DSAZn與槲皮素的配位結(jié)合及對(duì)槲皮素的高靈敏度檢測(cè)

翟艷珂，潘宜杏，向 浩，徐 黎*，朱澤策，雷 咪

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430072 2.武漢紡織大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430200

引 言

槲皮素(Quercetin)是最常見(jiàn)的一種生物活性的類(lèi)黃酮化合物，難溶于水，具有抗炎、降血壓、免疫抑制、抗腫瘤、抗血小板聚集和心血管保護(hù)等多種藥理作用[1]。目前，槲皮素的檢測(cè)方法包括高效液相色譜法[2]、毛細(xì)管電泳-電化學(xué)[3]和熒光法[4]等，其中熒光法具有快速響應(yīng)和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。胡玉斐等采用印跡技術(shù)制備了一種槲皮素-AI(Ⅲ)聚合物修飾膜(CIP膜)，槲皮素可粘附在CIP膜上，通過(guò)記錄CIP膜固體表面的熒光光譜對(duì)槲皮素進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)存在蘆丁等結(jié)構(gòu)相似的藥物分子時(shí)，CIP膜對(duì)槲皮素有選擇性，檢測(cè)限為5 μg·L-1[5]。Wang等合成了具有穩(wěn)定雙發(fā)射熒光的硫氮共摻碳納米帶(SNCNRs)，向SNCNRs的PBS緩沖溶液中加入不同濃度的槲皮素，槲皮素和SNCNRs之間的電子相互作用使它們形成非熒光類(lèi)配合物，基于光誘導(dǎo)電子/能量轉(zhuǎn)移或內(nèi)濾效應(yīng)熒光猝滅機(jī)制，實(shí)現(xiàn)對(duì)槲皮素的檢測(cè)，在金屬離子存在時(shí)，SNCNRs對(duì)槲皮素具有選擇性，檢測(cè)限為21.13 nmol·L-1[6]。Sachin Kadian等合成硫摻雜石墨烯量子點(diǎn)(SGQDs)，槲皮素和SGQDs形成非熒光基態(tài)絡(luò)合物，通過(guò)內(nèi)濾效應(yīng)猝滅SGQDs的熒光，實(shí)現(xiàn)對(duì)紅酒樣品中槲皮素的檢測(cè)，該熒光探針在芹菜素等化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的黃酮類(lèi)化合物存在時(shí)也顯示出對(duì)槲皮素的選擇性，檢測(cè)限為0.006 μg·mL-1[7]。

槲皮素分子結(jié)構(gòu)具有較高的超離域度、完整的大π鍵共軛體系、強(qiáng)配位氧原子與合適的空間構(gòu)型，可與金屬離子螯合成穩(wěn)定的環(huán)狀配合物[8-9]。如圖1所示，槲皮素分子結(jié)構(gòu)中的1個(gè)羰基和5個(gè)羥基都能提供孤電子對(duì)，具有很強(qiáng)的配位能力。在中性介質(zhì)中，Zn(Ⅱ)，Al(Ⅲ)配合物和槲皮素有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，且3-羥基-4酮強(qiáng)于3’，4’-二羥基[10-11]。配位作用具有比氫鍵和靜電作用更高的鍵能，可以在水等質(zhì)子化溶劑中穩(wěn)定存在[12]。很多基于配位作用的陰離子受體與靶標(biāo)的結(jié)合常數(shù)可以達(dá)到106L·mol-1以上[13]，因而以配位作用結(jié)合的熒光探針可以有效地在水溶液中發(fā)揮檢測(cè)作用。此外，二價(jià)鋅離子具有全滿的3d軌道，與氮氧原子有較強(qiáng)的配位作用，廉價(jià)且毒性小，其配合物應(yīng)用最為廣泛。有研究設(shè)計(jì)了聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)[14-15]分子TPEZn，以四苯乙烯為熒光發(fā)色團(tuán)，側(cè)鏈修飾二聯(lián)吡啶鋅配合物，通過(guò)配位結(jié)合實(shí)現(xiàn)了在溶液中對(duì)焦磷酸及單鏈核酸的熒光信號(hào)增強(qiáng)響應(yīng)。

圖1 中性介質(zhì)中槲皮素與Zn(Ⅱ)的配位方式

參考上述研究(見(jiàn)圖2)，本工作合成了AIE型熒光探針DSAZn[16]，研究了DSAZn對(duì)槲皮素等五種藥物分子的熒光響應(yīng)，五種藥物分子結(jié)構(gòu)如圖3所示。該檢測(cè)方法靈敏度高、選擇性好、重現(xiàn)性好，是一種有效測(cè)定槲皮素的分析手段。

圖2 AIE熒光分子DSAZn的結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4600熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)；UV-2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；pHS-3C酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；渦旋震蕩儀；電子天平。

槲皮素(Qc)、淫羊藿素(AI)、異鼠李素(Ia)(均購(gòu)自上海源葉生物有限公司)；蘆丁(Ru)(上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司)；鹽酸多巴胺(DA)(上海泰坦科技股份有限公司)各分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖3(a—e)；pH 7.4磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、二甲亞砜(DMSO)，試劑均為分析純。分別配成2.5 mmol·L-1Qc, AI, Ia, Ru和DA的DMSO溶液，按需求稀釋取用。AIE型熒光分子DSAZn根據(jù)文獻(xiàn)[16]合成，配制濃度為1 mmol·L-1的DMSO溶液。用pH酸度計(jì)調(diào)節(jié)PBS緩沖液的pH至7.0，低溫保存在4 ℃冰箱中備用。

圖3 槲皮素(Qc)(a)、淫羊藿素(AI)(b)、異鼠李素(Ia)(c)、蘆丁(Ru)(d)、多巴胺(DA)(e)的分子結(jié)構(gòu)式

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)

準(zhǔn)確移取1 mL磷酸緩沖液(PBS，pH 7.0)于熒光比色皿中，加入10 μL DSAZn儲(chǔ)備液，再分別加入Qc，AI，Ia，Ru和DA藥物溶液，每次加入后渦旋振蕩。采用F-4600熒光光度計(jì)，激發(fā)波長(zhǎng)為415 nm，在435～680 nm范圍內(nèi)記錄室溫下的熒光光譜。

準(zhǔn)確移取2 mL pH 7.0磷酸緩沖液(PBS，pH 7.0)于石英比色皿中，檢測(cè)順序同熒光檢測(cè)。采用UV-2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，檢測(cè)250～750 nm范圍內(nèi)室溫下的紫外光譜。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 2018軟件繪圖，Chemdraw繪制化合物的結(jié)構(gòu)式，使用Microsoft Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥物分子熒光光譜分析

熒光滴定的結(jié)果如圖4(a—e)所示，固定DSAZn的濃度，隨著藥物分子濃度的增加，DSAZn在550 nm處的發(fā)射強(qiáng)度下降，發(fā)射峰位置和峰形基本保持不變，表明五種藥物均能夠猝滅DSAZn的熒光。由圖4(f)可以看出，Qc對(duì)DSAZn的熒光猝滅幅度最大，實(shí)現(xiàn)了槲皮素的選擇性檢測(cè)。初始熒光強(qiáng)度(I0)與待測(cè)物存在下的熒光強(qiáng)度(It)的比值I0/It-1與槲皮素濃度的線性呈現(xiàn)先快速增長(zhǎng)，再緩慢增長(zhǎng)最后達(dá)到飽和的趨勢(shì)。當(dāng)槲皮素濃度達(dá)5 μmol·L-1時(shí)，DSAZn的熒光幾乎被完全猝滅，此時(shí)Qc與DSAZn的摩爾比約為1∶2，說(shuō)明兩分子DSAZn配合物結(jié)合一分子Qc。此外，熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)五種藥物對(duì)DSAZn猝滅效果強(qiáng)弱為Qc>Ia>Ru>AI>DA。推測(cè)由于Qc有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可形成化合物配位鍵，且具有很強(qiáng)的給電子能力[6]，與DSAZn發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致DSAZn發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移，因此熒光猝滅較為完全。而Ru的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)被糖苷基取代，尺寸排阻作用較大。經(jīng)自由基清除法(DPPH)測(cè)定，Qc與Zn(Ⅱ)形成的配合物抗氧化效率(AE)是Ru與Zn(Ⅱ)形成的配合物抗氧化效率的20倍左右[17]。因此Ru對(duì)DSAZn的猝滅效果不如Qc。AI和Ia缺失鄰位酚羥基這一結(jié)構(gòu)，只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，據(jù)此推測(cè)它們與DSAZn的結(jié)合能力弱于Qc，猝滅效果也相應(yīng)減弱。如圖4(f)所示，當(dāng)濃度為5 μmol·L-1時(shí)，Qc的熒光變化幅度是其他藥物的6.5倍以上，此結(jié)果表明DSAZn探針對(duì)Qc具有選擇性。

圖4 DSAZn在緩沖溶液中的熒光光譜隨藥物Qc(a)，AI(b)，Ia(c)，Ru(d)，DA(e)加入的變化

如圖5所示(左上插圖為局部放大圖)，在Qc濃度逐漸增加過(guò)程中，550 nm處相對(duì)熒光強(qiáng)度(I0/It-1)與Qc濃度在0～5 μmol·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，重復(fù)性好。其線性擬合方程為y=0.013 4x-0.294 82，其相關(guān)系數(shù)r=0.994 3，表明本方法可用于Qc的定量檢測(cè)。采用檢測(cè)限的計(jì)算公式：MDL=3S0/S(S0為標(biāo)準(zhǔn)溶液平行多次檢測(cè)偏差，S為擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)。如表1所示，計(jì)算得Qc的檢測(cè)限(LOD)為3.07 nmol·L-1，低于表中文獻(xiàn)的參考值，說(shuō)明本方法有較高的靈敏度。

圖5 在pH 7.0 PBS緩沖液中，10 μmol·L-1 DSAZn溶液中分別加入5 μmol·L-1五種藥物后的相對(duì)熒光強(qiáng)度變化(I0/It-1)與藥物濃度的關(guān)系圖

表1 不同檢測(cè)方法檢測(cè)槲皮素的性能比較

2.2 槲皮素對(duì)DSAZn熒光猝滅機(jī)理及結(jié)合常數(shù)

槲皮素在255和375 nm有兩個(gè)吸收峰，415 nm處的吸收峰是DSAZn的特征峰。四種藥物與DSAZn相互作用的紫外吸收光譜圖見(jiàn)圖6。由圖6(a)可見(jiàn)，固定DSAZn的濃度，加入槲皮素后的復(fù)合物體系紫外圖譜與DSAZn的紫外圖譜不重合，隨槲皮素濃度逐漸增加，415 nm吸收峰強(qiáng)度降低，說(shuō)明槲皮素與DSAZn分子發(fā)生相互作用，從而引起DSAZn吸收光譜的改變，證明槲皮素對(duì)DSAZn的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅如圖6(b, c, d)所示，同理可得到AI，Ia, Ru對(duì)DSA Zn的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅。

圖6 DSAZn在緩沖溶液中的紫外-可見(jiàn)吸收光譜隨藥物Qc(a)，AI(b)，Ia(c)，Ru(d)加入的變化

對(duì)于靜態(tài)猝滅，熒光分子和猝滅劑結(jié)合形成不發(fā)光的基態(tài)配合物，根據(jù)Stern-Volmer方程[18]：F0/F=1+Kd[Q]計(jì)算結(jié)合常數(shù)。式中[M]0為熒光分子的總濃度，F(xiàn)0和F分別是DSAZn在無(wú)猝滅劑和有猝滅劑存在時(shí)的熒光強(qiáng)度，Kd為配合物的結(jié)合常數(shù)。如圖7所示，以F0/F對(duì)[Q]作圖擬合為一條直線，斜率為Kd。計(jì)算結(jié)果如圖7注所示，DSAZn和Qc的結(jié)合常數(shù)比其他四種和DSAZn的結(jié)合常數(shù)大一個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到1.34×107L·mol-1，進(jìn)一步證明了DSAZn和Qc能特異性結(jié)合。

圖7 五種藥物熒光猝滅DSAZn的Stern-Volmer圖

如圖8所示，槲皮素的吸收光譜與DSAZn的發(fā)射光譜不重疊，排除了熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)導(dǎo)致熒光猝滅的可能性。由于Qc是一種強(qiáng)富電子的芳香化合物，通常作為電子給體，推測(cè)熒光猝滅由電子轉(zhuǎn)移所引起，如圖9所示，Qc和AIE熒光分子DSAZn相互作用并結(jié)合為復(fù)合物時(shí)，發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移。

圖8 槲皮素的吸收光譜與DSAZn的發(fā)射光譜

圖9 DSAZn對(duì)Qc的熒光響應(yīng)示意圖

3 結(jié) 論

以水溶性有機(jī)分子DSAZn為熒光探針，通過(guò)配位作用識(shí)別靶標(biāo)分子槲皮素，并基于激發(fā)態(tài)電子轉(zhuǎn)移原理猝滅DSAZn的熒光，由此構(gòu)建了一種AIE型熒光分子對(duì)槲皮素的高靈敏度檢測(cè)方法。此檢測(cè)法對(duì)比了五種藥物分子：槲皮素(Qc)、淫羊藿素(AI)、異鼠李素(Ia)、蘆丁(Ru)、多巴胺(DA)對(duì)DSAZn的熒光響應(yīng)。采用紫外-可見(jiàn)吸收光譜法分析槲皮素和DSAZn的猝滅類(lèi)型以及結(jié)合機(jī)理。本方法具有靈敏度高、選擇性好、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，是一種有效測(cè)定槲皮素的分析手段。