肉中豬源性成分Real-time PCR定量檢測技術(shù)

翟曉虎，李翎旭，陳小竹，蔣懷德，賀衛(wèi)華，姚大偉

肉中豬源性成分Real-time PCR定量檢測技術(shù)

1江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095

【】建立一種快速、準(zhǔn)確的肉中豬源性成分定量檢測方法?！尽渴紫葟腉enBank數(shù)據(jù)庫中篩選豬特異性的微衛(wèi)星DNA，根據(jù)微衛(wèi)星DNA核酸序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)常見10種動(dòng)物基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過有無擴(kuò)增產(chǎn)物判斷篩選的微衛(wèi)星DNA對(duì)豬源性成分的特異性。然后根據(jù)微衛(wèi)星DNA核酸序列，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立豬源性成分Real-time PCR檢測方法，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線分別對(duì)豬源性成分和總動(dòng)物源性成分進(jìn)行定量，計(jì)算豬源性成分的百分含量?！尽亢Y選到豬特異性微衛(wèi)星DNA（Accession EF172428），根據(jù)其序列設(shè)計(jì)的引物SEQ-sus2-F/R只能從豬基因組DNA中擴(kuò)增出目的條帶，其他動(dòng)物的基因組均無目的條帶擴(kuò)增。建立的Real-time PCR檢測方法靈敏度為0.02 ng/25 μL反應(yīng)體系。該方法能夠準(zhǔn)確檢測出混合DNA樣品中豬源性成分和混合肉樣品中豬源性成分，百分誤差分別約為1.32%和1.06%—7.12%?！尽勘狙芯坷肦eal-time PCR技術(shù)建立的定量豬源性成分的檢測方法可以用來檢測豬源性成分在混合樣品中的百分含量。

肉；豬；動(dòng)物源性成分；Real-time PCR；定量

0 引言

【研究意義】動(dòng)物源性商品廣泛分布于食品、藥品、保健品、化妝品、飼料和服飾等各種產(chǎn)品中。在動(dòng)物源性商品的消費(fèi)過程中經(jīng)常會(huì)遇到不法商家為追逐經(jīng)濟(jì)利益在食品加工過程中對(duì)動(dòng)物源性原料以次充好、摻雜使假等欺詐甚至違法行為。此外，動(dòng)物源性商品還涉及一些民族的宗教信仰問題（如在清真食品中摻入豬肉）。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確的動(dòng)物源性成分鑒別方法對(duì)于提高動(dòng)物源性食品安全監(jiān)管水平，確保食品質(zhì)量安全具有積極的作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，動(dòng)物源性成分鑒別主要根據(jù)不同物種之間基因的差異，設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR檢測。線粒體DNA具有較好的物種特異性、多拷貝性，在加工過程中不完全降解，成為動(dòng)物源性成分鑒別的首選靶基因[1-3]。然而由于不同物種、不同組織中線粒體數(shù)量各有差異[4]，在Real-time PCR定量檢測時(shí)檢測結(jié)果的Ct值與線粒體數(shù)量、動(dòng)物組織的質(zhì)量沒有明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系，因此，以線粒體DNA作為靶基因進(jìn)行定量檢測會(huì)造成偏差，失去定量意義[5]。基因組DNA在每個(gè)細(xì)胞中的數(shù)量恒定，采用基因組DNA中特異的單拷貝基因建立Real-time PCR檢測方法可以實(shí)現(xiàn)動(dòng)物源性成分的定量檢測[6]。然而，目前可利用的具有物種差異性的靶基因較少，常用的單拷貝基因有生長激素基因、復(fù)制蛋白A1基因、轉(zhuǎn)化生長因子等[5,7-8]，仍無法滿足多種動(dòng)物源性成分的檢測需要?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】篩選高保守性、拷貝數(shù)恒定、低降解程度的目標(biāo)基因來設(shè)計(jì)物種特異性引物和探針，將是動(dòng)物源性成分Real-time PCR定量檢測技術(shù)面臨的首要問題。微衛(wèi)星DNA大量存在于動(dòng)物基因組中，其側(cè)翼序列保守，在組織中的拷貝數(shù)恒定，片段較短，盡管樣品降解仍能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這些特點(diǎn)非常適合作為Real-time PCR定量檢測的靶基因[9-10]。【擬解決的關(guān)鍵問題】在篩選豬特異性微衛(wèi)星DNA的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物和探針，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立Real-time PCR定量方法，從而實(shí)現(xiàn)豬源性成分的定量檢測。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院臨床應(yīng)用分子生物學(xué)研究室進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

1.1.1 生鮮肉樣 隨機(jī)采購南京市各大超市、集貿(mào)市場生鮮豬肉樣品（n=24），牛肉樣品（n=24），羊肉樣品（n=24），雞肉樣品（n=24），鴨肉樣品（n=6），鵝肉（n=6），兔肉（n=6），驢肉（n=2），馬肉（n=2），鹿肉（n=3），置于含有冰塊的泡沫箱中保存，立即帶回實(shí)驗(yàn)室-20℃保存，用于基因組DNA提取。

1.1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶、蛋白酶K、DL2000 DNA marker等購自天根生化科技（北京）有限公司；Rox Reference Dye Ⅱ、Premix Ex Taq購自寶生物工程（大連）有限公司；裂解液（10 mmol·L-1Tris-Cl，pH 8.0；20 mmol·L-1EDTA，pH 8.0；0.5% SDS）；TE（10 mmol·L-1Tris-Cl，pH 8.0；1 mmol·L-1EDTA，pH 8.0）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用蛋白酶K消化和苯酚抽提的方法提取高分子質(zhì)量DNA[11]。稱取每種動(dòng)物生鮮肉樣0.3 g置于5 mL離心管中，用眼科剪剪碎成約1 mm大小，加入10倍體積（m/V）的裂解液，用IKA T 25數(shù)顯型分散機(jī)均質(zhì)。取400 μL均質(zhì)液于新的離心管中，37℃溫育1 h。加入2 μL 20 mg·mL-1的蛋白酶K，置于55℃水浴中消化3 h。加入等體積的Tris平衡酚，振蕩混勻，12 000 r/min離心5 min。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.2倍體積10 mol·L-1醋酸銨和2倍體積的無水乙醇，上下顛倒混勻，12 000 r/min離心5 min，收集沉淀，用70%的乙醇洗滌DNA沉淀1次，加入TE溶解DNA，用Nanodrop測定DNA濃度，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 在NCBI中查找豬的微衛(wèi)星DNA，進(jìn)行Blast比較分析，篩選種內(nèi)通用、種間特異的微衛(wèi)星DNA。采用Primer Premier 5.0軟件根據(jù)選擇的微衛(wèi)星DNA序列設(shè)計(jì)豬特異性引物SEQ-sus1-F/R、SEQ-sus2-F/R（表1）。根據(jù)PCR特異性鑒定結(jié)果，采用Beacon designer 7軟件重新設(shè)計(jì)引物和探針SEQ-sus2-probe-F/R、Sus-Taqman-probe（表1），另外根據(jù)脊椎動(dòng)物保守序列設(shè)計(jì)動(dòng)物通用的引物和探針SEQ-common296-F/R、Common-Taqman-probe（表1），引物和探針均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2.3 PCR檢測引物的特異性 引物的特異性采用PCR凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，用設(shè)計(jì)好的引物以各種動(dòng)物的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR檢測，設(shè)置無模板陰性對(duì)照（NTC）。25 μL PCR反應(yīng)體系：模板（200 ng·μL-1）1 μL，上、下游引物（2 μmol·L-1）各2.5 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）2 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL，Taq（5 U·μL-1）0.3 μL，補(bǔ)水至25 μL。采用降落PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃，3 min；變性94℃，15 s；退火65℃，15 s，每個(gè)循環(huán)降1℃；延伸72℃，30 s；10個(gè)循環(huán)。變性94℃，15 s；退火55℃，15 s；延伸72℃，30 s；25個(gè)循環(huán)。最后延伸72℃，5 min。PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳（內(nèi)含Goldview 30 μL·L-1）進(jìn)行檢測，恒壓120 V，電泳約30 min，置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)拍照觀察。

表1 引物、探針信息

1.2.4 引物和探針的特異性驗(yàn)證 用設(shè)計(jì)好的引物和探針以各種動(dòng)物的基因組DNA為模板進(jìn)行Real- time PCR檢測，設(shè)置無模板陰性對(duì)照（NTC）。25 μL反應(yīng)體系：模板（200 ng·μL-1）2.5 μL，上、下游引物（2 μmol·L-1）各2.5 μL，探針（2 μmol·L-1）2.5 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.5 μL，Premix Ex Taq（2×）12.5 μL，補(bǔ)水至25 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃，30 s；變性95℃，5 s；退火60℃，34 s；重復(fù)40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 Real-time PCR退火溫度的優(yōu)化 采用連續(xù)10倍稀釋的豬基因組DNA作為模板（200、20、2和0.2 ng·μL-1）對(duì)退火溫度（61.5、60、58.5、57和55℃）進(jìn)行優(yōu)化。比較各試驗(yàn)條件下的擴(kuò)增效率、決定系數(shù)、最小Ct值（Ctmin）、非特異性擴(kuò)增的Ct值、空白對(duì)照的Ct值等，篩選最佳的退火溫度。

1.2.6 Real-time PCR引物和探針濃度的優(yōu)化 采用連續(xù)10倍稀釋的豬基因組DNA作為模板（200、20和2 ng·μL-1）對(duì)引物濃度（150、250和350 nmol·L-1）和探針濃度（150、200和250 nmol·L-1）進(jìn)行優(yōu)化。比較各試驗(yàn)條件下的擴(kuò)增效率、決定系數(shù)、最小Ct值（Ctmin）、非特異性擴(kuò)增的Ct值、空白對(duì)照的Ct值等，篩選最佳的引物和探針濃度。

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及混合樣品中豬源性成分檢測方法 基因組DNA提取方法同1.2.1，測定DNA的濃度，將DNA連續(xù)10倍稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品，以每個(gè)反應(yīng)中DNA質(zhì)量的常用對(duì)數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)，以Ct值作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。豬源性成分檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程s= ks·s+bs。s：以豬特異性引物進(jìn)行Real-time PCR測定的Ct值；s：豬源性成分質(zhì)量的常用對(duì)數(shù)；ks：以豬源性成分檢測建立的回歸方程的斜率；bs：以豬源性成分檢測建立的回歸方程的截距。樣品總動(dòng)物源性成分檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：T= kT·T+bT。T：以動(dòng)物通用引物進(jìn)行Real-time PCR測定的Ct值；T：總動(dòng)物源性成分質(zhì)量的常用對(duì)數(shù)；kT：以總動(dòng)物源性成分檢測建立的回歸方程的斜率；bT：以總動(dòng)物源性成分檢測建立的回歸方程的截距?；旌蠘悠分胸i源性成分的含量（%）=10S/10T×100= 10（XS-XT）×100。

1.2.8 混合樣品制備及豬源性成分含量檢測 混合DNA樣品制備，提取豬、牛、雞基因組DNA，測定DNA濃度，然后按照質(zhì)量1﹕1﹕1比例混合，按照上述方法，測定混合DNA樣品中豬源性成分的含量。另外稱取一定質(zhì)量的豬肉和牛肉制備成混合肉樣品，檢測者在不知道豬肉比例的情況下，提取樣品中的DNA，采用上述方法檢測豬肉DNA在總DNA中的比例。

2 結(jié)果

2.1 豬特異性微衛(wèi)星DNA篩選

豬的引物SEQ-sus1-F/R PCR特異性檢測結(jié)果如圖1所示，該引物對(duì)除了在豬的模板中擴(kuò)增出目的條帶外，在鴨、兔和驢的模板中也有擴(kuò)增條帶，說明該引物對(duì)豬的特異性不高。

豬的引物SEQ-sus2-F/R PCR特異性檢測結(jié)果如圖2所示，只有豬的模板中擴(kuò)增出了約262 bp的目的片段，牛、羊、雞、鴨、鵝、兔、驢、馬和鹿的模板沒有擴(kuò)增出條帶，說明該微衛(wèi)星DNA只在豬基因組中存在，對(duì)豬具有特異性，根據(jù)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物SEQ-sus2-F/R可以特異地檢測出豬源性成分。

1：DNA Marker；2：豬；3：牛；4：羊；5：雞；6：鴨；7：鵝；8：兔；9：驢；10：馬；11：鹿；12：空白對(duì)照。下同

2.2 豬源性成分Real-time PCR檢測

2.2.1 引物和探針特異性檢測 采用引物SEQ-sus2- probe-F/R和探針Sus-Taqman-probe對(duì)相同濃度不同動(dòng)物的基因組DNA模板進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示，豬基因組DNA模板擴(kuò)增的Ct值為23（圖3虛線箭頭），其他物種的Ct值大于35（圖3空心箭頭）或未檢測到擴(kuò)增信號(hào)（圖3實(shí)心箭頭），NTC未檢測到信號(hào)。

圖2 豬引物SEQ-sus2-F和SEQ-sus2-R特異性檢測結(jié)果

虛線箭頭：豬DNA；空心箭頭：其他動(dòng)物DNA；實(shí)心箭頭：NTC

2.2.2 退火溫度優(yōu)化 豬的引物SEQ-sus2-probe-F/ R Real-time PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果如表2所示，在擴(kuò)增效率、空白對(duì)照擴(kuò)增方面，各退火溫度之間沒有顯著差異。綜合分析比較，選擇較高的決定系數(shù)、較小的Ctmin、非特異性擴(kuò)增Ct值＞35的退火溫度，退火溫度60℃同時(shí)滿足上述條件，因此，后續(xù)試驗(yàn)中采用60℃進(jìn)行Real-time PCR檢測。

2.2.3 引物和探針濃度的優(yōu)化 不同的引物和探針濃度優(yōu)化結(jié)果如表3所示，綜合分析，選擇較高的擴(kuò)增效率和決定系數(shù)，較小的最小Ct值，非特異性擴(kuò)增Ct值＞35，空白對(duì)照無擴(kuò)增的引物和探針組合（表3），后續(xù)試驗(yàn)中采用探針濃度200 nmol·L-1，引物濃度250 nmol·L-1進(jìn)行Real-time PCR檢測。

表2 豬引物退火溫度的優(yōu)化

不同字母表示差異顯著（＜0.05）。下同 Different lowercase letters indicate significant difference (＜0.05). The same as below

表3 豬引物和探針濃度優(yōu)化

2.3 動(dòng)物源性成分Real-time PCR檢測

采用引物SEQ-common296-F/R對(duì)不同物種的基因組DNA模板進(jìn)行檢測，所有物種均有擴(kuò)增，且Tm相似，NTC未檢測到信號(hào)（圖4）。綜合分析，選擇較高的擴(kuò)增效率和決定系數(shù)，較小的Ctmin，非特異性擴(kuò)增Ct值＞35，空白對(duì)照無擴(kuò)增的引物和探針組合，退火溫度58.5℃具有較好的擴(kuò)增效果，其次是60℃，考慮與豬源性成分?jǐn)U增同時(shí)進(jìn)行，因此選擇與豬源性成分?jǐn)U增相同的退火溫度60℃（表4）。采用引物濃度350 nmol·L-1，探針濃度200 nmol·L-1（表5）進(jìn)行Real-time PCR檢測。

2.4 基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用連續(xù)稀釋豬基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，用豬的引物和探針進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線為=-3.29+29.04，2=0.9985。DNA含量在0.02—200 ng/25 μL反應(yīng)體系范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系，檢測的靈敏度達(dá)0.02 ng/25 μL反應(yīng)體系。

圖4 動(dòng)物源性成分real-time PCR擴(kuò)增

表4 通用引物退火溫度的優(yōu)化

表5 通用引物和探針濃度優(yōu)化

圖5 豬源性成分基因組DNA定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用連續(xù)稀釋豬基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，用動(dòng)物通用的引物和探針進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線為=-3.32+29.93，2=0.9968。DNA含量在0.02—200 ng/25 μL反應(yīng)體系范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系，檢測的靈敏度達(dá)0.02 ng/25 μL反應(yīng)體系。

圖6 動(dòng)物源性成分基因組DNA定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 混合DNA樣品中豬源性成分Real-time PCR檢測

當(dāng)混合3種相同濃度的基因組DNA樣品（豬、牛、雞）時(shí)（每種成分質(zhì)量百分含量33.33%），以豬引物和探針進(jìn)行Real-time PCR測得的Ct值為24.16，以通用引物和探針進(jìn)行Real-time PCR測得Ct值為23.44，根據(jù)公式（3）計(jì)算的豬源性成分百分含量為33.77%，百分誤差為1.32%。

當(dāng)混合不同質(zhì)量的牛肉和豬肉，檢測樣品中的豬源性成分，實(shí)際值和檢測值如表6所示，檢測的最小百分誤差為1.06%，最大百分誤差為7.12%，百分誤差大于單純DNA混合樣品的檢測。

表6 混合肉樣中豬源性成分檢測結(jié)果

3 討論

3.1 特異性基因篩選

動(dòng)物源性成分PCR/Real-time PCR鑒別技術(shù)的關(guān)鍵在于特異性基因的篩選，基于線粒體基因建立的物種特異性PCR/Real-time PCR檢測方法已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性成分的定性檢測。但是對(duì)于定量檢測，需要篩選基因組上拷貝數(shù)恒定的特異性基因進(jìn)行Real- time PCR檢測[5-6]。微衛(wèi)星DNA在基因組中數(shù)量龐大，在豬的基因組中，目前已研究鑒定了878 967個(gè)多態(tài)性的微衛(wèi)星DNA[12]。而且相關(guān)文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了微衛(wèi)星DNA擴(kuò)增所需要的引物序列，無需自行設(shè)計(jì)引物，可以直接進(jìn)行PCR驗(yàn)證，大大縮短了篩選和驗(yàn)證的時(shí)間。本研究篩選的豬特異性微衛(wèi)星DNA（Accession EF172428）通過Blast比較分析，在GeneBank數(shù)據(jù)庫中只有一條豬的核酸序列數(shù)據(jù)，未在其他動(dòng)物核酸數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)相似的序列。根據(jù)其基因序列設(shè)計(jì)的特異性引物只能從豬的基因組DNA模板中擴(kuò)增出目的條帶，其他9種動(dòng)物中沒有擴(kuò)增條帶，因此該基因在豬的基因組DNA中具有特異性。雖然本試驗(yàn)挑選的另一個(gè)微衛(wèi)星DNA（Accession AF375760）不具有特異性，但是從兩個(gè)微衛(wèi)星DNA中就可以篩選出一個(gè)特異性的微衛(wèi)星DNA，也說明本試驗(yàn)篩選特異性微衛(wèi)星DNA的方法具有較高的成功概率，可以采用此方法開發(fā)更多的物種特異性的微衛(wèi)星DNA用于動(dòng)物源性成分的定性和定量檢測。

3.2 Real-time PCR反應(yīng)優(yōu)化

影響Real-time PCR檢測方法的因素主要有退火溫度、引物濃度和探針濃度。針對(duì)上述因素，本試驗(yàn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從擴(kuò)增效率、回歸方程的相關(guān)系數(shù)、最小Ct值、非特異性擴(kuò)增的Ct值以及空白對(duì)照的Ct值等方面考察上述因素對(duì)Real-time PCR擴(kuò)增效果的影響。最終優(yōu)化的試驗(yàn)條件下擴(kuò)增效率均高于96%，相關(guān)系數(shù)大于0.99，均符合Real-time PCR檢測的相關(guān)要求（擴(kuò)增效率90%—105%，相關(guān)系數(shù)大于0.98）[13]。雖然對(duì)其他9種動(dòng)物源性成分檢測時(shí)也出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增，但是Ct值均大于35，一般在動(dòng)物源性成分檢測中，判斷結(jié)果時(shí)定義臨界點(diǎn)Ct值為35，大于35視為未檢測出動(dòng)物源性成分[14-15]。通過優(yōu)化退火溫度、引物和探針濃度，本研究建立的Real-time PCR檢測方法的檢測限為0.02 ng/25 μL反應(yīng)體系，結(jié)果與巫堅(jiān)等[16]和Chen等[17]報(bào)道的檢測靈敏度（0.03 ng/25 μL、0.025 ng/25 μL）相似。

3.3 定量檢測分析

Real-time PCR技術(shù)最大的優(yōu)勢是可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品中的DNA含量進(jìn)行定量檢測，因此，其在食品檢測領(lǐng)域廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分檢測、食源性致病菌的檢測、食品真?zhèn)螜z測[18-20]等方面。在轉(zhuǎn)基因檢測中，最多的是雙標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量法，即將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的DNA溶液梯度稀釋，對(duì)內(nèi)、外源基因分別生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別定量待測樣品內(nèi)、外源基因的拷貝數(shù)，以待測樣品的內(nèi)、外源基因的拷貝數(shù)之比來近似代表樣品中的轉(zhuǎn)基因質(zhì)量分?jǐn)?shù)[21]。Ren等[22]采用雞-干擾素基因、豬-actin基因、牛生長激素基因作為靶基因，肌肉生長抑制素基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行定量，檢測混合樣品中雞、豬和牛肉的成分，檢測誤差在0.69%—22.66%，低于25%的檢測誤差水平，認(rèn)為可以接受。本研究采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量法，分別對(duì)豬源性成分和總動(dòng)物源性成分進(jìn)行定量。采用篩選出的特異性基因檢測豬源性成分，采用脊椎動(dòng)物基因組中超級(jí)保守序列[23]檢測總動(dòng)物源性成分，分別定量二者DNA含量，通過計(jì)算豬源性成分和總動(dòng)物源性成分的比值，獲得豬源性成分的百分含量。通過測試，檢測混合DNA樣品中豬源性成分的百分誤差較?。?.32%）。而實(shí)際混合肉樣的檢測誤差高于DNA混合樣品，百分誤差在1.34%—7.12%，低于25%的檢測誤差水平，檢測的準(zhǔn)確性與Wang等[24]報(bào)道的相對(duì)誤差相似（1.64%—18.43%）。產(chǎn)生誤差的主要原因在于不同的肉樣中，單位質(zhì)量肉中的細(xì)胞數(shù)目存在差異，相應(yīng)的造成單位質(zhì)量肉中的DNA質(zhì)量存在差別[8]，所以Real-time PCR最終檢測出的是豬源性成分DNA含量的百分比，而不是豬肉質(zhì)量的百分比。另外，不同動(dòng)物肉的DNA提取效率可能存在差別，也可能對(duì)最終結(jié)果造成影響。

4 結(jié)論

本研究篩選豬特異性微衛(wèi)星DNA，設(shè)計(jì)引物和探針建立了豬源性成分Real-time PCR檢測方法，檢測靈敏度達(dá)0.02 ng/25 μL反應(yīng)體系，具有較好的特異性和敏感性。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別定量肉中的豬源性成分和總動(dòng)物源性成分，計(jì)算樣品中豬源性成分的百分比，誤差在1.06%—7.12%，可初步實(shí)現(xiàn)豬源性成分的定量檢測。

[1] 史艷宇, 王瑩, 石虹, 李天雨, 華蕾. 微滴數(shù)字PCR方法檢測畜肉食品中鴨源性成分. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào), 2018, 9(3): 583-588.

SHI Y Y, WANG Y, SHI H, LI T Y, HUA L. Detection of duck-derived materials in meat products by droplet digital PCR. Journal of Food Safety and Quality, 2018, 9(3): 583-588. (in Chinese)

[2] SUL S, KIM M J, LEE J M, KIM S Y, KIM H Y. Development of a rapid on-site method for the detection of chicken meat in processed ground meat products by using a direct ultrafast PCR system. Journal of Food Protection, 2020, 83(6): 984-990. doi: 10.4315/jfp-19-583.

[3] KIM M J, KIM H Y. A fast multiplex Real-time PCR assay for simultaneous detection of pork, chicken, and beef in commercial processed meat products. LWT-Food Science and Technology, 2019, 114: 108390. doi: 10.1016/j.lwt.2019.108390.

[4] 陳念, 賴小平. 線粒體基因組: 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和基因含量進(jìn)化. 生物學(xué)雜志, 2011, 28(1): 70-73, 17. doi: 10.3969/j.issn.1008-9632.2011.01. 070.

CHEN N, LAI X P. Mt-genome revolution: Structure and gene content. Journal of Microbiology, 2011, 28(1): 70-73, 17. doi:10.3969/j.issn. 1008-9632.2011.01.070. (in Chinese)

[5] 陳傳君, 金鷺, 林華, 胡濱, 韓國全, 陳世界, 張婧, 安微, 楊苗. 食品中羊肉源性成分微滴數(shù)字PCR定量方法的建立. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2020, 46(6): 229-237.

CHEN C J, JIN L, LIN H, HU B, HAN G Q, CHEN S J, ZHANG J, AN W, YANG M. Quantification of mutton-derived ingredients in food by droplet digital PCR. Food and Fermentation Industries, 2020, 46(6): 229-237. (in Chinese)

[6] BALLIN N Z, VOGENSEN F K, KARLSSON A H. Species determination-Can we detect and quantify meat adulteration? Meat Science, 2009, 83(2): 165-174. doi: 10.1016/j.meatsci.2009.06.003.

[7] WANG Z C, WANG Z Y, LI T T, QIAO L, LIU R, ZHAO Y, XU Z Z, CHEN G, YANG S M, CHEN A L. Real-time PCR based on single- copy housekeeping genes for quantitative detection of goat meat adulteration with pork. International Food Science and Technology, 2020, 55(2): 553-558. doi: 10.1111/ijfs.14350.

[8] 劉立兵, 陳敏娜, 孫曉霞, 張亦琴, 付琦, 錢云開, 周巍, 郭春海, 王建昌. 微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)香腸制品中雞、豬、牛源性成分的定量分析. 肉類研究, 2020, 34(8): 51-56.

LIU L B, CHEN M N, SUN X X, ZHANG Y Q, FU Q, QIAN Y K, ZHOU W, GUO C H, WANG J C. Quantitative analysis of chicken-, porcine- and bovine-derived ingredients in sausage products by droplet digital polymerase chain reaction. Meat Research, 2020, 34(8): 51-56. (in Chinese)

[9] TABERLET P, WAITS L P, LUIKART G. Noninvasive genetic sampling: Look before you leap. Trends in Ecology and Evolution, 1999, 14(8): 323-327. doi: 10.1016/S0169-5347 (99)01637-7.

[10] SELKOE K A, TOONEN R J. Microsatellites for ecologists: a practical guide to using and evaluating microsatellite markers. Ecology Letters, 2006, 9(5): 615-629. doi: 10.1111/j.1461-0248.2006. 00889.x.

[11] 薩姆布魯克 J, 拉塞爾 D W, 黃培堂. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南. 三版. 北京: 科學(xué)出版社, 2002.

SAMBROOK J, RUSSELL D W, HUANG P T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Beijing: Science Press, 2002. (in Chinese)

[12] WU Z Z, GONG H F, ZHANG M P, TONG X K, AI H S, XIAO S J, PEREZ-ENCISO M, YANG B, HUANG L S. A worldwide map of swine short tandem repeats and their associations with evolutionary and environmental adaptations. Genetics Selection Evolution, 2021, 53(1): 39. doi: 10.1186/s12711-021-00631-4.

[13] KRALIK P, RICCHI M. A basic guide to real time PCR in microbial diagnostics: Definitions, parameters, and everything. Frontiers in Microbiology, 2017, 8: 108. doi: 10.3389/fmicb.2017.00108.

[14] DOOLEY J J, PAINE K E, GARRETT S D, BROWN H M. Detection of meat species using TaqMan real-time PCR assays. Meat Science, 2004, 68(3): 431-438. doi: 10.1016/j.meatsci.2004.04.010.

[15] MAYER W, HOCHEGGER R. Discrimination of two alleles of the melanocortin receptor 1 gene to discern European wild boar () and domestic pig () in meat products by real-time PCR. European Food Research and Technology, 2011, 232(4): 687-692. doi: 10.1007/s00217-010-1402-8.

[16] 巫堅(jiān), 黃曉韻, 王海華, 陳小聰. 實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測肉制品中豬源性成分. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào), 2021, 12(9): 3715-3720.

WU J, HUANG X Y, WANG H H. CHEN X C. Detection of porcine- derived components in meat products by real-time fluorescence PCR. Journal of Food Safety and Quality, 2021, 12(9): 3715-3720. (in Chinese)

[17] CHEN X Y, LU L X, XIONG X H, XIONG X, LIU Y J. Development of a real-time PCR assay for the identification and quantification of bovine ingredient in processed meat products. Scientific Reports, 2020, 10(1): 2052. doi: 10.1038/s41598-020-59010-6.

[18] LIU G Q, LUO J X, XU W L, LI C D, GUO Y S, GUO L. Improved triplex real-time PCR with endogenous control for synchronous identification of DNA from chicken, duck, and goose meat. Food Science and Nutrition, 2021, 9(6): 3130-3141. doi: 10.1002/fsn3.2272.

[19] LI J, GAO H F, LI Y J, XIAO F, ZHAI S S, WU G, WU Y H. Event-specific PCR methods to quantify the genetically modified DBN9936 maize. Journal of Food Composition and Analysis, 2022, 105: 104236. doi: 10.1016/j.jfca.2021.104236.

[20] LABRADOR M, GIMéNEZ-ROTA C, ROTA C. Real-time PCR method combined with a matrixprocedure for the quantification of listeria monocytogenes in meat products. Foods, 2021, 10(4): 735. doi: 10.3390/foods10040735.

[21] 黃文勝, 鄧婷婷, 韓建勛, 吳亞君, 陳穎. 轉(zhuǎn)基因定量檢測的不確定度研究. 中國生物工程雜志, 2012, 32(1): 49-55.

HUANG W S, DENG T T, HAN J X, WU Y J, CHEN Y. Estimate the uncertainty on quantification of GMO by the fluorescence real-time PCR method, China Biotechnology, 2012, 32(1): 49-55. (in Chinese)

[22] REN Y F, LI X, LIU, Y M, YANG L T, CAI Y C, QUAN S, PAN L W, CHEN S S. A novel quantitative real-time PCR method for identification and quantification of mammalian and poultry species in foods. Food Control, 2017, 76: 42-51. doi: 10.1016/j.foodcont.2017. 01.003.

[23] BEJERANO G, PHEASANT M, MAKUNIN I, STEPHEN S, KENT W J, MATTICK J S, HAUSSLER D. Ultraconserved elements in the human genome. Science, 2004, 304(5675): 1321-1325. doi: 10.1126/ science.1098119.

[24] WANG W J, WANG X Y, WEI T, ZHANG Q D, ZHOU X, LIU B. A multiplex Real-time PCR approach for identification and quantification of sheep/goat, fox and murine fractions in meats using nuclear DNA sequences. Food Control, 2021, 126: 108035. doi: 10.1016/j.foodcont. 2021.108035.

Quantitative Detection Technology of Porcine-Derived Materials in Meat by Real-time PCR

1Jiangsu Agri-Animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300, Jiangsu;2College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

【】The aim of this study was to develop a rapid and accurate quantitative method for identifying porcine-derived materials.【】Porcine microsatellites DNA were selected from GenBank nucleotide database. Primers specific for porcine were designed based on the sequences of microsatellite DNA. Genomic DNA from 10 kinds of common animals was amplified by PCR method. The specificity of selected microsatellite DNA to porcine-derived materials was judged by the amplification products. According to the microsatellite sequence, the specific primers and probes were designed to establish a Real-time PCR method for identifying porcine-derived materials. The double standard curve was used to quantify the porcine-derived materials and total animal-derived materials, respectively, and the percentage content of porcine-derived materials was calculated. 【】Porcine specific microsatellite DNA with the accession number EF172428 was selected. Only porcine DNA gave a fragment through PCR assay, while there was no amplification for other non-target animal species DNA. The limit of detection was 0.02 ng in a 25 μL reactive system using the Real-time PCR method. This method could accurately detect porcine-derived components in mixed DNA samples and mixed meat samples with 1.32% percent error and 1.06%-7.12% percent error, respectively. 【】The quantitative detection method of porcine-derived materials by Real-time PCR in this research could be used to detect the percentage content of porcine-derived materials in mixed samples.

meat; swine; animal-derived materials; Real-time PCR; quantitation

2022-03-26；

2022-11-01

國家自然科學(xué)基金青年基金（30471225）、泰州市科技支撐計(jì)劃社會(huì)發(fā)展（指導(dǎo)性）項(xiàng)目（TS202019）

翟曉虎，E-mail：zhaixiaohu010@163.com。李翎旭，E-mail：2020107106@njau.edu.cn。翟曉虎和李翎旭為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者姚大偉，E-mail：yaodawei@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）