PCR擴(kuò)增儀（C1000TMThermal Cycler）和凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood II）（美國BIO-RAD公司）；藍(lán)光切膠儀（生工生物工程（上海）股份有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（BPH-9162，恒科學(xué)儀器有限公司，上海）；恒溫?fù)u床（HS-2112B，上海和呈儀器制造有限公司）；超凈工作臺(tái)；血球計(jì)數(shù)板；無菌注射器。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離及形態(tài)學(xué)鑒定 參照秦子惠等[32]種子健康檢測法分離玉米穗腐病病原菌，在超凈臺(tái)中將玉米籽粒置于75%酒精溶液中消毒 30 s，無菌水沖洗3次，每次30 s，滅菌濾紙吸除多余水分后將籽粒放置在含鏈霉素的PDA平板上，每個(gè)直徑 9 cm培養(yǎng)皿中擺放10粒，每個(gè)處理3次重復(fù)。25℃黑暗條件下培養(yǎng) 2—3 d，待籽粒內(nèi)部真菌長出并形成菌落后，挑取菌絲移入 PDA 或SNA平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)；參照張昊等[37]方法進(jìn)行單孢分離，挑取PDA或SNA培養(yǎng)基培養(yǎng)的鐮孢菌菌絲置于裝有1.0 mL無菌水的離心管中，10倍梯度稀釋，血球計(jì)數(shù)板檢查，計(jì)算分生孢子濃度為10個(gè)/mL時(shí)吸取50 μL均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)至分生孢子萌發(fā)，挑取單孢菌落獲得純化的菌株，培養(yǎng)4—7 d后觀察菌落形態(tài)，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[38-39]。

1.2.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 參照王寶寶等[19]分子生物學(xué)鑒定方法，刮取純化菌株菌絲，采用新型植物 DNA提取試劑盒提取總DNA，并以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不同鐮孢菌檢測的特異性引物（表1）均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。25 μL PCR反應(yīng)體系：2×EsMasterMix（Dye）12 μL、引物R/F各1 μL、DNA模板8 μL、ddH2O 3 μL；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂凝膠電泳，根據(jù)特異目的條帶進(jìn)行鐮孢菌鑒定，沒有特異引物的鐮孢菌通過測定延伸因子（TEF-F：ATGGTAA GGARGACAAGAC/TEF-R：GGARGTACCAGTSATC ATGTT，退火溫度：53℃，擴(kuò)增片段：703 bp）基因序列進(jìn)行鑒定，并統(tǒng)計(jì)鐮孢菌比例。鐮孢菌分離頻率（%）=（不同鐮孢菌株數(shù)/鐮孢菌總數(shù)）×100。

表1 鐮孢菌的特異性鑒定引物

1.2.3 禾谷鐮孢復(fù)合種不同種的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 通過引物延伸因子基因測序分析方法，對禾谷鐮孢復(fù)合種的單孢分離物（編號(hào)：采集地+序號(hào)）進(jìn)行序列分析，從GenBank中下載標(biāo)準(zhǔn)參照菌株南方鐮孢（MG55258、MT237810、M237808）、亞洲鐮孢（AF212452、KY284937、LC546964、MW62007）、布氏鐮孢（MK896870、AF212445、HQ889141、MF133355、MT237770、MT237749）、禾谷鐮孢（MW928838、LT548510、MH572253）和擬輪枝鐮孢（MN696006）序列，利用ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對（multiple alignment），并用MEGA7.0軟件的neighbor-joining（NJ）方法進(jìn)行1 000次自檢構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 禾谷鐮孢復(fù)合種致病力測定 挑取禾谷鐮孢復(fù)合種菌絲置于裝有300 mLSNA培養(yǎng)基的錐形瓶中，黑暗條件下120 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，雙層紗布過濾培養(yǎng)物獲得2.5×105個(gè)/mL分生孢子懸浮液，備用。選用玉米品種為KX3564，于2021年在玉米灌漿期采用針刺法從玉米果穗的中部接種2 mL 2.5×105個(gè)/mL分生孢子懸浮液，每份菌株接種50穗進(jìn)行禾谷鐮孢復(fù)合種的致病力測定。調(diào)查方法參照王曉鳴《玉米田間抗性鑒定手冊》的玉米穗腐病發(fā)生調(diào)查方法，在乳熟期調(diào)查玉米穗腐病發(fā)生情況，并計(jì)算平均病情級別。平均病情級別＝Σ（病級株數(shù)×該級代表數(shù)值）/調(diào)查總株數(shù)。

1.2.5 禾谷鐮孢復(fù)合種毒素化學(xué)型檢測 選用引物Tri13P1/2：5′-CTCSACCGCATCGAAGASTCTC-3′和5′-FGAASGTCGCARGACCTTGTTTC-3′，退火溫度為58℃檢測禾谷鐮孢復(fù)合種的毒素化學(xué)型。產(chǎn)生15-AcDON化學(xué)型的菌株擴(kuò)增片段為583 bp，3-AcDON化學(xué)型的菌株擴(kuò)增片段為644 bp，NIV化學(xué)型的菌株擴(kuò)增片段為859 bp[19]，對禾谷鐮孢復(fù)合種毒素化學(xué)型進(jìn)行分子檢測。

1.2.6 不同殺菌劑對禾谷鐮孢復(fù)合種的室內(nèi)毒力測定 采用菌絲生長速率法[40]測定7種殺菌劑對禾谷鐮孢復(fù)合種禾谷鐮孢、布氏鐮孢、亞洲鐮孢的抑制作用。在菌落邊緣挑取直徑為4 mm的菌餅接種到含有不同濃度殺菌劑的PDA平板上，25℃黑暗培養(yǎng)至空白對照菌株長滿培養(yǎng)皿，每個(gè)處理3次重復(fù)，采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算公式：抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-0.4）×100。

通過DPS數(shù)據(jù)分析處理軟件，利用數(shù)量反應(yīng)生測機(jī)率值分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，建立毒力回歸方程，計(jì)算各殺菌劑EC50、EC90和相關(guān)系數(shù)等。

2 結(jié)果

2.1 吉林省玉米穗腐病致病鐮孢菌的種類及分離頻率

對2020年采集的玉米穗腐病樣品病原菌進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)造成吉林省玉米穗腐病的病原菌主要包括鐮孢菌（spp.）、黑孢霉（）、螺旋聚孢霉（）、突臍蠕孢（）、青霉（）等。單孢分離獲得233株鐮孢菌，包括擬輪枝鐮孢77株、布氏鐮孢61株、禾谷鐮孢59株、層出鐮孢29株、亞洲鐮孢2株、厚垣鐮孢（）2株、藤倉鐮孢（）1株、木賊鐮孢（）1株和亞黏團(tuán)鐮孢（）1株（分生孢子形態(tài)特征，圖1），分離頻率依次為33.05%、26.18%、25.32%、12.45%、0.86%、0.86%、0.43%、0.43%和0.43%。分離獲得的9種鐮孢菌隸屬禾谷鐮孢復(fù)合種、藤倉鐮孢復(fù)合種（species complex，F(xiàn)FSC）、厚垣鐮孢復(fù)合種（species complex，F(xiàn)CSC）、species complex（FIESC）4個(gè)鐮孢菌復(fù)合種，占比分別為52.36%、46.35%、0.86%、0.43%，禾谷鐮孢復(fù)合種為吉林省玉米主產(chǎn)區(qū)玉米穗腐優(yōu)勢致病鐮孢菌。

A：擬輪枝鐮孢F. verticillioides；B：禾谷鐮孢F. graminearum；C：厚垣鐮孢F. chlamydosporum；D：木賊鐮孢F. equiseti；E：層出鐮孢F. proliferatum；F：亞黏團(tuán)鐮孢F. subglutinans

2.2 吉林省玉米穗腐病致病鐮孢菌的分布

吉林省東部玉米主產(chǎn)區(qū)分離獲得的致病鐮孢菌為禾谷鐮孢、布氏鐮孢、擬輪枝鐮孢、層出鐮孢和厚垣鐮孢，頻率分別為33.85%、30.77%、27.69%、6.15%和1.54%；西部玉米主產(chǎn)區(qū)分離獲得布氏鐮孢、禾谷鐮孢、厚垣鐮孢和亞黏團(tuán)鐮孢4種致病鐮孢，布氏鐮孢的分離頻率最高，為54.55%；其次是禾谷鐮孢，分離頻率為36.36%，厚垣鐮孢和亞黏團(tuán)鐮孢的分布頻率相對較低，均為4.55%；除藤倉鐮孢和亞黏團(tuán)鐮孢外，其他分離獲得的鐮孢菌均在吉林省中部玉米主產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)，其中擬輪枝鐮孢的分離頻率最高，為40.41%（表2、圖2）。從主要致病鐮孢菌種類區(qū)域性分布來看，在公主嶺、東豐、農(nóng)安、遼源市區(qū)、撫松和柳河均分離獲得禾谷鐮孢、布氏鐮孢和擬輪枝鐮孢，在磐石和榆樹分離到布氏鐮孢、擬輪枝鐮孢和層出鐮孢；在東遼和通化縣分離到禾谷鐮孢、擬輪枝鐮孢和層出鐮孢。從不同地區(qū)病原菌的種類來看，公主嶺分離得到的鐮孢菌種類最多，分離得到7種鐮孢菌，東豐、磐石和長嶺3個(gè)市（縣），分離到4種鐮孢菌，農(nóng)安、遼源市區(qū)、撫松、柳河、德惠、榆樹、東遼和通化縣8個(gè)市（縣）分離到3種鐮孢菌，其他地區(qū)分離病原菌的種類較少。結(jié)果表明，吉林省東部和西部玉米主產(chǎn)區(qū)玉米穗腐病的優(yōu)勢病原菌為禾谷鐮孢復(fù)合種中的禾谷鐮孢和布氏鐮孢，中部地區(qū)為擬輪枝鐮孢；吉林省3個(gè)區(qū)域玉米產(chǎn)區(qū)的鐮孢菌種類均較復(fù)雜。

M：DNA Marker，DL2000；1—8：禾谷鐮孢復(fù)合種F. graminearum species complex；9—11：層出鐮孢 F. proliferatum；12—14：擬輪枝鐮孢 F. verticillioides；15：木賊鐮孢F. equiseti；16：亞黏團(tuán)鐮孢F. subglutinans

表2 吉林省不同玉米主產(chǎn)區(qū)鐮孢菌的分離頻率

2.3 禾谷鐮孢復(fù)合種獨(dú)立種的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

根據(jù)禾谷鐮孢復(fù)合種延伸因子的測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，吉林省禾谷鐮孢復(fù)合種可分為3大類群，其中布氏鐮孢和禾谷鐮孢在吉林省東、中、西玉米產(chǎn)區(qū)均有分布，占比分別為50.00%和48.36%；僅在吉林省中部玉米產(chǎn)區(qū)分離獲得亞洲鐮孢，占比為1.46%。吉林省東、中、西部玉米產(chǎn)區(qū)禾谷鐮孢與布氏鐮孢的比例存在明顯差異，東部與西部地區(qū)的比例接近1﹕1，而西部地區(qū)比例為3﹕5。從樹形圖來看，鐮孢菌種內(nèi)部存在小的分支，其中布氏鐮孢種內(nèi)的自展值介于18—73、禾谷鐮孢種內(nèi)的自展值介于2—83、亞洲鐮孢種內(nèi)自展值為67。同一地區(qū)的菌株大部分聚在相鄰的分支上，但農(nóng)安縣分離的禾谷鐮孢菌株NAXKJ-1與NAXKJ-2在不同分支，部分采自不同地區(qū)的菌株聚在相鄰的分支上，表明禾谷鐮孢復(fù)合種種間、種內(nèi)遺傳多樣性均較豐富，不同地區(qū)間的菌株存在頻繁的基因交流（圖3）。

2.4 禾谷鐮孢復(fù)合種致病力測定與毒素化學(xué)型檢測

參照王曉鳴《玉米田間抗性鑒定手冊》將55株禾谷鐮孢復(fù)合種的致病力測定結(jié)果分為5種致病類型，分別為強(qiáng)致病型（HV）、次強(qiáng)致病型（SH）、中致病型（MV）、次弱致病型（SL）和弱致病型（LV）。禾谷鐮孢造成玉米穗腐病的平均病情級別從東至西逐漸降低，平均病情級別分別為5.23、4.47和3.73；中部玉米主產(chǎn)區(qū)分離的布氏鐮孢在吉林省分離的布氏鐮孢中致病力最強(qiáng)，平均病情級別為4.48，東部和西部玉米產(chǎn)區(qū)的相近，分別為3.42和3.29；中部玉米主產(chǎn)區(qū)分離的亞洲鐮孢造成玉米穗腐病的平均病情級別為3.47。東部玉米主產(chǎn)區(qū)分離的禾谷鐮孢在吉林省禾谷鐮孢復(fù)合種中致病力最強(qiáng)；中部和西部玉米主產(chǎn)區(qū)分離的禾谷鐮孢和布氏鐮孢造成玉米穗腐病的平均病情級別相近。禾谷鐮孢復(fù)合種中強(qiáng)致病型、次強(qiáng)致病型、中致病型、次弱致病型和弱致病型占比分別為1.82%、20.00%、52.73%、25.45%和1.82%。通過禾谷鐮孢復(fù)合種產(chǎn)毒關(guān)鍵基因特異性引物檢測122株禾谷鐮孢復(fù)合種的毒素化學(xué)型，發(fā)現(xiàn)61株布氏鐮孢和59株禾谷鐮孢產(chǎn)生15-AcDON毒素；2株亞洲鐮孢產(chǎn)生 NIV毒素。產(chǎn)15-AcDON和NIV菌株的平均病情級別分別為4.34和3.47。結(jié)果表明，禾谷鐮孢復(fù)合種中禾谷鐮孢造成玉米穗腐病的致病力最強(qiáng)，且東部玉米主產(chǎn)區(qū)的禾谷鐮孢致病力在3個(gè)玉米主產(chǎn)區(qū)中最強(qiáng)，吉林省造成玉米穗腐病的禾谷鐮孢復(fù)合種的致病強(qiáng)度呈正態(tài)分布。吉林省禾谷鐮孢復(fù)合種中禾谷鐮孢與布氏鐮孢僅產(chǎn)15-AcDON，亞洲鐮孢僅產(chǎn)NIV，產(chǎn)15-AcDON的菌株平均病情級別高于產(chǎn)NIV的菌株（表3、表4、圖4）。

圖3 基于TEF-1α基因序列構(gòu)建部分禾谷鐮孢復(fù)合種菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 禾谷鐮孢復(fù)合種引起的穗腐病平均病情級別

M：DNA Marker，DL2000；1、3—5、9—11、13—16：禾谷鐮孢F. graminearum；2、6—8：布氏鐮孢F. boothii；12：亞洲鐮孢F. asiaticum

表4 禾谷鐮孢復(fù)合種致病力與毒素化學(xué)型分析

續(xù)表4 Continued table 4

F. g=F. graminearum, F. b=F. boothii, F. a=F. asiaticum

2.5 7種殺菌劑對禾谷鐮孢復(fù)合種的室內(nèi)毒力

7種殺菌劑對禾谷鐮孢、亞洲鐮孢、布氏鐮孢均有不同程度的抑制效果，EC50介于0.02—19.45 μg·mL-1，EC90介于0.27—3 434 875.02 μg·mL-1。1%咯菌腈、10%抑霉唑、400 g·l-1氟硅唑、97%戊唑醇和12.5%腈菌唑?qū)坦如犳?、亞洲鐮孢和布氏鐮孢菌抑制效果較好且差別不大，EC50均＜1.20 μg·mL-1，三者相差倍數(shù)介于1—2.78；EC90＜100 μg·mL-1，相差倍數(shù)介于1.06—2.41。80%福美雙和30%吡唑醚菌酯對禾谷鐮孢、亞洲鐮孢和布氏鐮孢的抑制效果相對較差，30%吡唑醚菌抑制禾谷鐮孢復(fù)合種生長的EC50、EC90差異比較明顯，禾谷鐮孢的EC50是亞洲鐮孢的1.65倍；禾谷鐮孢和亞洲鐮孢EC50分別為與布氏鐮孢的10.24和6.22倍；EC90相差倍數(shù)介于1.44—7.29；80%福美雙抑制禾谷鐮孢復(fù)合種生長的EC50差別不大，相差倍數(shù)介于1.23— 1.77；EC90差別較大，相差倍數(shù)介于2.96—12.01（表5）。

表5 7種殺菌劑對禾谷鐮孢復(fù)合種的室內(nèi)毒力測定

F. g=F. graminearum, F. b=F. boothii, F. a=F. asiaticum

3 討論

3.1 吉林省玉米穗腐病的鐮孢菌種類及優(yōu)勢致病鐮孢

目前報(bào)道造成吉林省玉米穗腐病的致病鐮孢菌主要有禾谷鐮孢、擬輪枝鐮孢、層出鐮孢、半裸鐮孢（）、尖鐮孢、克魯克威爾鐮孢（）、彎角鐮孢（）、溫和鐮孢（）等[33,41]。本研究在2020年的玉米穗腐病樣品中檢測到禾谷鐮孢、布氏鐮孢、亞洲鐮孢、擬輪枝鐮孢、層出鐮孢、厚垣鐮孢、藤倉鐮孢、木賊鐮孢、亞黏團(tuán)鐮孢，與前人研究結(jié)果略有不同，推測不同年份間造成玉米穗腐病的致病鐮孢菌種類存在差異。不同學(xué)者報(bào)道吉林省玉米穗腐病的優(yōu)勢致病鐮孢不一致，禾谷鐮孢復(fù)合種的種類也存在差異。秦子惠等研究發(fā)現(xiàn)造成吉林省玉米穗腐病的優(yōu)勢致病鐮孢為擬輪枝鐮孢[32,42]，禾谷鐮孢復(fù)合種為布氏鐮孢；張婷等[41]研究發(fā)現(xiàn)造成吉林省玉米穗腐病的優(yōu)勢致病鐮孢為半裸鐮孢；孫華等[33]研究發(fā)現(xiàn)吉林省玉米穗腐病主要致病菌為禾谷鐮孢復(fù)合種，由禾谷鐮孢和布氏鐮孢組成，且以布氏鐮孢為主。本研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢復(fù)合種是吉林省玉米穗腐病的優(yōu)勢病原菌，分離頻率為52.36%，以擬輪枝鐮孢為代表的藤倉鐮孢復(fù)合種分離頻率僅次于禾谷鐮孢復(fù)合種，為46.35%；禾谷鐮孢復(fù)合種由禾谷鐮孢、亞洲鐮孢和布氏鐮孢組成，布氏鐮孢分離頻率最高，優(yōu)勢致病菌與孫華等研究結(jié)果一致。通過病原菌的區(qū)域分布分析，本研究發(fā)現(xiàn)吉林省東部、中部和西部造成玉米穗腐病的優(yōu)勢致病鐮孢菌存在差異，東部玉米主產(chǎn)區(qū)優(yōu)勢致病鐮孢為禾谷鐮孢復(fù)合種中的禾谷鐮孢，中部為擬輪枝鐮孢，西部主要為布氏鐮孢。不同玉米主產(chǎn)區(qū)鐮孢菌的分離頻率及鐮孢菌種類存在一定的差異性，SHANG等[43]研究發(fā)現(xiàn)貴州省玉米穗腐病優(yōu)勢致病鐮孢菌為南方鐮孢，禾谷鐮孢復(fù)合種由禾谷鐮孢、布氏鐮孢、亞洲鐮孢和南方鐮孢組成，南方鐮孢的分離頻率最高；杜青等[18]研究表明廣西地區(qū)玉米穗腐病的優(yōu)勢鐮孢菌為擬輪枝鐮孢，禾谷鐮孢復(fù)合種主要為南方鐮孢；王寶寶等[19]研究發(fā)現(xiàn)黑龍江地區(qū)導(dǎo)致玉米穗腐病的鐮孢菌主要為禾谷鐮孢復(fù)合種與擬輪枝鐮孢，禾谷鐮孢復(fù)合種主要由禾谷鐮孢、布氏鐮孢、亞洲鐮孢組成，本研究結(jié)果與其研究結(jié)論一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了南方鐮孢主要分布在南方較溫暖的地區(qū)。

3.2 吉林省禾谷鐮孢復(fù)合種種間、種內(nèi)遺傳多樣性均較豐富

鐮孢菌在其管家基因上存在一些差異，基于這些基因的分子鑒定已被廣泛用于進(jìn)一步鑒定鐮孢菌的種類。DNA序列，如翻譯延伸因子（）、-微管蛋白（）、鈣調(diào)素（CAM）、線粒體小亞單位rDNA（mtSSU）、28S rDNA和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）區(qū)域，廣泛用于系統(tǒng)發(fā)育分析，以評估鐮孢菌物種的遺傳關(guān)系[43-44]。其中基因序列可以較好地體現(xiàn)鐮孢菌種之間的關(guān)系，并已成為鐮孢菌種鑒定的重要工具[25,45]。馬紅霞等[46]利用基因序列對禾谷鐮孢復(fù)合種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮孢菌種間、種內(nèi)遺傳多樣性均較豐富。相同地理來源的菌株有較近的親緣關(guān)系，不同地理來源的菌株存在較頻繁的基因交流與交換，本研究通過序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹獲得的結(jié)果與前人研究結(jié)論相吻合，為驗(yàn)證隨著人們農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)多元化致病菌間的基因交流會(huì)愈加頻繁，遺傳多樣性水平也會(huì)因此上升提供了佐證[47]。

3.3 吉林省禾谷鐮孢復(fù)合種的致病強(qiáng)度呈正態(tài)分布，毒素化學(xué)型主要為15-AcDON

李曉鴦[48]研究表明禾谷鐮孢復(fù)合種的致病力差異與其地理來源無相關(guān)性。本研究對禾谷鐮孢復(fù)合種進(jìn)行致病力測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同致病力類型菌株在吉林省3個(gè)玉米主產(chǎn)區(qū)均有分布。王寶寶等[47]研究表明禾谷鐮孢復(fù)合種致病力在中國由北向南逐漸減弱，種間致病力存在一定差異，禾谷鐮孢致病力最強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)吉林省禾谷鐮孢復(fù)合種中致病型占比最高，且東部玉米產(chǎn)區(qū)分離的禾谷鐮孢致病力最強(qiáng)。吉林省禾谷鐮孢復(fù)合種毒素化學(xué)型研究結(jié)果與近年前人的研究結(jié)論存在一定差異性。王寶寶等研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢與布氏鐮孢含15-AcDON、3-AcDON、NIV 3種毒素類型，大部分菌株產(chǎn)生3種毒素化學(xué)型中的其中一種，少部分菌株同時(shí)產(chǎn)2種或3種；亞洲鐮孢產(chǎn)NIV和3-AcDON，總體上以產(chǎn)15-AcDON和3-AcDON為主導(dǎo)，15-AcDON最多[19,49]。本研究發(fā)現(xiàn)，吉林省禾谷鐮孢復(fù)合種毒素化學(xué)型存在種的特異性，禾谷鐮孢和布氏鐮孢僅產(chǎn)15-AcDON，亞洲鐮孢產(chǎn)NIV，與王寶寶等研究結(jié)論相吻合[47,49]。

3.4 禾谷鐮孢復(fù)合種對不同殺菌劑的敏感性差異不顯著

由于不同禾谷鐮孢復(fù)合種致病力存在明顯差異，推測藥劑敏感性可能也存在差異，因此選用殺菌劑研究其對不同禾谷鐮孢復(fù)合種的抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)咯菌腈、抑霉唑、氟硅唑、戊唑醇和腈菌唑抑制禾谷鐮孢復(fù)合種菌絲生長的EC50在0.02—1.16 μg·mL-1，不同禾谷鐮孢復(fù)合種之間的藥劑敏感性差異較小。盧寶慧等[34]研究報(bào)道吡唑醚菌酯對禾谷鐮孢有一定的抑制效果，EC50為17.09 μg·mL-1，本研究發(fā)現(xiàn)吡唑醚菌酯抑制禾谷鐮孢菌絲生長的EC50為19.45 μg·mL-1，與盧寶慧報(bào)道的結(jié)果相近。郭聰聰?shù)萚35]和汪錕[50]研究發(fā)現(xiàn)吡唑醚菌酯抑制禾谷鐮孢菌絲生長的EC50分別為0.989和2.186 μg·mL-1，而本研究發(fā)現(xiàn)30%吡唑醚菌酯對禾谷鐮孢和亞洲鐮孢抑制效果相對較差，EC50分別為19.45和11.81 μg·mL-1，抑制布氏鐮孢的EC50為1.90 μg·mL-1，推測不同地區(qū)分離的禾谷鐮孢對吡唑醚菌酯的敏感性存在明顯差異，同一藥劑對不同的禾谷鐮孢復(fù)合種的毒力也存在明顯差異。本試驗(yàn)僅在室內(nèi)測定了不同禾谷鐮孢復(fù)合種對化學(xué)殺菌劑的敏感性，尚需進(jìn)一步的田間藥效驗(yàn)證，篩選出防治玉米鐮孢穗腐病的最佳殺菌劑。

4 結(jié)論

吉林省玉米穗腐病優(yōu)勢致病鐮孢菌為禾谷鐮孢復(fù)合種和擬輪枝鐮孢，禾谷鐮孢復(fù)合種由禾谷鐮孢、布氏鐮孢和亞洲鐮孢構(gòu)成，以禾谷鐮孢和布氏鐮孢為主。東部玉米主產(chǎn)區(qū)分離得到的禾谷鐮孢致病力最強(qiáng)。禾谷鐮孢復(fù)合種以產(chǎn)15-AcDON毒素類型為主，且其對同一種殺菌劑的敏感性差異不大。

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Identification of pathogenicspp. causing maize ear rot and susceptibility of some strains to fungicides in Jilin Province

1College of Plant Protection, Jilin Agricultural University, Changchun 130022;2Institute of Plant Protection, Jilin Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Crop Pest Management in Northeast China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Changchun 130033

【】The objective of this study is to clarify the population distribution ofspp. of maize ear rot in Jilin Province and the inhibitory effect of fungicides on the growth ofmycelium, and to provide a basis for the targeted control of maize ear rot.【】149 samples of maize ear rot collected from 36 cities and counties in Jilin Province in 2020 were isolated and identified by tissue isolation and molecular biology methods. The specific toxin synthesis primers of related genes were synthesized usingspecies complex (FGSC) toxin. The toxigenic chemotypes were detected, and the pathogenicity of someFGSC was determined. The inhibitory effect of 7 fungicides on FGSC was determined by the mycelial growth rate method.【】A total of 233strains were isolated, belonging to 4complex species, including 9species, which were,,,,,,,and. the isolation frequencies were 33.05%, 26.18%, 25.32%, 12.45%, 0.86%, 0.86%, 0.43%, 0.43% and 0.43%, respectively. The isolate frequency of FGSC was the highest, which was 52.36%, and it was the dominant pathogen ofmaize ear rot in Jilin Province. The proportions of,andin FGSC were 50.00%, 48.36% and 1.46%, respectively. The phylogenetic tree showed that the interspecific and intraspecific genetic diversity of FGSC was rich. The results of pathogenicity assay showed that 52.73% of FGSC were medium pathogenic strains.isolated from the main maize producing areas in the east had the strongest pathogenicity. toxigenic chemotype detection showed thatproducednivalenol (NIV) chemotype,andproduced 15-acetyl-deoxynivalenol (15-AcDON) chemotype. The EC50of the 7 fungicides for inhibiting the growth of FGSC ranged from 0.02 to 19.45 μg·mL-1. Fludioxonil (FS), imazalil (FS), flusilazole (EC), tebuconazole (TC) and myclobutanil (EW) had good inhibitory effects on FGSC and the difference was not significant. The EC50of FGSC was less than 1.20 μg·mL-1and EC90was less than 100 μg·mL-1. The difference of EC50betweenandwas significant under 30% pyraclostrobin treatment. the EC50ofwas 10.24 times higher than that of【】The dominant pathogenicof maize ear rot in different maize producing areas of Jilin Province is different.andare dominant species in the east and west, andisdominant species in the middle. The interspecific and intraspecific genetic diversity of FGSC is rich. Fludioxonil, imazalil, flusilazole, tebuconazole and myclobutanil have better antifungal effect on FGSC. there is no significant difference in the fungicides susceptibility among FGSC.

maize; ear rot;spp.;species complex (FGSC); fungicide

2022-07-21；

2022-09-06

吉林省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（20210202121NC）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-02）

柴海燕，E-mail：3222181805@qq.com。通信作者蘇前富，E-mail：qianfusu@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）