《歐洲藥典》通則“用于疫苗質(zhì)量控制的體外方法替代體內(nèi)方法”的解讀和思考

張旋旋，吳星，毛群穎，徐苗，梁爭論

中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所，北京 102629

效價也稱效力（potency），在《中國藥典》中定義為用適當(dāng)?shù)亩可餃y定法確定的生物活性的量度［1］。疫苗成品效價為疫苗質(zhì)量控制和放行的關(guān)鍵質(zhì)量控制指標(biāo)（critical quality attributes，CQA），與疫苗有效性直接相關(guān)。體內(nèi)效力檢測包括動物攻毒保護檢測和免疫后抗體檢測兩種方法［2］，我國采用這兩種方法檢測的上市疫苗均有8種；體外效力檢測方法包括病毒滴度半數(shù)細胞感染劑量（CCID50）或細菌活菌數(shù)測定，以及病毒疫苗抗原或細菌疫苗多糖含量等免疫原檢測，應(yīng)用上述方法檢測的疫苗分別為8、4、5和3種。其中體內(nèi)、體外效力兩種檢測方法共存的為重組人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）疫苗、腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）滅活疫苗、重組帶狀皰疹疫苗和重組新型冠狀病毒疫苗（CHO細胞）。

體內(nèi)效力檢測法存在動物需求量大、操作費時及檢測變異大等缺陷［3］。2018年，歐洲實驗動物使用量為1 080萬只，而放行試驗中效價檢測所用動物占總量8%，遠高于放行的安全性檢測的使用量［4］。隨著3R（減少、優(yōu)化、替代）原則的推廣和認可［5］，世界衛(wèi)生組織、監(jiān)管機構(gòu)和疫苗生產(chǎn)商等均致力于研究疫苗體內(nèi)方法的替代［6?8］，但至今仍進展緩慢，主要原因為：①疫苗體內(nèi)效力檢測方法的傳統(tǒng)性和維持的習(xí)慣性；②體內(nèi)效力檢測方法變異大，易導(dǎo)致體外、體內(nèi)方法替代的比較實驗難以通過；③方法改變將伴隨CQA及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的變化，且同一品種多個企業(yè)的生產(chǎn)毒株和工藝等不同，如何設(shè)計實驗獲得科學(xué)的相關(guān)數(shù)據(jù)以獲批，缺乏相應(yīng)的指導(dǎo)性文件。

解讀2020年施行的《歐洲藥典》10.0版中5.2.14章節(jié)——“用于疫苗質(zhì)量控制的體外方法替代體內(nèi)方法”，特別是其中對效價替代的考慮，不僅有助于我國已上市疫苗體內(nèi)方法的替代，也對創(chuàng)新疫苗在研發(fā)階段研究效價方法具有指導(dǎo)意義［9］。

1 《中國藥典》和《歐洲藥典》效價方法替代狀況

1.1 《中國藥典》《中國藥典》三部（2020版）中重組乙型肝炎疫苗（酵母）、甲型肝炎滅活疫苗和Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗成品效價為體外效力。其中，重組乙型肝炎疫苗（酵母）在《中國藥典》二部（2000版）中成品效價為體內(nèi)效力和體外相對效力［10］，自《中國藥典》三部（2005版）起，重組乙型肝炎疫苗（酵母）效價僅為體外相對效力［11］。甲型肝炎滅活疫苗納入《中國藥典》三部（2010版）前已完成效價體外方法替代研究。Sabin株脊髓灰質(zhì)滅活疫苗效價為體外相對效力，已納入《中國藥典》三部（2020版）［12?13］。為推動方法替代，《中國藥典》三部（2025版）編制大綱重點工作的目標(biāo)任務(wù)中提出：要繼續(xù)推進先進理化分析方法在生物制品質(zhì)量控制中的應(yīng)用，繼續(xù)推進和加快體外方法替代動物體內(nèi)方法。要求完成體外活性檢測方法替代動物體內(nèi)試驗的相關(guān)技術(shù)指南或通用技術(shù)要求的建立，并力爭在個別品種各論生物活性測定中實現(xiàn)體外方法的補充或替代。

1.2 《歐洲藥典》2020年施行的《歐洲藥典》10.0版中，重組乙型肝炎疫苗、甲型肝炎滅活疫苗、脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗及HPV疫苗效價檢測均可選擇體內(nèi)或體外方法［14?17］。其中，脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗在1997年納入《歐洲藥典》3.0版時，采用體內(nèi)方法檢測免疫后大鼠或雞血清中和抗體［18］；1999年增補版中檢測項增加免疫化學(xué)法檢測D抗原含量［19］；2006年施行的5.4版提出，在D抗原含量檢測與體內(nèi)方法對疫苗批檢測通過／失敗的評價結(jié)果一致的前提下，可使用D抗原含量檢測替代體內(nèi)方法［20］。為指導(dǎo)脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗生產(chǎn)商和監(jiān)管機構(gòu)實施體內(nèi)方法替代，5.6版增加D抗原含量檢測驗證指南。該指南明確提出了對驗證前方法和標(biāo)準(zhǔn)需滿足的條件、驗證樣品、結(jié)果判定等的要求?！稓W洲藥典》10.0版生物制品通則頒布了旨在簡化體內(nèi)方法替代的章節(jié)，11.0版延續(xù)上一版該章節(jié)內(nèi)容［21］。

2 《歐洲藥典》方法替代的解讀

《歐洲藥典》10.0版中5.2.14章內(nèi)容包括方法替代目的、背景、一般考慮以及對效價、安全性項目等體內(nèi)方法替代的考慮，目的是指導(dǎo)并促進替代方法的實施。

2.1 目的 本章的目的是對利用體外方法替代現(xiàn)有體內(nèi)方法的實施提供指導(dǎo)，以避免因體外方法適用性之外的問題導(dǎo)致對體外和體內(nèi)方法的對比研究不適用。本章主要適用于人或獸用疫苗，對血清等生物制品也適用。

2.2 背景 本章適用范圍為用于疫苗質(zhì)量控制中監(jiān)測生產(chǎn)一致性的效價和安全性分析方法。重點介紹體外方法的優(yōu)勢以及動物保護的要求。提出雖然納入藥典疫苗各論中的體內(nèi)效力和安全性方法在保障疫苗質(zhì)量方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但該方法的固有變異性可能使其在監(jiān)測生產(chǎn)一致性和評估生產(chǎn)變化的潛在影響時，劣于科學(xué)設(shè)計并驗證的體外分析方法。要求必須不斷挑戰(zhàn)體內(nèi)方法的科學(xué)價值和相關(guān)性并及時進行方法替代。適當(dāng)?shù)捏w外方法不僅減少了動物的使用，同時保持或提高了檢測的科學(xué)相關(guān)性，且大大減少了檢測變異及所需的時間和資源，對安全有效疫苗的放行提供了保證。

明確方法替代也是出于動物保護的要求。根據(jù)《歐洲保護用于實驗和其他科學(xué)目的的脊椎動物公約》，《歐洲藥典》委員會承諾盡可能減少在藥典的檢測方法中使用動物。根據(jù)該公約鼓勵與《歐洲藥典》工作相關(guān)的人員制定和／或?qū)嵤w外方法，并且通常情況下支持引入《歐洲藥典》中描述的替代體內(nèi)的方法。

2.3 一般考慮

2.3.1 體內(nèi)、體外方法比較的瓶頸 疫苗的體內(nèi)安全性和效價檢測方法通常被證明適合使用目的，且已在歷史上證明了其在保證疫苗有效性和安全性方面的價值。但由于體內(nèi)方法的固有變異性，在與一致性更優(yōu)的體外方法進行典型的一對一比較研究時會遇到挑戰(zhàn)，導(dǎo)致常用的國際多中心合作研究失敗。

以往的體內(nèi)方法開發(fā)時往往無驗證要求，使得一對一體內(nèi)、體外方法的比較研究難度較大，甚至難以成功，原因為體內(nèi)方法未進行精密度、重復(fù)性、檢測限和定量限等驗證，難以評估兩種方法間的可比性。此外，對藥典收錄的體內(nèi)方法也難以進行再驗證。藥典方法通常被認為是經(jīng)過驗證的，現(xiàn)在對這些方法根據(jù)國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)會（the Interna?tional Council for Harmonisation of Technical Require?ments for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）／獸藥注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會（International Coope?ration on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Veterinary Medicinal Products，VICH）的要求進行回顧性驗證不僅不切實際且成本過高，也不符合倫理要求。

2.3.2 體外方法替代的考慮要點 在考慮從體內(nèi)到體外質(zhì)量控制方法過渡時，重要的是要了解體內(nèi)方法能或不能提供什么。盡管體內(nèi)效力檢測方法可檢測與有效性相關(guān)的免疫功能反應(yīng)，但不能預(yù)測目標(biāo)群體中的實際免疫反應(yīng)。

該別墅屬于居民生活用電，各方案的運行費用，按照電價0.6元/kWh計算，在全年運行中，夏季供冷運行期為120d，冬季供熱運行期為120d，平均每天運行為6h，各方案的耗電量和運行費用如表6所示。

體外方法通常具有較低的變異性和較高的靈敏度，可檢測復(fù)雜有機體反應(yīng)的特定指標(biāo)。另一關(guān)鍵考慮因素是當(dāng)體外方法替代體內(nèi)方法時，疫苗的質(zhì)量屬性可能會以不同方式進行評估，如體外方法檢測抗原含量或功能反應(yīng)（病毒或毒素中和）替代體內(nèi)效力等。

證明體內(nèi)、體外兩種方法之間的一致性通常無科學(xué)基礎(chǔ)，且難以成功。即使兩種方法通過／失敗的結(jié)果一致，兩種方法在整個檢測范圍內(nèi)的相關(guān)性仍然可能很低。但體外方法必須能控制相關(guān)CQA，檢測生產(chǎn)一致性從而確保產(chǎn)品的安全和有效。

雖然本通則的重點是替代已批準(zhǔn)產(chǎn)品的現(xiàn)有體內(nèi)方法，但重要的是在產(chǎn)品開發(fā)過程中考慮采用體外方法進行質(zhì)量控制，并了解使用體內(nèi)方法是非強制性的。

2.4 體內(nèi)方法的替代方法

2.4.1 一般考慮 在質(zhì)量控制體系中實施體外方法時，應(yīng)主要關(guān)注體外方法對相關(guān)CQA控制的科學(xué)相關(guān)性。任何體外方法均必須滿足目前的方法驗證要求。在《歐洲藥典》中疫苗體內(nèi)方法替代通常通過多中心合作研究完成，但這不應(yīng)成為單個產(chǎn)品體內(nèi)方法替代的先決條件。此外，雖然理想情況下有廣泛適用于一類疫苗的體外方法，但是非必需的。本文以下就效價的考慮進行解讀。

2.4.2 效價檢測

方法替代的前提是所涉及的疫苗具有良好的安全性和有效性，并具有較好的工藝一致性。當(dāng)由于體內(nèi)方法區(qū)分統(tǒng)計效能低和／或高變異性而無法獲得方法間的一致性時，可應(yīng)用以下的考慮。

2.4.2.1 體外方法性能和標(biāo)準(zhǔn) 體外方法應(yīng)能科學(xué)合理地檢測出與生產(chǎn)過程控制相關(guān)的差異。研究數(shù)據(jù)應(yīng)證明計劃替代方法可控制疫苗的CQA，并維持待簽發(fā)批次疫苗質(zhì)量與臨床試驗或常規(guī)使用安全有效批次間的相關(guān)性。通過設(shè)置適當(dāng)?shù)腃QA的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)保持工藝一致性。

2.4.2.2 體外方法應(yīng)具有檢測含量和功能的能力用于疫苗質(zhì)量控制的體外方法需具有檢測疫苗抗原含量和功能的能力。如果使用單一方法，則最好通過靶向與疫苗提供保護相關(guān)的表位檢測抗原的含量和完整性，如選擇抗中和性抗體主要靶標(biāo)表位或表位簇的單抗或多個單抗，應(yīng)優(yōu)選抗構(gòu)象表位或表位簇的單抗，以便具有穩(wěn)定性指證。如單一體外方法無法充分反映抗原含量和功能，可使用多個體外方法替代，如結(jié)合多糖疫苗的分子大小、結(jié)合物完整性、總體及游離多糖含量檢測方法。

2.4.2.3 研究樣本設(shè)置的要求 開發(fā)體外定量檢測方法時，大多數(shù)情況下會由于良好的生產(chǎn)一致性較難獲得低于效力標(biāo)準(zhǔn)的樣品，因此初始評價應(yīng)使用不同濃度的樣品，隨后可對不同類型壓力條件的樣品進行檢測，進一步評估新體外方法的穩(wěn)定性檢測性能。

2.4.2.4 體外方法的優(yōu)勢 無法證明體外和體內(nèi)方法間的一致性并不一定意味著體外方法不合適或不相關(guān)。在多數(shù)情況下，體外方法可檢測出疫苗工藝中無法通過體內(nèi)方法檢測到的變化。在這種情況下，體外方法在監(jiān)測生產(chǎn)的一致性方面優(yōu)于體內(nèi)方法，可更有效地評估工藝變化的影響。

3 思考

效價是疫苗生產(chǎn)、放行和上市后監(jiān)督抽驗的關(guān)鍵CQA。除3R動物保護要求外，疫苗效價檢測實驗周期繁長及動物使用量巨大，已成為疫苗放行的主要限時瓶頸，急需建立快速簡便的體外替代方法。

由于疫苗特性和歷史等原因，疫苗效價檢測多采用體內(nèi)方法。隨著科技發(fā)展和疫苗GMP的全面實施，經(jīng)典疫苗的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制水平得到顯著提升，而新研發(fā)疫苗已進入質(zhì)量源于設(shè)計（quality by design，QbD）和全生命周期質(zhì)量管理時代，疫苗生產(chǎn)的一致性可獲得保證，即疫苗生產(chǎn)工藝的“consistency app?roach”［3］，加之各種新型檢測技術(shù)發(fā)展和ICH等方法的開發(fā)和驗證指南的更新，為疫苗體內(nèi)效價檢測方法的替代提供了必要性并奠定了實施基礎(chǔ)［22?26］。

疫苗效價檢測方法替代周期長且難以成功，對企業(yè)和監(jiān)管部門均是嚴峻的挑戰(zhàn)［23，27?30］，而缺少相關(guān)指導(dǎo)原則為主要原因?！稓W洲藥典》通則10.0版“用于疫苗質(zhì)量控制的體外方法替代體內(nèi)方法”，對指導(dǎo)企業(yè)進行效價方法替代具有重要意義。近期《中國藥典》三部（2025版）編制大綱也提出了建立體外活性檢測方法替代動物體內(nèi)試驗的技術(shù)指南或要求。

我國近年來上市的新型疫苗如EV71、HPV疫苗等［31］，成品效價體內(nèi)和體外效力檢測項目共存，目的是在疫苗上市后多批次生產(chǎn)過程中積累體內(nèi)和體外效力數(shù)據(jù)以便進行方法替代，但由于效價方法變異大、難以評價和判定不同方法間的一致性，且涉及CQA和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改變也同樣難以替代。因此今后進行新研發(fā)疫苗的效價研究時，可在上市前盡早開展相關(guān)研究，以探討體外方法對疫苗含量和構(gòu)象完整性的檢測性能。在證明該方法與有效性相關(guān)并能有效監(jiān)測工藝變化的基礎(chǔ)上，開發(fā)驗證符合預(yù)期目的的體外效力檢測方法。應(yīng)注意積累不同開發(fā)階段批次的數(shù)據(jù)并留樣，相關(guān)研究數(shù)據(jù)最好能追溯至關(guān)鍵臨床批次并涵蓋足夠的產(chǎn)業(yè)化批次，為體外方法替代提供充分的數(shù)據(jù)支持。

體外方法替代時，需綜合考慮疫苗生產(chǎn)工藝和檢測方法的變異以及穩(wěn)定性和臨床試驗的結(jié)果，制定科學(xué)、合理的體外效力質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，以更精確監(jiān)測疫苗的批間一致性，為疫苗的安全有效提供保證。為保證檢測質(zhì)量，應(yīng)制備1批長期穩(wěn)定的抗原作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，當(dāng)疫苗解離率影響體外效價檢測時，可同時設(shè)置參考苗控制解離率對檢測準(zhǔn)確性的影響。