不同納米過濾系統(tǒng)過濾靜注人免疫球蛋白的效果評價

馬力，李冠軍，張學(xué)成，范蓓，馬小偉，王志剛

華蘭生物工程股份有限公司研發(fā)中心，河南 新鄉(xiāng) 453003

血液制品是以健康人混合血漿為原料，經(jīng)不同的分離純化工藝制備的生物制品。血液制品的生物安全一直是監(jiān)管部門、生產(chǎn)企業(yè)和社會關(guān)注的重點。靜注人免疫球蛋白（intravenous human immunoglobulin，IVIG）作為血液制品的主要成員，在臨床應(yīng)用廣泛。

目前，IVIG 采用的病毒滅活／去除方法通常有低pH 孵放滅活、巴氏滅活、辛酸滅活、S／D 滅活和納米除病毒過濾等方法［1?5］。不同的病毒滅活／去除方法其作用原理不同，低pH 孵放依靠pH 值、溫度以及孵放時間可有效實現(xiàn)對脂包膜病毒滅活；巴氏滅活需加入大量的蛋白保護(hù)劑在高溫條件下實現(xiàn)對脂包膜病毒的滅活，高溫條件滅活病毒的同時不可避免地會對蛋白造成破壞，使蛋白變性；辛酸滅活和S／D 滅活通過加入滅活劑破壞病毒脂包膜實現(xiàn)病毒滅活，滅活劑的加入會造成最終產(chǎn)品的滅活劑殘留；納米除病毒過濾依據(jù)過濾孔徑實現(xiàn)病毒的截留，可有效去除脂包膜和非脂包病毒，且易于保持蛋白質(zhì)的天然活性。納米除病毒過濾作為一種新型的病毒去除方法已廣泛應(yīng)用于血液制品行業(yè)［6?9］。

納米除病毒過濾器的材質(zhì)主要有聚醚砜、再生纖維素和聚偏氟乙烯。納米除病毒過濾方式分為切向流過濾和死端過濾兩種方式。過濾器材質(zhì)、過濾方式以及預(yù)過濾系統(tǒng)均會影響蛋白過濾效果［10?11］。本研究旨在探討不同預(yù)過濾器及其納米過濾器組成的納米過濾系統(tǒng)對IVIG 過濾效果的影響，以篩選最佳納米過濾系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 IVIG 為本公司采用層析工藝制備。

1.2 主要儀器 納米過濾器A 和預(yù)過濾器Y1 購自德國默克密理博公司；納米過濾器B 和C 購自日本旭化成株式會社；納米過濾器D、E 和預(yù)過濾器Y2、Y3、Y4 購自德國賽多利斯公司；預(yù)過濾器Y5 購自美國3M公司。

1.3 納米過濾器的篩選 取IVIG 原液，分別采用不同的納米過濾器（工作方式見表1），按照相應(yīng)的產(chǎn)品說明書過濾壓力進(jìn)行除病毒過濾，記錄過濾時間和過濾體積，并按下式計算衰減速率和過濾蛋白量，以過濾速度衰減至10%為過濾終點，篩選最佳納米過濾器。

表1 不同納米過濾器工作方式Tab.1 Working modes of various nanofilters

衰減速率（%）=相鄰時間點過濾速度／過濾初始速度；

過濾蛋白量（kg／m2）=過濾體積×蛋白質(zhì)濃度

1.4 預(yù)過濾器的篩選 取IVIG 原液，選擇1.3 項篩選的納米過濾器，分別采用不同預(yù)過濾器（工作方式見表2）串聯(lián)納米過濾器，按照相應(yīng)說明書進(jìn)行除病毒過濾，記錄過濾時間和過濾體積，并計算衰減速率和過濾蛋白量，篩選最佳納米過濾組合系統(tǒng)。

表2 不同預(yù)過濾器的工作方式Tab.2 Working modes of various prefilters

1.5 結(jié)果分析 分別以過濾蛋白量和過濾衰減速率為縱坐標(biāo)，過濾時間為橫坐標(biāo)繪制趨勢圖，評價納米過濾效果。試驗均進(jìn)行3 次，結(jié)果采用3 次數(shù)據(jù)平均值。

2 結(jié)果

2.1 納米過濾器的篩選 不同納米過濾器過濾效果差異明顯。過濾蛋白量：納米過濾器C > E > A >D > B，見圖1；過濾衰減速率：C < E < B < D < A，見圖2。納米過濾器A 和D 單位時間內(nèi)過濾通量相對于其他過濾器較高，但過濾衰減速率也最快；納米過濾器C、B 和E 過濾衰減速率優(yōu)于其他過濾器，且納米過濾器C 過濾蛋白量最高。表明切向流過濾模式的過濾衰減速率均優(yōu)于死端過濾模式；納米過濾器B 由于過濾壓力低于其他納米過濾器，其過濾蛋白量較低。依據(jù)不同納米過濾器過濾特點和成本，選擇C為最佳納米過濾器。

圖1 不同納米過濾器的過濾蛋白量Fig.1 Filtered protein load of various nanofilters

圖2 不同納米過濾器的衰減速率Fig.2 Attenuation rate of various nanofilters

2.2 預(yù)過濾器的篩選 過濾蛋白量：預(yù)過濾器Y1 >Y5>Y2>Y3>Y4，見圖3；過濾衰減速率：預(yù)過濾器Y1

圖3 不同預(yù)過濾器的過濾蛋白量Fig.3 Filtered protein load of various prefilters

圖4 不同預(yù)過濾器的衰減速率Fig.4 Attenuation rate of various prefilters

3 討論

納米膜除病毒過濾已廣泛應(yīng)用于血液制品中。不同的納米過濾器因其過濾器材質(zhì)、過濾方式不同，過濾效果有所差異。本研究中切向流過濾方式的過濾衰減速率優(yōu)于死端過濾方式，但死端過濾方式的過濾初始通量優(yōu)于切向流過濾。這與納米過濾器結(jié)構(gòu)特點相關(guān)，納米過濾器A、D，其過濾孔徑采用的是喇叭口設(shè)計（即過濾孔徑由大至?。?，可有效提高過濾初始通量。切向流納米過濾器B、C、E采用的中空纖維管壁開口設(shè)計，過濾孔徑相對均一，因此其過濾初始通量相對較低，但過濾衰減相對較慢。

采用不同的預(yù)過濾器過濾后，對后續(xù)納米過濾均產(chǎn)生了正影響。但不同預(yù)過濾器因過濾器材質(zhì)、過濾方式不同，對納米過濾效果的影響程度有所差異。本研究中深層過濾過濾器對納米過濾效果提高均優(yōu)于絕對過濾過濾器。預(yù)過濾器Y1、Y2 和Y5 具備電荷吸附和深層過濾兩種機制，電荷吸附可能會對過濾料液進(jìn)一步純化，提高過濾效果；預(yù)過濾器Y3 為具備電荷吸附的絕對過濾，電荷吸附可能會對過濾料液進(jìn)一步純化，因此過濾效果優(yōu)于預(yù)過濾器Y4。

不同納米過濾器的材質(zhì)不同，其親水性和疏水性有差異。不同料液其目標(biāo)蛋白、緩沖液、穩(wěn)定劑差異可能會對不同納米過濾器表現(xiàn)出不同的相容性，進(jìn)而影響過濾效果［12］。不同材質(zhì)納米過濾膜的最適pH 有一定差異性，有文獻(xiàn)表明，不同pH 值可能會對納米過濾的物理結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響［13］。不同納米過濾膜對料液最適蛋白質(zhì)含量適用性不同，如納米過濾器A 依據(jù)廠家指導(dǎo)意見過濾蛋白濃度以不高于15 mg／mL 為宜。不同的納米過濾器適宜的蛋白質(zhì)含量應(yīng)依據(jù)試驗而定。為了保證蛋白穩(wěn)定性和活性，通常需加入相應(yīng)的穩(wěn)定劑，不同的穩(wěn)定劑作用機理不同，也可能會影響納米過濾效果。有文獻(xiàn)表明，料液中穩(wěn)定劑會使病毒聚集，減緩過濾衰減速濾，提高過濾效果［14］。

不同納米過濾器因其材質(zhì)、制備工藝和市場因素差異，其成本有所差異。對于生產(chǎn)企業(yè)而言，生產(chǎn)成本控制也是考慮的重要因素。因此需結(jié)合不同納米過濾系統(tǒng)的過濾效率、產(chǎn)品特點和生產(chǎn)成本控制選擇最佳的納米過濾系統(tǒng)。如納米過濾器A 的過濾衰減速率快，但單位時間過濾通量大，較適合如單抗類蛋白穩(wěn)定性較差，不易長時間過濾的產(chǎn)品；納米過濾器C 單位時間過濾通量較低，但過濾衰減速率較慢，較適于如血液制品等蛋白穩(wěn)定性好的產(chǎn)品。

綜上所述，本研究探討了不同預(yù)過濾器及不同納米過濾膜組成的納米過濾系統(tǒng)的過濾效果，為不同蛋白制劑選用納米過濾系統(tǒng)提供了理論支持。