基于網(wǎng)絡藥理學及分子對接探究胎元飲治療先兆流產(chǎn)的作用機制※

黎佩茹 林朗華 何思雅 潘美均 吳愛華,2 梁雪芳,3△

(1.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省中醫(yī)院生殖醫(yī)學科，廣東 廣州 510000；3.廣東省中醫(yī)院婦科，廣東 廣州 510000)

先兆流產(chǎn)是最常見的妊娠并發(fā)癥，發(fā)病率為15%～20%，并且發(fā)生率呈逐年上升趨勢[1-2]，對婦女的身體、心理健康造成嚴重影響。先兆流產(chǎn)若未得到及時治療，約10%～15%的患者可發(fā)展為難免流產(chǎn)[3]。先兆流產(chǎn)的病因復雜，涉及因素繁多，且其相關(guān)發(fā)病機制尚未完全闡明，西醫(yī)治療一般采用適當休息、禁止性生活，同時予人絨毛膜促性腺激素、孕激素等藥物治療[4]。先兆流產(chǎn)屬中醫(yī)學“胎漏”“胎動不安”范疇。中醫(yī)藥治療先兆流產(chǎn)臨床療效顯著，不良反應少[1]。中醫(yī)學認為，氣虛胎失所載，血虛胎失所養(yǎng)，氣血虛弱，沖任失養(yǎng)，胎氣不固，故見胎漏或胎動不安[5]，氣血虛弱是先兆流產(chǎn)的重要病機。胎元飲出自張景岳所著《景岳全書》，具有補氣養(yǎng)血、固腎安胎之功，主治氣血虛弱型胎漏、胎動不安，是中醫(yī)臨床治療先兆流產(chǎn)的經(jīng)典方劑[5-6]。

網(wǎng)絡藥理學對“藥物-成分-靶點-疾病”的相互作用關(guān)系進行分析，并對藥物的作用機制進行預測，為將中醫(yī)從經(jīng)驗醫(yī)學轉(zhuǎn)化為循證醫(yī)學體系提供了新的研究方法，是近年來中醫(yī)藥研究的新方法[7-8]。因此，本研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)對胎元飲治療先兆流產(chǎn)的主要活性成分及核心靶點等進行預測、分析，探討胎元飲治療先兆流產(chǎn)的作用機制，以為臨床推廣提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 胎元飲有效成分及相關(guān)作用靶點篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，https://tcmsp-e.com/)[9]，分別以胎元飲中的8味中藥“白芍”“白術(shù)”“陳皮”“當歸”“杜仲”“甘草”“人參”“熟地黃”為關(guān)鍵詞進行檢索，然后根據(jù)藥物藥動學特征[口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18]，篩選出胎元飲的有效活性成分及其作用的蛋白質(zhì)靶點，并根據(jù)目前已發(fā)表的文獻報道來補充未預測到的有效活性成分的已知靶點。然后利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)選取已被驗證的人類蛋白，將靶點進行標準化處理，以獲取基因名。

1.2 先兆流產(chǎn)相關(guān)靶點篩選 以“threatened abortion” “threatened miscarriage”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.com/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd)中檢索先兆流產(chǎn)的相關(guān)靶點，最后合并5個數(shù)據(jù)庫靶點，并刪除重復值，獲得先兆流產(chǎn)疾病相關(guān)靶點。

1.3 “藥物-疾病”交集靶點獲取 利用R語言(R i386 4.0.5)將胎元飲有效活性成分靶點與先兆流產(chǎn)疾病相關(guān)靶點取交集并繪制韋恩圖。

1.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構(gòu)建及分析 將以上步驟得到的藥物有效活性成分、有效活性成分對應的靶點、“藥物-疾病”交集靶點的數(shù)據(jù)整合，運用 Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖，并利用Cytoscape 3.7.2 軟件中“Network Analyzer”的功能，計算出不同節(jié)點的度(Degree)值，Degree值越大，節(jié)點面積越大，表示該節(jié)點的生物功能越重要。根據(jù) Degree 值由大到小排序，篩選前3位作為胎元飲的主要活性成分。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡構(gòu)建及分析 將“藥物-疾病”交集靶點提交至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡模型[10]，將生物種類設定為“Homo sapiens”，參數(shù)設置均為默認設置。將獲得的PPI網(wǎng)絡導入Cytoscape 3.7.2軟件繪制PPI網(wǎng)絡圖，并使用Cytoscape 3.7.2軟件中CytoNCA插件的初始網(wǎng)絡節(jié)點的中介中心性(betweenness centrality, BC)、緊密中心性(closeness centrality, CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality, EC)、度中心性(degree centrality，DC)、局部平均連通性(local average connectivity-based method, LAC)、網(wǎng)絡中心性(network centrality, NC)等拓撲學參數(shù)的中位數(shù)作為篩選依據(jù)進行1次篩選以精簡網(wǎng)絡。最后再利用Cytoscape 3.7.2軟件中的MCODE 1.6.1插件，根據(jù)該插件默認參數(shù) “degree cutoff ≥2, node score cutoff≥0.2,K-score≥2, maximum depth=100”得到不同的靶點團[11]，選取分數(shù)(score)最高的靶點團作為胎元飲治療先兆流產(chǎn)的核心靶點團。其中，MCODE score 可反映單個節(jié)點與其周圍節(jié)點的緊密程度[12]，將靶點團中MCODE score 排名前3的靶點作為胎元飲治療先兆流產(chǎn)的核心靶點。

1.6 “藥物-疾病”交集靶點基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 運用R語言(R i386 4.0.5)將“藥物-疾病”交集靶點的基因名轉(zhuǎn)換為Entrez ID，并將ClusterProfiler、DOSE、enrichplot等軟件包安裝至R軟件中，通過運行ClusterProfiler進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，按P值由小到大排序，分別篩選出排名前10的條目繪制GO功能富集分析氣泡圖，排名前30的通路制作KEGG通路富集分析條形圖。其中，GO功能包括生物過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)及分子功能(molecular function, MF)。

1.7 分子對接驗證 將篩選得到的胎元飲主要活性成分與PPI網(wǎng)絡分析得到的核心靶點進行分子對接驗證。首先從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載PPI網(wǎng)絡中核心靶點PDB格式的3D結(jié)構(gòu)，通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取主要活性成分的sdf結(jié)構(gòu)，并通過OpenBabel轉(zhuǎn)換成PDB文件；再運用AutoDock Tools 1.5.6軟件對蛋白質(zhì)靶點進行去水、加氫等操作，并將活性成分及靶蛋白格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式；最后通過 AutoDock Vina 進行分子對接，選取部分結(jié)合力較強結(jié)果利用Pymol軟件進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 胎元飲有效成分及其相關(guān)作用靶點 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共得到符合篩選標準的有效成分191個，其中白芍14個，白術(shù)7個，陳皮77個，當歸5個，杜仲41個，甘草103個，人參25個，熟地黃11個(有的成分同時存在于不同的藥物中)。將8味中藥有效成分的作用靶點合并、刪除重復值后共得到靶點307個。

2.2 先兆流產(chǎn)相關(guān)靶點 在GeneCards、DrugBank數(shù)據(jù)庫中分別檢索出1849、3個先兆流產(chǎn)相關(guān)靶點，OMIM、PharmGKB、TTD數(shù)據(jù)庫中未檢索到相關(guān)靶點。把上述數(shù)據(jù)庫的相關(guān)靶點匯總、去重后共得到1849個疾病靶點。

2.3 “藥物-疾病”交集靶點 將篩選的307個胎元飲有效成分作用靶點與先兆流產(chǎn)疾病靶點取交集，再通過R 語言繪制韋恩圖，得到“藥物-疾病”交集靶點162個，見圖 1。

圖1 “藥物-疾病”交集靶點韋恩圖

2.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構(gòu)建及分析 運用 Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建胎元飲與先兆流產(chǎn)之間的“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖，見圖2。根據(jù)Cytoscape 3.7.2中“Network Analyzer”計算的Degree值，排名前3位的分別為山柰酚(kaempferol)、木黃酮(genistein)、熊果酸(ursolic acid)，為主要活性成分。見表1。

表1 胎元飲的主要活性成分

圖2 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖

2.5 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建及分析 將“藥物-疾病”交集靶點提交至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，得到PPI網(wǎng)絡，再將得到的網(wǎng)絡數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2軟件進行網(wǎng)絡構(gòu)建，獲得初始PPI網(wǎng)絡圖(見圖3A)。初始PPI網(wǎng)絡由162個節(jié)點和2875條邊組成。經(jīng)CytoNCA插件進行拓撲學分析，得到由58個節(jié)點和1208條邊組成的精簡PPI網(wǎng)絡(見圖3B)。最終經(jīng) MCODE 1.6.1插件分析得到由48個節(jié)點和933條邊組成的核心靶點團(MCODE score為39.702)，在該靶點團中，MCODE score 排名前3的靶點分別為CC基序趨化因子2(C-C motif chemokine 2，CCL2)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶 8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)(見圖3C)，其 MCODE score 分別為 28.29、28.24 和27.99。

圖3 PPI網(wǎng)絡圖

2.6 “藥物-疾病”交集靶點GO功能和KEGG通路富集分析 運用R語言對162個交集靶點進行 GO 功能富集分析，共獲得2854個條目，其中BP 2524個，MF 131個，CC 199個。根據(jù)P值排序，篩選出排名前10的條目繪制氣泡圖(見圖4)。根據(jù)氣泡圖結(jié)果，可以推測出胎元飲治療先兆流產(chǎn)的BP主要涉及對脂多糖反應(response to lipopolysaccharide)、對類固醇激素的反應(response to steroid hormone)、肌肉細胞增殖(muscle cell proliferation)等；CC主要與膜筏(membrane raft)、膜微結(jié)構(gòu)域(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)等相關(guān)；MF主要涉及血紅素結(jié)合(heme binding)、四吡咯綁定(tetrapyrrole binding)、絲氨酸水解酶活性(serine hydrolase activity)。

注：縱坐標為富集條目，橫坐標為該 GO 的基因數(shù)占輸入總基因的比率，氣泡越大代表該 GO 的基因越多；顏色代表P值的大小，P值越小，顏色越紅，則表示富集程度越高

KEGG 通路富集分析可獲得183條代謝通路，按P值由小到大排序篩選出排名前30的通路繪制條形圖(見圖5)，剔除不相關(guān)通路，預測胎元飲可能通過白細胞介素17(IL-17)信號通路(IL-17 signaling pathway)、p53通路(p53 signaling pathway)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路(PI3K/Akt signaling pathway)等治療先兆流產(chǎn)。通過查閱文獻，PI3K/Akt信號通路可能是胎元飲治療先兆流產(chǎn)的主要作用途徑，信號通路見圖6。

注：縱坐標為通路名稱，橫坐標為富集基因數(shù)；P值代表富集的顯著性，P值越小，顏色越紅，則富集程度越高

圖6 PI3K/Akt信號通路圖

2.7 分子對接結(jié)果 參考文獻[13-14]數(shù)據(jù)，結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol認為可結(jié)合，≤-7.0 kcal/mol認為結(jié)合能力較強，即配體與受體具有較好的結(jié)合活性。若結(jié)合能>-5.0 kcal/mol認為結(jié)合能力較弱。本研究分子對接結(jié)果顯示，3個主要主要活性與3個核心靶點的結(jié)合能力整體較強，其中熊果酸與EGFR結(jié)合能為-9.4 kcal/mol，結(jié)合活性最高(見表2)。選擇各靶點對應成分結(jié)合能低且能形成氫鍵的對接組合進行繪圖。結(jié)果顯示，化學物配體均結(jié)合在靶蛋白的活性口袋內(nèi)且匹配良好。各核心靶點-主要活性成分分子對接模擬圖及對接位點見圖7。

表2 分子對接結(jié)果 kcal/mol

注：A為山柰酚-CCL2對接圖，B為木黃酮-CCL2對接圖，C為熊果酸-CCL2對接圖；D為山柰酚-EGFR對接圖，E為木黃酮-EGFR對接圖，F(xiàn)為熊果酸-EGFR對接圖；G為山柰酚-MAPK8對接圖，H為木黃酮-MAPK8對接圖，I為熊果酸-MAPK8對接圖

3 討論

多項臨床研究已表明，胎元飲治療先兆流產(chǎn)有較好的療效。有研究顯示，胎元飲治療氣血虛弱型先兆流產(chǎn)2周后的有效率可達98%，并且發(fā)現(xiàn)胎元飲可能通過調(diào)節(jié)氣血虛弱型先兆流產(chǎn)患者外周血IL-2、干擾素γ(IFN-γ)、IL-10及轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的表達發(fā)揮治療作用[15]。趙偉等[16]研究顯示，加味胎元飲配合黃體酮治療早期先兆流產(chǎn)的療效及血清β-人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)水平均優(yōu)于單用黃體酮治療(P<0.05)，由此可知加味胎元飲配合黃體酮治療先兆流產(chǎn)的效果優(yōu)于單獨應用黃體酮。

本研究結(jié)果顯示，初始PPI網(wǎng)絡有162種靶點，存在2875種作用關(guān)系，充分體現(xiàn)了中藥多靶點的作用特點。MCODE 1.6.1插件分析得到3個核心靶點，分別為CCL2、EGFR、MAPK8。免疫學認為，妊娠屬于一種特殊的同種異體移植，妊娠結(jié)局的關(guān)鍵在于母體與胚胎之間的免疫平衡。趨化因子參與反復自然流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展，其高表達會使妊娠維持，減少流產(chǎn)，在維持胎兒正常發(fā)育中有重要作用。CCL2是典型的炎性趨化因子，與免疫系統(tǒng)密切聯(lián)系，參與血管生成、炎性反應過程，其異常表達可使胚胎植入、形成障礙從而誘發(fā)流產(chǎn)[17-18]。一項關(guān)于CCL2與早期流產(chǎn)相關(guān)性的臨床研究亦證明了早孕母胎界面絨毛和蛻膜組織中可見CCL2的表達，CCL2高表達與早期流產(chǎn)的發(fā)病機制有關(guān)[19]。胎盤是維持胎兒生長發(fā)育的重要器官，具有物質(zhì)交換、防御、合成及免疫等功能。胎盤由羊膜、葉狀絨毛膜和底蛻膜構(gòu)成，其中葉狀絨毛膜是胎盤的主要結(jié)構(gòu)。生理狀態(tài)下，晚期囊胚著床之后，著床部位的滋養(yǎng)層細胞迅速分裂增殖。有研究報道，EGF及其受體在早期妊娠組織中表達下降，推測EGFR及其配體促進細胞增殖和分化的作用降低，從而使滋養(yǎng)細胞增殖、分化受到抑制，因此EGF調(diào)控HCG的生成及HCG維持黃體的作用受到抑制[20]。植枝福等[21]研究也證明了絨毛組織中EGFR的表達與絨毛血管生成狀況密切相關(guān)，EGFR低表達可導致絨毛血管形成障礙。輔助性T淋巴細胞(Th)在調(diào)節(jié)免疫反應中承擔著核心角色作用[22]。妊娠期間Th1細胞因子高表達，Th2細胞因子低表達，Th1/Th2細胞因子平衡偏向Th1可能與流產(chǎn)的發(fā)生相關(guān)[23]。MAPK8是Th細胞極化分化為Th1細胞必需的因子[24]，由此推測MAPK8與先兆流產(chǎn)存在著一定的聯(lián)系。分子對接驗證結(jié)果亦表明，山柰酚、木黃酮、熊果酸與核心靶點(CCL2、EGFR、MAPK8)的結(jié)合活性較強，因此胎元飲可能主要通過山柰酚、木黃酮、熊果酸等治療先兆流產(chǎn)。

GO功能富集分析顯示胎元飲治療先兆流產(chǎn)主要與脂多糖反應、對類固醇激素的反應、血紅素結(jié)合、絲氨酸水解酶活性等方面有關(guān)。KEGG通路富集分析顯示，壽胎丸治療先兆流產(chǎn)可能的信號通路為IL-17、p53、PI3K/Akt信號通路。細胞因子對于維持和協(xié)調(diào)人類孕期免疫細胞的正?；顒又陵P(guān)重要。IL-17是一種促炎細胞因子，主要由Th17細胞產(chǎn)生。關(guān)于人類母胎界面，有學者認為蛻膜細胞通過分泌CCL2來吸引Th17細胞，并通過分泌IL-17抑制人類滋養(yǎng)層細胞的凋亡，并誘導它們增殖并侵入蛻膜[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，血IL-17水平在健康妊娠中升高，但在自然流產(chǎn)中未表現(xiàn)升高，根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)推測IL-17為維持妊娠必不可少的調(diào)節(jié)細胞因子[26]。有研究在人類自然流產(chǎn)絨毛中發(fā)現(xiàn)，在促凋亡合胞體滋養(yǎng)層中觀察到細胞質(zhì)和頂膜上的層黏連蛋白受體表達增加，而這一過程最有可能是由p53介導的[27-28]。研究表明，p53信號通路功能異常及p53通路基因多態(tài)性的改變均可影響蛻膜化及妊娠結(jié)局[27]。相關(guān)文獻報道顯示，PI3K/Akt信號通路在細胞增殖和胚胎發(fā)育中扮演著重要角色[29]。若PI3K/Akt信號通路一旦受到抑制，可激活線粒體凋亡途徑，進而引起滋養(yǎng)細胞凋亡增加，最終導致分泌β-HCG和孕酮的功能降低，繼而可導致胎兒生長發(fā)育停止[30]。

綜上所述，本研究表明胎元飲治療先兆流產(chǎn)主要的活性成分可能為山柰酚、木黃酮、熊果酸等，這些活性成分通過作用于CCL2、EGFR、MAPK8等靶標以及調(diào)節(jié)IL-17、p53、PI3K/Akt等信號通路發(fā)揮治療作用，從而實現(xiàn)調(diào)節(jié)母體免疫狀態(tài)、促進滋養(yǎng)層細胞增殖等生物過程來維持妊娠，體現(xiàn)了胎元飲多通路、多靶點聯(lián)合作用的特點，為胎元飲治療先兆流產(chǎn)的臨床運用提供了科學依據(jù)，為后續(xù)挖掘其潛在作用機制提供了新角度。