PLOD2表達(dá)水平與食管癌放療預(yù)后的關(guān)系

張哲，張雷，段詩苗，江浩

食管癌是常見的惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于胃癌，食管瘤患者發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)屬于中晚期，相當(dāng)一部分患者失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，放射治療成為重要的選擇。盡管放射治療技術(shù)不斷更新，放射設(shè)備不斷進(jìn)步，但放射抵抗仍然是食管癌放療效果不好的重要原因[1-2]。PLOD2(5-雙加氧酶)如何參與激活食管癌放射抵抗基因的機(jī)制尚不完全清楚。PLOD2蛋白是存在于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的功能性酶，能夠促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，研究[3-4]表明，PLOD2通過腫瘤細(xì)胞膜表面的鈣離子依賴性跨膜糖蛋白的介導(dǎo)從而激活P-gp(P-glycoprotein)表達(dá)。P-gp陽性的腫瘤細(xì)胞可以不同程度地抵抗多種射線的殺傷，抑制放射線的凋亡效應(yīng)，從而引發(fā)放射抵抗而導(dǎo)致放射治療失敗。本研究發(fā)現(xiàn)食管癌PLOD2表達(dá)不同對(duì)放射治療的反應(yīng)是不同的，初步探討了PLOD2表達(dá)與食管癌放療預(yù)后之間的臨床關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院放療科2012年1月—2017年1月行纖維食管鏡活檢證實(shí)為食管鱗狀細(xì)胞癌患者的石蠟組織標(biāo)本，入組患者176例均進(jìn)行根治性放療，放療劑量根據(jù)患者的具體情況，在45-60GY之間，均完成了治療計(jì)劃。均能隨訪，失訪者排除，未能完成治療計(jì)劃的患者也排除。年齡最小者28歲，年齡最大者91歲，中位年齡67歲。2組患者的臨床特征比較。見表1。

表1 2組患者臨床特征比較

1.2 方法 主要試劑鼠抗人PLOD2單抗來自美國Santa Cruz，Elivison Plus試劑盒來自邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，檢測(cè)PLOD2所需要的病理材料來源于病理科存檔的石蠟包埋組織標(biāo)本，免疫組織化學(xué)ElivisionTM Plus法檢測(cè),免疫組化染色，采用已知陽性片作對(duì)照，以PBS液代替一抗作空白對(duì)照，病理檢測(cè)PLOD2表達(dá)情況，觀察分析2組患者臨床轉(zhuǎn)移情況、放療后3月臨床近期有效性、患者1、3、5年的總生存率間的差異，分析PLOD2陽性表達(dá)組與PLOD2陰性表達(dá)組患者生存預(yù)后之間的關(guān)系。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 PLOD2陽性表達(dá)判定 PLOD2主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，強(qiáng)陽性部分細(xì)胞核也會(huì)表達(dá)(見圖1)，使用半定量法對(duì)染色面積進(jìn)行評(píng)分：0分，無染色;1分，染色10%; 2分，染色10%～30%;3分，染色30%。染色強(qiáng)度：0分，無; 1分，淡黃色; 2分，黃色; 3分，棕黃色。 總分為染色面積和染色強(qiáng)度得分的乘積，總分≤3分定義為陰性表達(dá)，總分>3分定義為陽性表達(dá)。所有免疫組化的切片都由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生獨(dú)立評(píng)分，通過聯(lián)合評(píng)估對(duì)分歧結(jié)果進(jìn)行校正。

1A PLOD2陽性表達(dá)(SP×100倍) 1B PLOD2陽性表達(dá)(SP×400倍) 1C PLOD2陰性表達(dá)(SP×100倍) 1D PLOD2陰性表達(dá)(SP×400倍)圖1 PLOD2在食管癌組織中的表達(dá)情況

1.3.2 臨床效果的判定 (1)臨床轉(zhuǎn)移情況和放療后3月臨床近期有效性的判定，根據(jù)食管造影、超聲檢查、CT、MRI、ECT或者pet-CT等影像資料，部分患者采取穿刺組織學(xué)活檢取得病理結(jié)果等資料按照影像學(xué)診斷指南標(biāo)準(zhǔn)判斷，部分緩解(PR)為腫瘤縮小≥50%，持續(xù)1月以上。完全緩解(CR)為胸前上腫瘤完全消失，持續(xù)1月以上。有效率=(PR+CR)例數(shù)/總例數(shù)。(2)生存率是患者接受放射治療結(jié)束后存活滿1、3、5年的人數(shù)與總?cè)藬?shù)的比率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以n，%表示，采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者臨床轉(zhuǎn)移情況比較 PLOD2陽性表達(dá)組在疾病的臨床發(fā)展過程中出現(xiàn)遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移率高于PLOD2陰性表達(dá)組，無臨床轉(zhuǎn)移率低于PLOD2陰性表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PLOD2陽性表達(dá)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及局部侵犯率高于PLOD2陰性表達(dá)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.2 2組患者放療后臨床近期有效性比較 放療3月后全面臨床復(fù)查，PLOD2陽性表達(dá)組臨床近期有效率低于PLOD2陰性表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.3 2組患者1、3、5年生存率比較 PLOD2陽性表達(dá)組患者1、3、5年生存率均低于陰性表達(dá)組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表2 2組患者臨床轉(zhuǎn)移情況比較

表3 2組患者放療3月后臨床近期有效率比較

表4 2組患者1、3、5年生存率比較

3 討論

部分食管癌患者在確診時(shí)，因腫瘤生長部位不適合手術(shù)或病情發(fā)展已喪失了手術(shù)時(shí)機(jī)，多采取以放療為主的綜合治療或者單純放療。近年來隨著同期放化療的應(yīng)用，食管癌患者5年生存率有了較大提高，但2年生存率仍低于40%，治療失敗的主要原因是局部未控制和復(fù)發(fā)(30%～50%)[1-2]。腫瘤細(xì)胞放射敏感性是影響放療效果的主要生物學(xué)因素，尋找預(yù)測(cè)食管癌放療預(yù)后指標(biāo)是實(shí)現(xiàn)食管癌個(gè)體化、高效放療的關(guān)鍵。

放射治療作為食管鱗狀細(xì)胞癌有效治療方法之一，因放射抵抗導(dǎo)致一部分患者療效降低。放射治療通過高能射線與物質(zhì)作用時(shí)，物質(zhì)中的電子從原子或分子軌道轉(zhuǎn)移發(fā)生電離，正是這一機(jī)制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生物理化學(xué)改變，破壞腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)。放射治療對(duì)于進(jìn)入有絲分裂周期中的細(xì)胞，有較好的殺傷作用，但對(duì)靜止的G0期細(xì)胞殺傷作用較差。盡管有各種方法誘導(dǎo)G0期細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂周期，仍未從根本上解決放射抵抗問題。對(duì)于已經(jīng)進(jìn)入分裂周期的部分腫瘤細(xì)胞，沒有產(chǎn)生致死性損傷，對(duì)于亞致死性損傷和潛在致死性損傷的腫瘤細(xì)胞一定時(shí)間內(nèi)在適合的條件下可以修復(fù)損傷，重新獲得增殖能力。在這個(gè)修復(fù)過程中PLOD2起到了重要的促進(jìn)作用，同時(shí)PLOD2可能是激活食管鱗狀細(xì)胞癌放射抵抗基因的一個(gè)重要原因。有研究[5-6]報(bào)道PLOD2通過腫瘤細(xì)胞膜表面的鈣離子依賴性跨膜糖蛋白的介導(dǎo)從而激活P-gp(P-glycoprotein)表達(dá)，P-gp是由多藥耐藥基因MDR1編碼的一種能量依賴跨膜糖蛋白，P-gp陽性的腫瘤細(xì)胞可以不同程度地抵抗多種射線的殺傷，P-gp通過穩(wěn)定線粒體電位，使腫瘤細(xì)胞線粒體通透性上調(diào)，從而抑放射線的凋亡效應(yīng)，引發(fā)放射抵抗而導(dǎo)致放射治療失敗。

PLOD2的表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切關(guān)系[7-9]。PLOD2異常高表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生有一定的關(guān)系，也是促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌PLOD2陽性表達(dá)組患者的病理分化程度較陰性表達(dá)組患者更低，臨床分期更晚，且PLOD2陽性患者放療后遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移率高于陰性患者。同時(shí)，PLOD2陽性患者放療有效率低于陰性患者。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞在某些因素作用下獲得了遷移和運(yùn)動(dòng)等間質(zhì)細(xì)胞的功能[10-12]。PLOD2的作用機(jī)制主要是膠原蛋白在分泌到細(xì)胞外形成膠原纖維之前，需要在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行一系列的翻譯和修飾過程，其端肽區(qū)賴氨酸殘基經(jīng)賴氨酸羥化酶催化而發(fā)生羥基化。原膠原賴氨酸，2-酮戊二酸，5-雙加氧酶(PLOD2)蛋白的主要功能是羥基化膠原蛋白端肽區(qū)賴氨酸殘基，并在細(xì)胞外形成相互交聯(lián)穩(wěn)定和抗張力大的吡啶鏈結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，增加硬度，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。PLOD2的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了Slug和Axl的表達(dá)，從而誘導(dǎo)EMT的過程，同時(shí)也使得miR-205的表達(dá)下降，而miR-205可以抑制Zeb1和Vimentin的表達(dá)，其對(duì)于Zeb1和Vimentin的抑制減弱，Zeb1和Vimentin也是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要促進(jìn)因子[13-14]，通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路激活食管鱗狀細(xì)胞增殖。PLOD2的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而上皮細(xì)胞在某些因素作用下獲得了遷移和運(yùn)動(dòng)等間質(zhì)細(xì)胞的功能，腫瘤細(xì)胞分化程度變差，PLOD2陽性表達(dá)往往分化程度低，這也是PLOD2陽性表達(dá)組放射治療后預(yù)后差的一個(gè)重要因素[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌PLOD2陽性表達(dá)患者的放療后1、3、5年生存率均低于陰性表達(dá)患者。

提高食管癌放療敏感性，減少放療抵抗是提升食管癌放療預(yù)后的重要難題。本研究揭示了PLOD2陽性表達(dá)是食管鱗癌放療后預(yù)后不良的指標(biāo)，但是，本研究作為一項(xiàng)單中心回顧性研究，可能存在選擇偏移，同時(shí)患者以皖北地區(qū)人群為主，具有地域局限性，所以仍需多中心大樣本的回顧性研究進(jìn)一步支持本研究的結(jié)論?？傊琍LOD2表達(dá)水平的不同對(duì)食管癌放療預(yù)后會(huì)產(chǎn)生不同的影響，為預(yù)判食管癌放療的預(yù)后提供了新的依據(jù)，為食管鱗癌尋找到一個(gè)新的可能預(yù)測(cè)放射敏感性的分子靶點(diǎn)。