柳葉臘梅葉黃酮類化合物對(duì)金黃色葡萄球菌攻毒小鼠的肝保護(hù)作用研究

周 歡，王文君

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045）

【研究意義】金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）可引起人類及動(dòng)物的皮膚和軟組織感染、肺炎、敗血癥和心內(nèi)膜炎等多種疾病，長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)致使其產(chǎn)生耐藥性[1-5]。抗生素耐藥性是一個(gè)不可避免的生物過程，嚴(yán)重威脅了全球農(nóng)業(yè)生計(jì)、糧食安全和人類健康[6-7]。因此，迫切需要開發(fā)新型抑菌劑以控制病原體引起的感染。【前人研究進(jìn)展】長(zhǎng)期以來，許多植物天然產(chǎn)物由于其獨(dú)特的化學(xué)特性和豐富的生物活性，能夠更有效地與生物目標(biāo)結(jié)合[8-9]，被用于治療疾病。Al-Awsi 等[10]研究了藥蜀葵甲醇提取物的抑菌活性，結(jié)果表明其富含黃酮類化合物，在體內(nèi)外均有抑菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌皮膚感染模型小鼠均有保護(hù)作用。Mordmuang 等[11]報(bào)道了毛桃葉乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的乳腺炎模型小鼠，可作為控制金黃色葡萄球菌天然抑菌劑。Liu 等[12]報(bào)道由桔梗和甘草組成的解更湯對(duì)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠具有保護(hù)作用，可顯著改善小鼠肺組織病理形態(tài)、減少肺部細(xì)菌負(fù)荷及抑制感染后24 h 炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。Wang 等[13]報(bào)道柳葉臘梅葉醇提物對(duì)3 種細(xì)菌和4 種真菌具有抑制作用，并且采用棋盤法證明其能與鏈霉素產(chǎn)生協(xié)同作用（ΣFIC≤0.38）。柳葉臘梅（Chimonanthus salicifoliusS.Y.Hu，F(xiàn)CS）種屬于臘梅屬，又稱黃金茶、香風(fēng)茶和食涼茶等，主要分布于江西三清山、浙江開化、淳安、湖南、湘西等地[14]。研究表明，柳葉臘梅含有多糖、黃酮、揮發(fā)油和生物堿等多種活性成分，以及香豆素類、脂肪酸、微量元素、氨基酸和維生素[15-18]等。其中，黃酮類化合物是柳葉臘梅葉的主要成分之一。黃酮類化合物具有抗氧化[7，15]、抑菌[7]、保肝[19-20]、抗癌[21]、抗炎[22-23]、降血糖[24]等多種功能作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】實(shí)驗(yàn)室前期的研究系統(tǒng)地闡述了柳葉臘梅葉黃酮類化合物的體外抑菌活性和作用機(jī)制[13，25]，但其在小鼠體內(nèi)是否有抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌感染引起的小鼠肝臟損傷是否有保護(hù)作用等問題仍有待研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以柳葉臘梅葉為原料，研究柳葉臘梅黃酮類化合物（flavonoids ofC.salicifolius，F(xiàn)CS）在金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的細(xì)菌感染小鼠體內(nèi)的肝保護(hù)作用，探討FCS 對(duì)食源性致病菌的體內(nèi)抑菌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

柳葉臘梅葉購(gòu)于中國(guó)浙江省麗水市。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、蛋白定量（BCA）測(cè)定盒、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所（中國(guó)南京）。ELISA 試劑盒（TNF-α、IL-6和IL-1β）購(gòu)于武漢博士德生物科技有限公司（中國(guó)武漢）。Luria Bertani 肉湯（LB）購(gòu)于青島希望生物科技有限公司（中國(guó)青島）。瓊脂粉購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司（中國(guó)北京）。其他所有使用的化學(xué)品和試劑均為分析級(jí)。

1.2 儀器和設(shè)備

5415D 小型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司），TGL-20000-cR 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。DE-1000gA型高速粉碎機(jī)（浙江紅景天工貿(mào)有限公司），HF-20B型超聲循環(huán)提取機(jī)（北京宏祥隆生物科技公司），RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），TSGP15D 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（賽默飛世爾科技公司），Scientz-10N型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），M2型酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Device 公司），MLS-3751L-PC 型高壓蒸汽滅菌鍋（日本松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社），SHP-160型生化培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司），TS-2102C型恒溫?fù)u床（上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司），HFsafe-1200LC型生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司），KZ-II高速組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為SPF 級(jí)雌性ICR 小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。小鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（23±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%，晝夜循環(huán)12 h/12 h，每天換水，隔天更換墊料，允許小鼠自由進(jìn)食。所有試驗(yàn)均嚴(yán)格按照中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)協(xié)會(huì)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南》進(jìn)行，并經(jīng)江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)（JXAUA01）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌株的培養(yǎng) 金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。首先，將金黃色葡萄球菌接種于LB 液體培養(yǎng)基中37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h。次日再接種到LB 固體培養(yǎng)基于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。隨后在培養(yǎng)基上挑選單菌落接種到LB肉湯中，37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h。將渾濁的菌懸液以3%的比例接種到新鮮LB肉湯中，培養(yǎng)1～3 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后取出。預(yù)試驗(yàn)時(shí)用分光光度計(jì)測(cè)得對(duì)數(shù)期的菌懸液OD600值約為0.5，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)得菌懸液濃度約為108CFU/mL。通過離心（4 ℃，12 000 r/min，5 min）收集對(duì)數(shù)期細(xì)菌，無菌生理鹽水洗滌3 次，然后用菌懸液1%體積的生理鹽水重懸得濃縮的金黃色葡萄球菌菌液（約1010CFU/mL）。取適量的菌懸液用生理鹽水梯度稀釋至所需濃度，用于后續(xù)試驗(yàn)。此外，取少量濃縮的菌懸液梯度稀釋后涂布平板，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3 個(gè)平行。平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，選取菌落數(shù)在30～300 CFU、無蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)，計(jì)算平均值并乘以稀釋倍數(shù)后可得攻毒菌懸液實(shí)際濃度。

1.4.2 FCS 的制備 FCS 的制備參照趙梓桐等[26]試驗(yàn)方法稍作修改。干燥的柳葉臘梅葉粉碎后過60 目篩，稱取1 kg 粉末于60%乙醇溶液中浸泡過夜。超聲輔助提取2 次，合并濾液。超聲提取條件為∶料液比1∶20（g/mL），超聲時(shí)間60 min，超聲功率1 500 W，超聲溫度55 ℃。所得濾液經(jīng)過抽濾、離心、減壓濃縮和冷凍干燥后得到柳葉臘梅葉粗提物粉末。將得到的粗提物粉末用蒸餾水復(fù)溶，經(jīng)D1400 大孔樹脂層析柱分離純化。先用蒸餾水洗至流出液接近無色，再用40%乙醇溶液洗脫。將40%乙醇洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，冷凍干燥，所得粉末被定義為柳葉臘梅葉黃酮類化合物（FCS）。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉為顯色體系，利用分光光度法定量[27]測(cè)得FCS總黃酮百分含量為（84.2±2.0）%。

1.4.3 金黃色葡萄球菌半數(shù)致死劑量的測(cè)定 為得到可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50%死亡的菌濃度，即半數(shù)致死劑量（50% lethal dose，LD50），將60 只小鼠隨機(jī)分為6 組，每組10 只。對(duì)各組小鼠腹腔注射新鮮制備的菌懸液進(jìn)行攻毒，濃度分別為2.9×105CFU/mL、2.9×106CFU/mL、2.9×107CFU/mL、2.9×108CFU/mL、2.9×109CFU/mL、2.9×1010CFU/mL，注射劑量為每只0.5 mL。觀察小鼠外觀及精神狀態(tài)，并統(tǒng)計(jì)24 h 內(nèi)生存情況計(jì)算存活率，得到金黃色葡萄球菌半數(shù)致死劑量（LD50）進(jìn)行以下試驗(yàn)。

1.4.4 LD50金黃色葡萄球菌攻毒小鼠模型 取50 只小鼠隨機(jī)分為5 組（每組10 只）：正常組（NC），模型組（MC），F(xiàn)CS 低劑量組（FCS-L，100 mg/kg/d），F(xiàn)CS 中劑量組（FCS-M，200 mg/kg/d），F(xiàn)CS 高劑量組（FCS-H，400 mg/kg/d）。NC 組和MC 組灌胃生理鹽水，F(xiàn)CS 組灌胃相應(yīng)濃度的FCS，灌胃劑量為每只0.2 mL，灌胃頻率為每天1 次。連續(xù)灌胃14 d 后，NC 組小鼠腹腔注射0.5 mL 生理鹽水，其余4 組小鼠腹腔注射0.5 mL LD50金黃色葡萄球菌（2.9×108CFU/mL）建立小鼠細(xì)菌感染模型。次日各組小鼠繼續(xù)灌胃生理鹽水或FCS，持續(xù)4 d。觀察小鼠存活情況并計(jì)算存活率，4 d 后仍存活的小鼠眼眶取血后頸部脫臼致死，迅速取出肝臟、腎臟和脾臟等器官于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 體質(zhì)量和臟器指數(shù)測(cè)定 腹腔注射金黃色葡萄球菌后，每天稱量并記錄各組小鼠體質(zhì)量。將解剖取出的動(dòng)物器官（肝、腎、脾）用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸水后稱重記錄，臟器指數(shù)=小鼠器官質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%。

1.4.6 肝功能轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST含量測(cè)定 通過眼球采血法收集小鼠血液，室溫靜置1 h后在4 °C下以3 500 r/min離心15 min，取上清液保存于-80 °C備用。根據(jù)試劑盒說明書測(cè)定血清ALT和AST水平。

1.4.7 肝臟中SOD、CAT、GSH-Px、MDA 含量測(cè)定 肝臟組織與事先預(yù)冷的生理鹽水按1∶9（w/v）混合，高速組織研磨儀勻漿。將勻漿好的肝臟組織在4 ℃下以2 500 r/min 離心10 min，取上清液保存于-80 ℃?zhèn)溆?。根?jù)樣品數(shù)量，依照BCA 試劑盒說明書指示配制適量BCA 工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。在96 微孔板中分別加入10 μL蒸餾水、10 μL 524 μg/mL 蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、10 μL待測(cè)樣品，然后每孔加入250 μL BCA 工作液，混勻。將96微孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm處吸光度值。根據(jù)BCA試劑盒說明書計(jì)算樣品蛋白濃度，將各樣品蛋白濃度調(diào)整至一致。采用試劑盒檢測(cè)樣品SOD、CAT、GSHPx和MDA含量。

1.4.8 肝臟細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 測(cè)定 10%肝勻漿制備方法同1.4.7，通過離心（2 500 r/min，10 min）分離得上清液，采用BCA 法將各組樣品蛋白濃度調(diào)整一致。按照ELISA 試劑盒說明書，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定樣品適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。正式試驗(yàn)時(shí)，先將樣品適當(dāng)稀釋，按照試劑盒說明書構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)每個(gè)樣品的OD 值計(jì)算相應(yīng)的細(xì)胞因子含量。細(xì)胞因子含量乘以樣品稀釋倍數(shù)即得肝臟組織樣品實(shí)際的TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

1.4.9 肝臟H&E染色 剪取適量肝臟用無菌生理鹽水沖洗干凈，固定在4%多聚甲醛溶液中24 h。依次用70 %、80%、85%、90%、95%、100%梯度乙醇脫水，滲透并用石蠟包埋。然后，將組織切片后用蘇木素和伊紅（H&E）染色，用無水乙醇和二甲苯脫水封片，最后使用顯微鏡（Nikon Eclipse E100，日本）觀察組織病理學(xué)變化。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析使用IBM SPSS Statistics 25 軟件，組間統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間差異采用最小顯著性差異（LSD）檢驗(yàn)，#P表示與NC 組相比具有顯著性差異（P＜0.05），*P表示與MC組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌攻毒劑量的測(cè)定

腹腔注射不同濃度金黃色葡萄球菌攻毒小鼠，各組小鼠呈現(xiàn)不同的生理特征。低劑量攻毒組（2.9×105CFU/mL）小鼠無明顯變化，中劑量攻毒組（2.9×106CFU/mL 和2.9×107CFU/mL）小鼠活力下降、發(fā)抖、嗜睡和聚集，2 d后生理狀態(tài)逐漸恢復(fù)正常。高劑量攻毒組（2.9×108、2.9×109和2.9×1010CFU/mL）小鼠毛發(fā)蓬亂，眼瞼分泌膿液，肛周腫脹，甚至死亡，且小鼠的死亡發(fā)生在24 h 內(nèi)。如圖1A 所示，2.9×105、2.9×106和2.9×107CFU/mL 金黃色葡萄球菌攻毒組無小鼠死亡，2.9×108、2.9×109和2.9×1010CFU/mL 金黃色葡萄球菌攻毒組小鼠死亡率分別為50%、90%和100%。結(jié)果表明金黃色葡萄球菌引起小鼠劑量依賴性死亡，半數(shù)致死劑量（LD50）為2.9×108CFU/mL。

2.2 LD50金黃色葡萄球菌感染小鼠模型

為確定使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物半數(shù)死亡的菌懸液濃度，進(jìn)行了金黃色葡萄球菌攻毒劑量試驗(yàn)，結(jié)果表明半數(shù)致死劑量LD50為2.9×108CFU/mL。通過腹腔注射0.5 mL LD50金黃色葡萄球菌懸液建立小鼠細(xì)菌感染模型，觀察小鼠存活情況。小鼠存活率如圖1B 所示，NC 組無小鼠死亡，MC 組小鼠在腹腔注射金黃色葡萄球菌后第6 h 死亡率達(dá)40%。這表現(xiàn)了金黃色葡萄球菌毒力的同時(shí)也進(jìn)一步反應(yīng)了模型建立成功。攻毒4 d 后，MC 組小鼠存活率為60%。FCS-L、FCS-M 和FCS-H 組小鼠存活率分別為40%、70%和90%，結(jié)果表明中高劑量FCS可提高金黃色葡萄球菌小鼠的存活率。

圖1 FCS對(duì)小鼠存活率的影響（n=10）Fig.1 Effects of FCS on the survival rate of mice（n=10）

2.3 FCS對(duì)小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的作用

小鼠體質(zhì)量變化如表1所示。攻毒4 d后，NC組小鼠體質(zhì)量增加了1.03 g，而MC組小鼠體質(zhì)量下降了3.42 g，提示腹腔注射金黃色葡萄球菌導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量降低。此外，F(xiàn)CS-L 和FCS-M 組小鼠體質(zhì)量分別下降了0.7 g 和0.4 g，表明低、中劑量的FCS 可緩解金黃色葡萄球菌引起的體質(zhì)量下降。同時(shí)，F(xiàn)CS-H 組小鼠在攻毒4 d后增加了0.12 g，說明高劑量FCS能有效地逆轉(zhuǎn)金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的體質(zhì)量下降趨勢(shì)。小鼠臟器指數(shù)如表1 所示，NC 組小鼠的器官指數(shù)（肝、腎、脾）最低。攻毒金黃色葡萄球菌后，MC 組小鼠的器官指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。與MC 組相比，F(xiàn)CS-L 組、FCS-M 組、FCS-H 組的肝指數(shù)分別降低了3.21%、11.23%、14.62%，并且MC 組、FCS-L 組和FCS-M 組的肝指數(shù)與NC 組存在極顯著差異（P＜0.01），而FCS-H 組肝指數(shù)與NC 組僅存在顯著差異（P＜0.05）。與NC 組相比，MC 組小鼠腎指數(shù)上升了0.59%，存在顯著性差異（P＜0.05）。經(jīng)FCS 處理后，F(xiàn)CS 各劑量組小鼠腎指數(shù)與NC 組都不存在顯著性差異（P＞0.05）。此外，F(xiàn)CS處理組小鼠脾指數(shù)有輕微降低的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 FCS對(duì)小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的作用Tab.1 Effects of FCS on body weight and organ index in mice

2.4 FCS對(duì)小鼠肝功能轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST的作用

小鼠肝功能轉(zhuǎn)氨酶ALT 和AST 含量如圖2A-B 所示。與NC 組相比，金黃色葡萄球菌攻毒后，MC 組小鼠血清中ALT 含量顯著增加（P＜0.05）。經(jīng)FCS處理后，F(xiàn)CS-L、FCS-M 和FCS-H 組小鼠ALT 含量分別下降29.62%、59.89%和65.76%，與MC 組差異顯著（P＜0.001）。此外，與NC 組相比，MC 組小鼠AST 含量增加了109.27%，具有顯著性差異（P＜0.05）。經(jīng)低、中、高劑量FCS 處理的小鼠AST 含量與MC 組比較分別下降22.64%、9.09%、48.57%，其中FCS-H 組AST含量顯著低于MC組（P＜0.05），且與NC組相近。結(jié)果表明FCS可抑制金黃色葡萄球菌攻毒導(dǎo)致的小鼠血清ALT和AST含量上升，且高劑量FCS效果最佳。

2.5 FCS對(duì)小鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px、MDA的作用

小鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、CAT、GSH-Px、MDA 測(cè)定結(jié)果如圖2C-F 所示。與NC 組相比，小鼠經(jīng)腹腔注射金黃色葡萄球菌攻毒后，MC組小鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px含量顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.001）。與MC 組相比，F(xiàn)CS-M 和FCS-H 組小鼠SOD 含量顯著增加（P＜0.05），F(xiàn)CS-L 組小鼠SOD 含量增加但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)100，200，400 mg/kg/d FCS 處理后，CAT 含量分別增加78.8%、113.18%和113.51%，與MC 組差異顯著（P＜0.05）。且MC 組和FCS-L 組CAT 含量顯著低于NC 組，經(jīng)中、高劑量FCS 處理的小鼠CAT 含量與NC 組相近，無顯著性差異。此外，與MC 組相比，F(xiàn)CS-L、FCS-M、FCS-H 組小鼠的GSH-Px 含量分別增加8.2%，15.1%和18.82%，與MC 組相比，MDA 含量分別減少28.53%、21.61%和33.52%。數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)CS 可增加金黃色葡萄球菌感染小鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px 含量并抑制MDA 含量升高。結(jié)果表明FCS 通過調(diào)整肝臟氧化應(yīng)激水平以保護(hù)小鼠免受金黃色葡萄球菌攻毒導(dǎo)致的傷害。

2.6 FCS對(duì)小鼠肝臟TNF-α、IL-6和IL-1β的作用

小鼠肝臟中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平變化如圖2G-I 所示。腹腔注射金黃色葡萄球菌后，MC組小鼠肝臟TNF-α、IL-6和IL-1β含量均升高，且與NC組差異顯著（P＜0.05）。給予400 mg/kg/d FCS 灌胃后，肝臟TNF-α（88.05 pg/mL）、IL-6（159.47 pg/mL）和IL-1β（83.72 pg/mL）濃度分別降低了50.90%、22.80%和26.16%，與MC 組差異顯著（P＜0.05）。灌胃低、中、高劑量FCS 的小鼠肝臟TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量均下調(diào)，且呈濃度依賴性關(guān)系。其中FCS-H 組的TNF-α 含量與NC 組差異不顯著，并且FCS-M、FCS-H 組小鼠的IL-6 和IL-1β 含量與NC 組相近，差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明FCS可抑制金黃色葡萄球菌攻毒導(dǎo)致的炎癥細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6 和IL-1β）含量增加，從而減輕小鼠炎癥反應(yīng)。

2.7 FCS對(duì)小鼠肝臟的保護(hù)作用

肝臟組織學(xué)觀察結(jié)果如圖3 所示，NC 組小鼠肝臟細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)完整，無病理改變。腹腔注射金黃色葡萄球菌后，MC 組小鼠肝臟組織出現(xiàn)明顯的炎癥表現(xiàn)，包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管淤血、細(xì)胞核破碎甚至部分溶解等。經(jīng)FCS 灌胃小鼠的肝臟組織的炎癥病理變化減輕，并且400 mg/kg/d 的FCS 對(duì)小鼠表現(xiàn)出顯著的保護(hù)作用，其肝臟外觀正常，細(xì)胞質(zhì)保存完好，細(xì)胞排列緊密整齊，細(xì)胞核突出，核仁可見，表明FCS 具有良好的肝保護(hù)作用。這說明肝臟H&E 染色的組織病理學(xué)觀察與生化分析的結(jié)果一致。

圖3 FCS對(duì)LD50金黃色葡萄球菌感染小鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)的影響（400×）Fig.3 Effects of FCS on pathological physiology of liver in mice infected by LD50 S.aureus（400×）

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明柳葉臘梅葉黃酮類化合物在體外對(duì)多種細(xì)菌和真菌（如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、青霉菌和黑曲霉等）均有一定程度的抑菌活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好[13，25]。金黃色葡萄球菌是主要的革蘭氏陽性菌，屬于兼性病原體，可以在人和動(dòng)物中引發(fā)多種感染疾病。長(zhǎng)期使用抗生素期間可產(chǎn)生耐藥性，并對(duì)抑菌藥物具有廣泛的耐藥性[28]。因此，以金黃色葡萄球菌作為指示菌，研究柳葉臘梅葉黃酮類化合物FCS在動(dòng)物體內(nèi)的抑菌活性，為FCS作為一種新型抑菌劑提供理論依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的小鼠細(xì)菌感染，可在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致小鼠死亡，且灌胃給藥需較長(zhǎng)時(shí)間通過消化道進(jìn)入血液。因此，為評(píng)價(jià)FCS 在金黃色葡萄球誘導(dǎo)小鼠感染模型中是否能發(fā)揮抑菌作用，本試驗(yàn)選擇在感染前14 d開始給藥。為確定使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物半數(shù)死亡的菌懸液濃度，進(jìn)行了金黃色葡萄球菌攻毒劑量試驗(yàn)。結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌使小鼠劑量依賴性死亡，且半數(shù)致死劑量LD50為2.9×108CFU/mL。在LD50金黃色葡萄球菌感染模型中，MC 組小鼠存活率為60%，經(jīng)中、高劑量FCS 灌胃的小鼠存活率提高，分別為70%和90%，表明FCS 對(duì)小鼠的保護(hù)作用。而FCS-L 組的存活率低于MC組，這可能是小鼠個(gè)體的差異及試驗(yàn)隨機(jī)誤差造成的。

試驗(yàn)中通常用感染期間的體質(zhì)量變化來衡量疾病嚴(yán)重程度。此外，動(dòng)物被細(xì)菌感染后，受損器官的重量可能會(huì)發(fā)生改變，器官指數(shù)也會(huì)隨之改變。試驗(yàn)結(jié)果顯示FCS 可減輕金黃色葡萄球菌攻毒小鼠的體質(zhì)量下降，以及緩解小鼠的肝、腎、脾臟器指數(shù)的上升，說明FCS對(duì)腹腔注射金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的細(xì)菌感染小鼠有一定的保護(hù)作用。

肝細(xì)胞合成了體內(nèi)大部分的血清蛋白，因此，血清中肝細(xì)胞蛋白水平構(gòu)成了反映系統(tǒng)過程和肝臟狀態(tài)的重要生物標(biāo)志物[29]。血清中ALT 和AST 水平的高低是臨床監(jiān)測(cè)肝損傷的重要指標(biāo)，當(dāng)肝損傷發(fā)生時(shí)，它們能從肝細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)[30-31]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，MC 組小鼠血清內(nèi)ALT 和AST 的水平與NC 組相比顯著上升，表明細(xì)菌感染引起小鼠肝臟損傷。然而FCS 組小鼠血清內(nèi)ALT 和AST 水平與MC 組小鼠相比顯著降低，與NC 組無顯著性差異，表明FCS 可以增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，保持肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。

氧化應(yīng)激是許多疾病發(fā)病的罪魁禍?zhǔn)譡32]，肝臟中的氧化應(yīng)激會(huì)直接損害動(dòng)物的生產(chǎn)性能[32-33]。為確定FCS 對(duì)抗氧化防御的作用測(cè)定了肝臟抗氧化指標(biāo)。結(jié)果顯示，腹腔注射金黃色葡萄球菌后小鼠肝臟SOD、CAT和GSH-Px含量顯著降低，MDA含量顯著升高。FCS-M、FCS-H組小鼠肝臟SOD、CAT和GSHPx 含量均顯著高于MC 組，說明FCS 能夠通過提高小鼠肝臟內(nèi)的SOD、CAT 和GSH-Px 活性緩解氧化應(yīng)激。此外，F(xiàn)CS組MDA 水平均顯著低于MC 組，且FCS-H 組與NC 組無顯著差異，說明FCS能夠降低感染小鼠肝臟內(nèi)氧化水平。

細(xì)菌進(jìn)入體內(nèi)后可觸發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫系統(tǒng)異常激活，產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β 等，這也是衡量動(dòng)物疾病發(fā)生和器官損傷的常用指標(biāo)[34-35]。TNF-α 可加速中性粒細(xì)胞遷移，促進(jìn)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生蛋白水解酶和ROS，并可導(dǎo)致肝損傷[36]。此外，IL-6 和IL-1β 在肝損傷的積累中起重要作用，其水平升高可導(dǎo)致一些炎癥性疾病和惡性腫瘤[37]。一方面，這些細(xì)胞因子可以局部作用于免疫組織以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。另一方面，它們可以系統(tǒng)地作用于大腦、肝臟、脂肪和骨骼肌，改變機(jī)體激素水平，導(dǎo)致免疫應(yīng)激，導(dǎo)致動(dòng)物采食量下降、生長(zhǎng)緩慢和亞健康[38]。肝臟中炎癥細(xì)胞因子結(jié)果顯示，腹腔注射金黃色葡萄球菌攻毒后，小鼠肝臟的TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量顯著升高，與NC 組差異顯著。與MC 組相比，F(xiàn)CS 組小鼠的TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量顯著降低。因此，這表明FCS 可能通過免疫調(diào)節(jié)功能以濃度依賴性方式下調(diào)炎癥細(xì)胞因子，保護(hù)機(jī)體防止過度系統(tǒng)性炎癥造成的損傷。

肝臟作為重要的免疫器官，能幫助清除體內(nèi)病原菌，在抵御感染過程中發(fā)揮作用。研究表明，黃酮類化合物具有極高的生物活性，對(duì)肝臟能起到良好的保護(hù)作用[19-20]。因此對(duì)肝臟進(jìn)行了組織學(xué)檢查，研究FCS 對(duì)肝臟器官損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明肝組織病理程度有所緩解，這也與以上試驗(yàn)結(jié)果保持一致。

綜上所述，本研究首次報(bào)道了FCS 對(duì)金黃色葡萄球菌的體內(nèi)抑菌活性。結(jié)果表明FCS 可提高細(xì)菌感染小鼠的存活率，減輕病理狀態(tài)和器官損傷，緩解肝臟氧化應(yīng)激，下調(diào)肝臟炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α 的分泌。研究證實(shí)了FCS 對(duì)感染金黃色葡萄球菌小鼠具有肝保護(hù)作用，表明FCS 對(duì)金黃色葡萄球菌具有良好的體內(nèi)抑菌活性，有潛力作為一種新型抑菌劑應(yīng)用于金黃色葡萄球菌引起的疾病，有利于提高柳葉臘梅的利用率。

致謝：江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳牛羊產(chǎn)業(yè)體系專項(xiàng)資金（JXARS-13）和江西農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生創(chuàng)新專項(xiàng)基金項(xiàng)目（NDYC2020-S013）同時(shí)對(duì)本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！