鐵皮石斛原球莖富硒懸浮培養(yǎng)條件優(yōu)化

韓素菊， 梅闖

（綿陽師范學院城鄉(xiāng)建設與規(guī)劃學院，四川 綿陽 621000）

鐵皮石斛(Dendrobium officinale)為蘭科多年生附生草本植物。1992年鐵皮石斛被收載為瀕危植物，主治熱病津傷、口干煩渴、陰虛火旺、目暗不明等癥。臨床應用上鐵皮石斛具有增強機體免疫力、抗氧化、抗疲勞、降低血壓、降血糖、抗腫瘤等方面[1-5]的獨特功效。現(xiàn)有研究表明，人體與動物體內(nèi)硒元素的缺乏與多種疾病的產(chǎn)生有一定的關系，而含硒的各類產(chǎn)品對于這些疾病可以起到緩解或治愈作用[6]。硒具有抗癌、抗氧化的功效，還具有改善免疫系統(tǒng)，增強免疫細胞的生物學功能[7]。無機硒相較于有機硒的安全性和吸收率要低，當前主要是依靠植物轉化技術的途徑來獲取有機硒，而通過生物轉化有利于提高有機硒的含量，最終進入食物鏈，可供人或動物食用[8-11]。另外對植物適量的施硒同時會促進其生長發(fā)育并提高產(chǎn)品質(zhì)量[12-13]。

利用懸浮培養(yǎng)技術，可以直接從培養(yǎng)物中生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物，這些次生代謝產(chǎn)物具有很多生物活性，是植物藥的重要成分。本研究對富硒懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)石斛堿、多糖等有用次生代謝產(chǎn)物進行探討，得出適合鐵皮石斛富硒懸浮培養(yǎng)細胞生長和石斛堿、多糖積累的優(yōu)化懸浮培養(yǎng)條件，以期為鐵皮石斛富硒懸浮培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)有效藥用成分提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用原球莖是將鐵皮石斛成熟未開裂的蒴果經(jīng)種子經(jīng)組織培養(yǎng)得到的材料。鐵皮石斛種子來自于浙江天目山鐵皮石斛示范基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 疏松原球莖的誘導 將鐵皮石斛原球莖分別繼代于含不同含量6-BA、NAA，pH5.8的固體MS培養(yǎng)基中。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照時間為12 h，光照強度為2 000 lx。在繼代3次之后，將生長良好、大小均一且結構疏松的原球莖，繼代到裝有30 mL培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中進行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)液與培養(yǎng)疏松原球莖一致，只是不加瓊脂。置于恒溫振蕩器中培養(yǎng)，溫度（25±2）℃，光照時間為12 h，光照強度2 000 lx，轉速 110 r·min-1。

1.2.2 懸浮培養(yǎng)接種量的確定 在超凈工作臺上稱取1、2、3、4、5 g生長良好、大小均一且結構疏松的鐵皮石斛原球莖，接種到培養(yǎng)液中，每組5瓶,重復3次。置于恒溫振蕩器上進行培養(yǎng)，30 d后收獲 ，測 定 其 鮮 重 (fresh weight，F(xiàn)W)、干 重 (dry weight，DW)、增殖系數(shù)。

1.2.3 懸浮原球莖增殖培養(yǎng)周期的確定 選擇生長良好、大小均一且結構疏松的原球莖接種于MS+2.0 mg·L-16-BA+0.50 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基上，每瓶接種量為3 g，于恒溫振蕩器中進行培養(yǎng)生長，共培養(yǎng)51 d。重復3次。從培養(yǎng)第6天開始，每隔3 d隨機收獲5瓶，將收獲的樣品進行處理之后，按照測定方法，測定其鮮重(FW)、干重(DW)以及增殖系數(shù)，并繪制原球莖的生長曲線。

1.2.4 不同硒質(zhì)量濃度對鐵皮石斛原球莖各指標含量影響測定 將生長良好、大小均一且結構疏松的鐵皮石斛原球莖分別接種到添加不同Na2SeO3含量（硒含量分別為0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg·L-1）的 MS+2.0 mg·L-16-BA+0.50 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖，pH為5.8液體培養(yǎng)基中。每瓶接種量為3 g，每個處理接種5瓶，根據(jù)前期懸浮原球莖增殖培養(yǎng)周期，在恒溫振蕩器中培養(yǎng)33 d之后收獲，用于測定各指標。

1.2.5 富硒懸浮培養(yǎng)原球莖生長曲線及各指標測定 選生長良好、大小均一且結構疏松的鐵皮石斛原球莖接種于 MS+2.0 mg·L-16-BA+0.50 mg·L-1NAA+0.05 mg·L-1Na2SeO3+30 g·L-1蔗糖，pH為 5.8的液體培養(yǎng)基中，每瓶接種量為3 g，于恒溫振蕩器中進行培養(yǎng)生長，觀察其生長狀態(tài)，共培養(yǎng)了39 d，從培養(yǎng)第3天開始，每隔3 d收獲5瓶，重復3次。將收獲的樣品進行處理之后，按照測定方法，測定各指標含量并繪制各生理指標的變化曲線。

1.3 各指標測定方法

1.3.1 原球莖生長量測定 用不銹鋼篩網(wǎng)過濾收集原球莖，蒸餾水清洗2次，再用濾紙吸收多余水分，稱量得鮮重(FW)。把收獲的原球莖置于105℃的恒溫鼓風干燥箱中殺青30 min，之后60℃烘12～24 h至恒重，得到干重(DW)。增殖系數(shù)測定公式如下。

1.3.2 多糖和生物堿含量測定 采用改進的蒽酮-硫酸法[14-15]測定多糖含量，采用溴甲酚綠酸性染料比色法[16-18]測定生物堿含量。每組數(shù)據(jù)測定3次，取平均值。

式中，C為待測樣品對應的標準曲線值（μg），VT為提取液總體積（mL），W為樣品干重（g），VS為測定時加樣量（mL），n為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.3 總蛋白質(zhì)含量測定 利用分光光度法[19-20]測定總蛋白含量，重復3次取平均值。

式中，D280代表蛋白質(zhì)提取液在280 nm處測得的吸光度，D260代表蛋白質(zhì)提取液在260 nm處測得的吸光度，V代表將所有樣品提取液稀釋成測量液濃度后的總體積（mL），m代表樣品質(zhì)量（g）。

1.3.4 硒含量測定 用ICP-OES測定硒含量[21]。測定3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計分析

用Excel 2016統(tǒng)計數(shù)據(jù)，IBM SPSS Statistics 23軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析并進行重復檢驗（P＜0.05），數(shù)據(jù)分析結果以平均數(shù)±標準偏差來表示。

2 結果與分析

2.1 不同激素組合對疏松原球莖誘導的影響

植物激素的合理組合是獲得疏松原球莖的關鍵，而獲得生長良好，大小均一且結構疏松的細胞是植物細胞懸浮培養(yǎng)的基礎。從表1中可以看出，添加不同激素含量的培養(yǎng)基所獲得的鐵皮石斛原球莖的生長情況存在較大的差別。在無激素的培養(yǎng)基中，原球莖褐化無法正常生長（圖1-1）。當6-BA含量越高，誘導的原球莖就越緊密，且原球莖發(fā)綠，不適合細胞懸浮培養(yǎng)（圖1-9、1-10）。6-BA 含量為 2.0 mg·L-1、NAA 含量為0.50 mg·L-1時，誘導的原球莖為淺黃綠色，質(zhì)地疏松（圖1-6）。試驗表明，鐵皮石斛疏松原球莖的最佳培養(yǎng)基為 MS+2.0 mg·L-16-BA+0.50 mg·L-1NAA。

圖1 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛原球莖穩(wěn)定生長的影響Fig.1 Effect of different media on the growth of protocorms of Dendrobium officinale

表1 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛原球莖生長的影響Table 1 Effect of different medias on the growth of protocorms of Dendrobium officinale

2.2 富硒懸浮培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究

2.2.1 接種量對原球莖增殖的影響 參照一般懸浮細胞培養(yǎng)時間周期并觀察培養(yǎng)物，初次培養(yǎng)選擇30 d后收獲原球莖。由表2可知，接種量對原球莖增殖有顯著影響，合適的接種量有利于原球莖的生長。當接種量大于4 g時，培養(yǎng)后期培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)不足以維持其正常生長，影響原球莖的繼續(xù)增殖，此時原球莖的增殖系數(shù)反而會隨著接種量的增加逐漸下降。而接種量太低也不利于原球莖增殖，接種量小于2 g時，增殖系數(shù)變低，生長速度緩慢。當接種量為3 g時，即為100 g·L-1時，生長量達到最大值，且細胞生長疏松。此時的增殖系數(shù)可達到最大值，為0.69。

表2 接種量對原球莖增殖的影響Table 2 Effect of different inoculating quantity on protocorms multiplication

2.2.2 培養(yǎng)天數(shù)對原球莖增殖系數(shù)的影響 為了觀察原球莖的生長衰亡過程，此試驗過程持續(xù)培養(yǎng)了51 d。在培養(yǎng)過程中，原球莖的干重、鮮重變化基本呈現(xiàn)先上升再平穩(wěn)最后下降的趨勢（表3）。在第6天到第18天期間，原球莖干重、鮮重迅速增加并在第33天時達到最大值。在第33天到39天期間，干重、鮮重基本上保持恒定，且都在第39天之后開始下降，此時原球莖開始褐化，并伴隨部分衰亡，生長活躍程度逐漸減弱。試驗顯示鐵皮石斛原球莖增殖培養(yǎng)周期最宜控制在33 d左右，可使其增殖系數(shù)達到最大，為2.86。

表3 培養(yǎng)天數(shù)對原球莖增殖的影響Table 3 Effect of different cultivated days on protocorm multiplication

2.2.3 富硒培養(yǎng)對原球莖生理指標及硒含量的影響 在MS液體增殖培養(yǎng)基中添加不同含量硒對原球莖進行富硒懸浮培養(yǎng)，根據(jù)前期原球莖生長周期，試驗富硒培養(yǎng)在33 d后收獲。由表4可知，不同硒含量對鐵皮石斛原球莖的生長、多糖含量、生物堿含量以及總蛋白質(zhì)含量有著不同的影響。當硒含量為0.05 mg·L-1時，原球莖富硒含量達到最大值，為4.01 mg·kg-1，且原球莖的增殖系數(shù)達到最大值，為1.95，多糖含量為29.07%，生物堿含量為0.025%，總蛋白質(zhì)含量為27.21%，而且此時原球莖顆粒大小均一且飽滿，生長良好，各生理指標含量最佳。而當硒含量大于0.10 mg·L-1時，原球莖的鮮重及增殖系數(shù)開始下降，且多糖、蛋白質(zhì)、生物堿含量也降低，試驗顯示高含量的硒抑制了原球莖的生長，且原球莖內(nèi)次生代謝類物質(zhì)含量也在降低。在培養(yǎng)基中添加適量的硒可促進原球莖生長及提高原球莖的多糖及總蛋白質(zhì)等的含量，提高原球莖品質(zhì)，可以達到鐵皮石斛原球莖富硒培養(yǎng)目標。

表4 硒含量對原球莖富硒含量、多糖、生物堿及總蛋白含量的影響Table 4 Effect of different selenium content on selenium-enriched content，polysaccharide content，alkaloid content and total protein content

2.3 最佳富硒含量下培養(yǎng)天數(shù)對原球莖各生理指標的影響

2.3.1 富硒原球莖生長曲線 為了觀察富硒原球莖生長、衰亡過程，此次培養(yǎng)周期持續(xù)了39 d。鐵皮石斛原球莖富硒懸浮培養(yǎng)的生長曲線如圖2所示，原球莖的鮮重變化也呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢。在培養(yǎng)30 d時，鮮重達到最大，之后開始緩慢下降。與未富硒培養(yǎng)試驗所得到的培養(yǎng)指標變化相比較，富硒培養(yǎng)對原球莖生長的促進作用是顯著的，使得原球莖的生長最大值提前了3 d，適量的富硒可促進原球莖的生長。之后由于原球莖纖維化程度開始不斷提高，生長的活躍程度逐漸減弱，部分的原球莖細胞開始逐漸出現(xiàn)褐化衰老現(xiàn)象，最終導致原球莖鮮重的降低。30 d時收獲能得到高質(zhì)量的富硒原球莖細胞。

圖2 最佳硒含量下培養(yǎng)天數(shù)對原球莖鮮重的影響Fig.2 Effect of cultivated days on fresh weight under optimum selenium concentration of protocorms

2.3.2 富硒原球莖多糖含量的變化曲線 由圖3可知，鐵皮石斛原球莖中的多糖含量呈現(xiàn)出先降低再增加最后又降低的趨勢。在0～9 d內(nèi)多糖含量有所下降，但從第12天開始，多糖含量開始增加，在30 d時達到最大，為34.79%，30 d后的多糖含量逐漸呈現(xiàn)下降的趨勢。多糖不僅是細胞內(nèi)儲存能量的物質(zhì)同時也是鐵皮石斛原球莖的代謝產(chǎn)物，在剛繼代到培養(yǎng)基時，原球莖的自身生長需要多糖的不斷分解，導致多糖含量下降，之后在原球莖適應環(huán)境后，多糖不再分解消耗，細胞積累多糖使含量上升。而在培養(yǎng)后期，隨著培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，需要分解多糖以提供原球莖細胞的生長和合成目的產(chǎn)物，導致多糖含量又開始下降。

圖3 最佳硒含量下培養(yǎng)天數(shù)對原球莖多糖含量的影響Fig.3 Effect of cultivated days on polysaccharide content of protocorm under optimum selenium content

2.3.3 富硒原球莖生物堿含量的變化曲線 在富硒培養(yǎng)中，鐵皮石斛原球莖生物堿含量變化如圖4所示，生物堿含量總體上呈現(xiàn)迅速上升，之后開始緩慢下降的趨勢。當培養(yǎng)天數(shù)為30 d時，生物堿含量達到最大，為0.026%，之后開始下降。

圖4 最佳硒含量下培養(yǎng)天數(shù)對原球莖生物堿含量的影響Fig.4 Effect of cultivated days on alkaloid content of protocorm under optimum selenium content

2.3.4 富硒原球莖總蛋白質(zhì)含量的變化曲線 鐵皮石斛原球莖總蛋白質(zhì)含量變化如圖5所示，總蛋白質(zhì)含量總體上呈現(xiàn)迅速上升后下降的趨勢。隨著培養(yǎng)時間的不斷延長，蛋白質(zhì)含量在逐漸減少，這可能與鐵皮石斛原球莖纖維化程度不斷提高、生長活躍程度逐漸減弱有關。即當培養(yǎng)天數(shù)30 d時，總蛋白含量達到最大，為28.25%，之后量逐漸開始下降。

圖5 最佳硒含量下培養(yǎng)天數(shù)對原球莖總蛋白質(zhì)含量的影響Fig.5 Effect of cultivated days on total protein content of protocorm under optimum selenium content

3 討論

在本試驗中添加0.05 mg·L-1的硒時，對原球莖生長起到促進作用，并能提高原球莖產(chǎn)量及產(chǎn)品品質(zhì)，但過量硒(≥0.10 mg·L-1)又不利于原球莖的生長，會對原球莖產(chǎn)生不同程度的毒害作用。研究結果表明，當硒含量為0.05 mg·L-1時，富硒原球莖生長最佳。徐國華等[22]在研究中所用的培養(yǎng)基N6+0.5 mg·L-1NAA+3%蔗糖，與本研究所用培養(yǎng)基 MS+2.0 mg·L-16-BA+0.50 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖相比，在MS培養(yǎng)基富硒0.05 mg·L-1條件下更利于原球莖富硒生長，并達到最大的硒含量4.01 mg·kg-1，硒參與到原球莖的新陳代謝，同時促進了原球莖的生長，提高了產(chǎn)量及其品質(zhì)。

鐵皮石斛原球莖多糖、生物堿、蛋白質(zhì)含量的多少對原球莖品質(zhì)起到?jīng)Q定性的作用。本研究所得到的多糖含量達到了34.79%，含量高于現(xiàn)有人工栽植或是野生鐵皮石斛多糖含量。何鐵光等[23]在對鐵皮石斛不同來源材料的研究中，用1/2 MS液體培養(yǎng)基得到的鐵皮石斛原球莖多糖含量為24.32%，而孫丹[24]通過固體培養(yǎng)基培養(yǎng)得到原球莖中多糖含量為21.42%，本研究富硒后多糖含量升高。已有的研究表明，原球莖中生物堿含量相較于人工栽培或是野生鐵皮石斛偏低，本研究中富硒懸浮培養(yǎng)所得生物堿含量為0.026%,相較于張本厚等[20]由固體培養(yǎng)基培養(yǎng)所得到生物堿含量為0.018%高得多。而在試驗中富硒后原球莖總蛋白質(zhì)含量為28.25%，高于張本厚等[20]由固體培養(yǎng)基培養(yǎng)所得的22.19%。在尚慶茂等[25]研究硒營養(yǎng)對水培生菜品質(zhì)的影響，杜振宇等[26]研究施硒對茄子品質(zhì)的影響，倪蕾等[27]研究不同含量亞硒酸鈉對水培苦苣的影響試驗中，得出施加適量的硒元素可以提高蛋白質(zhì)的含量，且硒元素對蛋白質(zhì)的合成具有促進作用。本試驗同樣也證實了富硒原球莖懸浮培養(yǎng)促進了蛋白質(zhì)的合成。

對于原球莖的培養(yǎng)周期，無論是否富硒培養(yǎng)，原球莖的生長曲線均呈現(xiàn)先快速再緩慢上升，接著平穩(wěn)生長，最后開始緩慢下降的趨勢。但富硒培養(yǎng)原球莖后，收獲期提前了3 d，富硒后原球莖的增值系數(shù)從0.69提高到2.86,富硒促進了原球莖細胞的生長。

本研究通過富硒培養(yǎng)對原球莖生長、富硒、多糖、生物堿、總蛋白質(zhì)等含量的影響進行了初步研究。富硒后，硒參與到原球莖的新陳代謝，促進了原球莖的生長，提高了原球莖的產(chǎn)量及其品質(zhì)，成功建立了鐵皮石斛原球莖富硒懸浮培養(yǎng)的技術體系。