纖維素分解酶對鳳梨渣青貯品質(zhì)及干物質(zhì)降解率的影響

王志敬，吳征敏，尹福泉*，譚偉軍，高振華，趙志輝

（1.廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524000；2.廣東省清遠(yuǎn)市動物疫病預(yù)防控制中心，廣東 清遠(yuǎn) 511518）

【研究意義】鳳梨（Ananas comosus）渣是指鳳梨加工過程中產(chǎn)生的包括鳳梨果皮、花萼、葉片等不可食用部分，直接丟棄不僅對生態(tài)環(huán)境造成負(fù)面影響，而且也是對資源的一種浪費(fèi)，如果能通過加工將其用作動物飼料對于發(fā)展環(huán)境友好型畜牧業(yè)、減少飼料用糧具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】新鮮鳳梨渣因含有甙類物質(zhì)和菠蘿蛋白酶等物質(zhì)，不能直接飼喂動物，國內(nèi)外研究表明鳳梨渣經(jīng)青貯[1-2]或者脫水[3]處理后可消除甙類物質(zhì)和菠蘿蛋白酶等物質(zhì)，將其作為常規(guī)青貯飼料替代品飼喂動物，對動物無不良影響[4]，同時可以改善動物的生產(chǎn)性能[5]和胃腸道生理狀態(tài)[6]。青貯改良劑不僅可以改善青貯飼料的青貯品質(zhì)，而且可以提高動物生產(chǎn)性能和養(yǎng)分利用率[7-15]，研究表明，添加纖維素分解酶可以提高莧菜青貯飼料的青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性[7]，在桑葉[8,15]、狼尾草[10]、稻草[12,14]、構(gòu)樹葉[13]等青貯飼料中添加纖維素分解酶可提高CP、降低NH3-N/TN，提高青貯品質(zhì)和養(yǎng)分利用率?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鳳梨渣經(jīng)處理后可作為畜禽飼料優(yōu)良替代品，纖維素分解酶可以顯著改良青貯飼料的青貯品質(zhì)和養(yǎng)分利用效率。但是，關(guān)于纖維素分解酶對青貯鳳梨渣飼料青貯品質(zhì)改良方面的研究較為鮮見。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究分析纖維素分解酶不同添加比例對鳳梨渣青貯品質(zhì)及干物質(zhì)降解率的影響，從而為鳳梨渣的科學(xué)利用提供更多參考資料。

1 材料與方法

1.1 鳳梨渣青貯試驗(yàn)

1.1.1 試驗(yàn)材料 鳳梨渣：取自湛江某菠蘿罐頭加工廠，新鮮鳳梨渣切成1.5 cm 左右大小后風(fēng)干至水分含量為65%～70%。干物質(zhì)、粗灰分、粗蛋白、粗纖維、中洗纖維、酸洗纖維、鈣、磷含量（風(fēng)干基礎(chǔ)）分別為：92.43、6.18、10.13、15.9、46.52、21.71、0.28、0.16。

纖維素分解酶：系采用里氏木霉菌種（Trichoderma reeasei）進(jìn)行深層培養(yǎng)，然后將發(fā)酵液過濾除菌精制而成，成品酶活力為（1.5±0.5）萬u/g（在37 ℃，pH為5.5的條件下，每分鐘從濃度為4 mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放1 μmol 還原糖所需要的酶量為1 個酶活力單位），是多組分的酶系，除纖維素分解酶外，還含有半纖維素分解酶，β-1，4-葡娶糖酶，木聚糖酶，纖維二糖酶等成分。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)置對照組（Ⅰ組）和纖維素分解酶處理組（Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組），纖維素分解酶添加量分別為1 500，3 000，6 000 u/kg，按每1 000 cm31 kg 填充于真空袋中，用真空泵（真空度：-60 KPa）自動抽真空封口，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)6包。常溫青貯（第二季度，室內(nèi)平均氣溫為26.5 ℃）4周，隨機(jī)選擇3包混合均勻后取鳳梨渣青貯鮮樣10 g+90 mL超純水4 °C存放24 h后取濾液測定pH、有機(jī)酸，剩余樣品先在105 °C微生物滅活30 min，再65 °C烘至恒重后測定常規(guī)養(yǎng)分指標(biāo)和干物質(zhì)降解率。

1.2 體外發(fā)酵試驗(yàn)

1.2.1 發(fā)酵液的制備 將人工唾液（參照王志敬[16]方法配制）和瘤胃液按9∶1 比例（體積比）混合制取。瘤胃液取晨飼前的黑山羊（采集前禁食12 h，禁水4 h）瘤胃液經(jīng)四層醫(yī)用紗布過濾后制得，期間注意保溫（39.0±0.5）°C并持續(xù)通入CO2。

1.2.2 體外發(fā)酵培養(yǎng) 首先稱取1.25 g 風(fēng)干鳳梨渣青貯飼料無損轉(zhuǎn)移至200 mL 玻璃培養(yǎng)瓶中，迅速加入70 mL 1.2.1 配制的發(fā)酵液（期間不斷往發(fā)酵瓶內(nèi)充入CO2，確保培養(yǎng)瓶內(nèi)無氧氣），用橡膠塞封口后置于（39.0±0.5）°C的恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，分別培養(yǎng)2，4，6，9，12，24，48，72 h，每組重復(fù)3次。

1.3 測定指標(biāo)與方法

干物質(zhì)（dry matter，DM）參照GB/T 6435-1986；粗蛋白（crude protein，CP）參照GB/T 6432—2018；粗纖維（crude fiber，CF）參照GB/T 6434—2006；粗灰分（crude ash，Ash）參照GB/T 6438—1992；中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）參照GB/T 20806—2006；酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）參照NY/T 1459—2007；鈣（calcium，Ca）參照GB/T 6436—2018；磷（phosphorus，P）參照GB/T 6437—2018；pH、有機(jī)酸、氨態(tài)氮（Ammonia nitrogen，NH3-N）參照DB15/T 1458—2018；可溶性多糖（water soluble carbohydrates，WSC）采用蒽酮比色法；亞硝酸鹽參照GB 13085—1991方法測定。

1.4 計(jì)算公式

1.4.1 干物質(zhì)降解率（dry matter degradation Rate，DMD）的計(jì)算：

1.4.2 相對飼喂價值（relative feed value，RFV）的計(jì)算：

式（2）（3）（4）中：DMI（dry matter intake）為青貯飼料DM的隨意采食量（%）；DDM（digestible dry matter）為可消化干物質(zhì)含量（%）；1.29為盛花期紫花苜蓿的DMI×DDM；RFV為相對一特定標(biāo)準(zhǔn)牧草[紫花苜蓿（Medicago sativa）]，某種牧草可消化干物質(zhì)的采食量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019初步整理后，用SPSS 19.0軟件中One-Way ANOVA（單因素方差分析）、GLM Repeated Measure（重復(fù)測量方差分析）、Analyze-correlate-bivariate（雙變量）進(jìn)行處理，多重比較用Duncan 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同纖維素分解酶添加量對鳳梨渣青貯品質(zhì)的影響

由表1 可知，Ⅱ組DM 含量顯著低于其他組別（P＜0.05）；各組間粗灰分（crude ash，Ash）、鈣（calcium，Ca）、磷（phosphorus，P）差異不顯著（P＞0.05）；Ⅳ亞硝酸鹽含量顯著高于其他組別（P＜0.05），Ⅱ組亞硝酸鹽含量最低；Ⅱ組可溶性多糖（water soluble carbohydrates，WSC）含量顯著高于其他組別（P＜0.05）；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組粗蛋白質(zhì)（crude protein，CP）顯著高于Ⅰ組（P＜0.05），分別較Ⅰ組提高13.86%、19.45%、13.58%；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組NH3-N 和NH3-N/TN 均顯著低于Ⅰ組（P＜0.05），分別較Ⅰ組降低11.69%、29.87%、24.68%和22.54%、41.97%、33.81%；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組乳酸（lactic acid，LA），總揮發(fā)性脂肪酸（total volatile fatty acids，TVFA），乳酸與總揮發(fā)性脂肪酸比值（LA/TVFA）均顯著（P＜0.05）高于Ⅰ組，分別較Ⅰ組提高21.79%、20.10%、33.83%，17.83%、14.96%、25.69%，3.17%、4.36%、6.33；乙酸（acetic acid，AA），丙酸（propionic acid，PA）均高于Ⅰ組，分別較Ⅰ組提高11.86%、7.28%、13.38%，15.28%、8.20%、23.91%。

表1 不同纖維素分解酶添加量對鳳梨渣青貯品質(zhì)的影響Tab.1 Effects of different amounts of cellulase on the quality of pineapple residue silage

2.2 不同纖維素分解酶添加量對青貯鳳梨渣纖維物質(zhì)和相對飼喂價值的影響

由表2 可知，纖維素分解酶添加組的pH 均小于對照組（P＞0.05），分別較對照組低0.93%、0.47%、0.47%；纖維素分解酶添加組粗纖維（crude fiber，CF）含量均低于對照組（P＞0.05），分別較Ⅰ組降低5.22%、3.60%、2.17%；纖維素分解酶添加組的中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）含量均顯著低于對照組（P＜0.05），分別較Ⅰ組降低2.53%、3.72%、3.72%；纖維素分解酶添加組的酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量均高于對照組（P＞0.05），NDF 含量差異水平達(dá)到顯著水平（P＜0.05），但是纖維素分解酶添加組組間差異不顯著（P＞0.05）；纖維素分解酶添加組的相對飼喂價值（relative feed value，RFV）均高于對照組（P＞0.05），Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的RFV較對照組分別提高2.35%、2.85%、3.52%。

表2 不同纖維素分解酶添加量對青貯鳳梨渣纖維物質(zhì)和相對飼喂價值的影響Tab.2 Effects of different amounts of cellulase added on the fiber matter and relative feeding value of silage pineapple residue

2.3 發(fā)酵時間、纖維素分解酶添加量對青貯鳳梨渣干物質(zhì)降解率的影響

由表3 和表4 可知，纖維素分解酶添加水平的F=10.703，P=0.000＜0.01，表明纖維素分解酶添加水平對干物質(zhì)降解率（dry matter degradation rate，DMD）的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；發(fā)酵時間的F=1 688.167，P=0.000＜0.01，表明瘤胃發(fā)酵時間對DMD 的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。由表4可知，瘤胃發(fā)酵時間對DMD 影響顯著，且隨著發(fā)酵時間的增加DMD 逐步增加，發(fā)酵24 h 時達(dá)到高峰期；發(fā)酵4 h 時，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的DMD 顯著高于對照組（P＜0.05）；發(fā)酵6 h，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的DMD 均高于對照組，Ⅲ組最高，顯著高于Ⅰ組（P＜0.05）；發(fā)酵6 h，Ⅳ組的DMD 顯著高于對照組（P＜0.05），Ⅱ、Ⅳ組次之，Ⅰ組最低。

表3 發(fā)酵時間、纖維素分解酶添加量對干物質(zhì)降解率影響的方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis of variance results of the effect of fermentation time and cellulase addition on the dry matter degradation rate

表4 不同纖維素分解酶添加量對青貯鳳梨渣干物質(zhì)降解率的影響Tab.4 Effects of different amounts of cellulase on the dry matter degradation rate of silage pineapple residue

2.4 鳳梨渣青貯飼料養(yǎng)分、青貯指標(biāo)和干物質(zhì)降解率的相關(guān)性分析

由表5 可知，瘤胃發(fā)酵2 h，CP 與DMD 呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），NH3-N、NDF 與DMD 呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），NH3-N/TN 與DMD 呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）；瘤胃發(fā)酵4 h，AA 與DMD 呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；瘤胃發(fā)酵6 h，CP 與DMD 呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），NH3-N/TN 與DMD 呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；瘤胃發(fā)酵9 h，NDF 與DMD 呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），RFV 與DMD 呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；瘤胃發(fā)酵24 h，LA、TVFA 與DMD 呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），AA、PA、LA/TVFA、RFV 與DMD 呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；瘤胃發(fā)酵48 h，與DMD 呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），PA、TVFA 與DMD 呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；瘤胃發(fā)酵72 h，LA、AA、TVFA、RFV 與DMD 呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。

表5 鳳梨渣青貯飼料養(yǎng)分、青貯指標(biāo)和干物質(zhì)降解率的相關(guān)性分析Tab.5 Correlation analysis of pineapple residue silage nutrients，silage indicators and dry matter degradation rate

3 討論

3.1 不同纖維素分解酶添加量對鳳梨渣青貯品質(zhì)的影響

纖維素分解酶是由真菌和細(xì)菌產(chǎn)生的一種多組份酶，可以吸附在纖維素上以纖維素為碳源將纖維物質(zhì)分解為葡萄糖，同時對植物細(xì)胞壁具有一定的溶解作用，其在青貯飼料和果蔬加工中具有較為廣泛的應(yīng)用范圍。Mu等[7]用纖維素分解酶處理莧菜和稻草后進(jìn)行混合青貯，相較于對照組，纖維素分解酶處理組的乳酸菌等有益菌豐度較對照組有所提高，魏氏菌等有害菌豐度、NH3-N、pH等降低，本研究也表明添加纖維素分解酶可以提高CP，降低NH3-N、NH3-N/TN、pH，與He 等[8]、Li[9]、吳長榮等[13]研究結(jié)果均一致，表明纖維素分解酶可以促進(jìn)鳳梨渣青貯飼料保持較低的pH，抑制有害微生物對CP的水解，從而降低NH3-N、NH3-N/TN。本研究還表明Ⅱ組的WSC 顯著高于其他組，DM 顯著低于其他組，其他添加組和對照組間差異均不顯著，其原因可能是纖維素分解酶添加濃度不同，高濃度組纖維素分解酶作用能力強(qiáng)，快速將纖維素等分解為WSC和乙醇等揮發(fā)性物質(zhì)，乳酸菌等有益微生物利用WSC合成乳酸，致使pH 下降速度快，微生物停止活動早；低濃度纖維素分解酶組，由于纖維素分解酶濃度低，分解纖維素等物質(zhì)的速度緩慢，WSC濃度低，乳酸菌繁殖速度慢，pH 下降速度慢，DM 分解時間長，WSC消耗少[17]，這與乳酸濃度相吻合。研究結(jié)果還顯示，添加纖維素分解酶可以降低鳳梨渣青貯飼料中CF 含量，顯著降低NDF 含量，提高RFV，這些均與前人[15-20]研究結(jié)果一致，也進(jìn)一步說明纖維素分解酶對植物細(xì)胞壁具有溶解作用，添加纖維素分解酶有助于降低鳳梨渣青貯飼料中纖維物質(zhì)含量，進(jìn)一步提高青貯品質(zhì)。

3.2 發(fā)酵時間、纖維素分解酶添加量對鳳梨渣青貯飼料干物質(zhì)降解率的影響

本研究結(jié)果顯示，纖維素分解酶添加水平和瘤胃發(fā)酵時間的差異達(dá)到極顯著水平，說明纖維素分解酶添加水平和瘤胃發(fā)酵時間對DMD 影響差異極顯著，有必要進(jìn)一步對瘤胃發(fā)酵時間和纖維素分解酶添加水平進(jìn)行研究。Anusorn等[12]研究表明，纖維素分解酶可以提高肉牛瘤胃菌群豐度，提高DMD；纖維素分解酶處理后可以提高湘東黑山羊、奶牛對頭季再生稻青貯飼料[14]、豆渣與桑葉混合青貯飼料[15]的養(yǎng)分利用率；馮鵬等[19]研究也表明，纖維素分解酶處理玉米秸稈后進(jìn)行青貯，可以提高肉羊?qū)τ衩捉斩捛噘A飼料的養(yǎng)分利用率；丁浩等[20]通過纖維素分解酶處理象草后進(jìn)行青貯，也得出纖維素分解酶可以改善青貯飼料的青貯品質(zhì)，進(jìn)而提高動物對青貯飼料中養(yǎng)分的利用率。本研究結(jié)果得出，隨著發(fā)酵時間的延長DMD 呈上升趨勢，且上升速度逐步趨于平緩，這與前人[15-16]研究結(jié)果是一致的。纖維素分解酶添加組的干物質(zhì)降解率均高于對照組，體外發(fā)酵4 h，纖維素分解酶添加組的DMD均顯著高于對照組，體外發(fā)酵6 h，Ⅲ組的DMD 顯著高于對照組，這與前人[12,14-16,19-20]研究結(jié)果也是一致的。其主要原因是青貯飼料經(jīng)青貯后，青貯原料表面角質(zhì)層遭到破壞，從而提高動物對養(yǎng)分的利用效果[17]，同時由于纖維素分解酶可以破壞植物細(xì)胞壁，進(jìn)一步破壞青貯飼料表層的細(xì)胞壁，進(jìn)而分解內(nèi)部部分纖維物質(zhì)，降低纖維物質(zhì)密度，從而使瘤胃微生物更好的與營養(yǎng)物質(zhì)接觸，提高對養(yǎng)分的消化利用效率[20]。

3.3 鳳梨渣青貯飼料養(yǎng)分、青貯指標(biāo)和干物質(zhì)降解率的相關(guān)性分析

根據(jù)本研究結(jié)果可以看出，瘤胃發(fā)酵前期（≤24 h），DMD 主要受CP、LA、AA、PA、TVFA、LA/TVFA、NH3-N、NH3-N/TN、NDF、RFV 的影響，其中，CP、LA、AA、PA、TVFA、LA/TVFA、RFV 與DMD 呈顯著或者極顯著正相關(guān)關(guān)系，NH3-N、NH3-N/TN、NDF與DMD呈顯著或者極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；瘤胃發(fā)酵后期（＞24 h），DMD 主要受LA、AA、PA、TVFA、RFV 的影響，且均與DMD 呈顯著或者極顯著正相關(guān)關(guān)系?？梢缘贸?，纖維素分解酶對鳳梨渣青貯飼料DMD 的改善主要依靠增加鳳梨渣青貯飼料中CP、LA、AA、PA、TVFA、LA/TVFA、RFV 或者降低NH3-N、NH3-N/TN、NDF 來實(shí)現(xiàn)。研究指出，CF 含量與青貯飼料的DMD 呈負(fù)相關(guān)[17,20]，本研究也得出相同結(jié)論，但是相關(guān)性未達(dá)到顯著水平，其原因是鳳梨渣青貯飼料相較于青貯玉米等禾本科青貯飼料，其CF 含量較低。NDF 與反芻動物唾液分泌、反芻和瘤胃正常蠕動和微生物組成密切相關(guān)，是不被動物消化或者很難消化的一類物質(zhì)。當(dāng)日糧中NDF 含量超過25%時，隨著NDF 水平的上升，干物質(zhì)采食量（DMI）降低，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出添加纖維素分解酶可以促進(jìn)微生物對NDF 的降解，進(jìn)而提高RFV，與前人[17,19-20]研究結(jié)果一致。pH、CP、NH3-N是衡量青貯飼料品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)，一般來說pH 越低CP 保存越好，NH3-N 濃度越低。當(dāng)pH 過高時，腐敗菌將CP 分解為胺、氨等易揮發(fā)物質(zhì)，從而提高青貯飼料中NH3-N 濃度，這部分NH3-N 大部分會通過揮發(fā)損失掉；反之，當(dāng)pH 降至一定范圍時，可抑制有害菌繁殖，減少腐敗菌對CP 的分解，讓更多CP 進(jìn)入瘤胃，被細(xì)菌分解為瘤胃NH3-N，供瘤胃微生物合成菌體蛋白。Anusorn等[12]研究表明，纖維素分解酶處理后可以提高青貯飼料CP、降低NDF，增加瘤胃微生物的豐富度，提高DMD，鄒詩雨等[14]、趙超等[15]、丁浩等[20]研究結(jié)果也表明纖維素分解酶可以提高青貯飼料CP、降低NDF進(jìn)而提高瘤胃對營養(yǎng)物質(zhì)的降解率，這些都與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

纖維素分解酶可提高鳳梨渣青貯飼料中CP、LA、AA、PA、TVFA、LA/TVFA、RFV 含量，降低NH3-N、NH3-N/TN、CF、NDF、ADF 含量和pH；纖維素分解酶添加水平和瘤胃發(fā)酵時間與干物質(zhì)降解率呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；瘤胃對鳳梨渣青貯飼料的干物質(zhì)降解率與CP、LA、AA、PA、TVFA、LA/TVFA、RFV 含量呈正相關(guān)關(guān)系，與NH3-N、NH3-N/TN、NDF 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。綜上，纖維素分解酶可以提高鳳梨渣青貯品質(zhì)和干物質(zhì)降解率，以1 500～3 000 u/kg添加量為宜。

致謝：廣東省科技專項(xiàng)資金（“大專項(xiàng)”+“任務(wù)清單”）（2020A03025、2021A05209）同時對本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！