厭氧菌群JAC1降解石油烴能力及其群落結構的解析*

江曉旭 Shahdev Sajnani 傅鈺婷 于家率 朱宏飛

(遼寧工程技術大學環(huán)境科學與工程學院,遼寧 阜新 123000)

石油事故性泄漏對土壤生態(tài)環(huán)境造成的嚴重破壞受到人們廣泛關注。多種土壤修復方法中,微生物修復相比物理、化學修復具有無二次污染、發(fā)展?jié)摿Υ蟮膬?yōu)點。由于地層60 cm以下的土壤氧分壓較低,因此在被石油污染的地下深層土壤和蓄水層環(huán)境中,石油烴的厭氧降解占據(jù)主導地位[1]。近些年來,微生物厭氧降解石油烴被陸續(xù)報道。CALLAGHAN等[2]發(fā)現(xiàn)硫酸鹽還原菌(Desulfosporosinus)對正十六烷有一定厭氧降解能力;LI等[3]從石油污染污泥中篩選分離出的克雷伯氏菌(Klebsiella)對芘表現(xiàn)出較高的厭氧降解能力;硫酸鹽還原菌可降解短鏈或長鏈碳氫化合物[4]。石油烴厭氧降解不僅為微生物修復石油污染場地提供一個可行的方法,同時也為殘余油能源回收提供新思路。

在厭氧或低氧環(huán)境中,許多兼性或嚴格厭氧細菌能夠利用有機污染物進行新陳代謝活動,并形成穩(wěn)定的群落結構[5]。土壤中污染物成分復雜,單一菌株對污染物的降解能力有限。混合細菌體系可通過協(xié)同利用污染底物和中間代謝產物等方式對污染物進行降解[6]。有研究表明,通過人為手段篩選并富集培養(yǎng)可高效降解污染物的菌群可使優(yōu)勢功能微生物發(fā)生群聚,強化污染物的去除[7]。為此,本研究利用苯酚誘導從石油污染土樣中培養(yǎng)富集出石油烴厭氧降解混合菌群(記為JAC1),并用其強化降解去除土壤中的石油烴。通過單因子條件優(yōu)化實驗對JAC1的降解條件進行優(yōu)化,并對石油烴降解過程進行動力學研究。通過宏基因組學對微生物群落結構進行分析,揭示微生物之間相互作用的規(guī)律。研究結果可為無氧環(huán)境石油污染修復提供一定理論基礎,并為深入研究石油烴厭氧降解代謝奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 土壤樣品采集

土壤樣品采自阜新市東梁油庫(121.554 4°E,41.909 5°N),在0.6～2.0 m深度處平均間隔設置4個采樣點,每點取土500 g并混勻,低溫隔氧運送回實驗室。經檢測,土壤樣品呈中性(pH=7.19),存在明顯的石油污染,總石油烴(TPH)質量濃度高達101.26 mg/kg。

1.2 實驗方法

1.2.1 JAC1的培養(yǎng)和篩選

制備改良培養(yǎng)基(Na2SO40.5 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、K2HPO40.5 g/L、CaCl20.1 g/L、MgSO4·7H2O 2.0 g/L、(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 1.2 g/L、抗壞血酸 0.1 g/L、乳酸鈉 4.0 mL/L、酵母膏1.0 g/L、蒸餾水1 L、葡萄糖5 g/L、胰蛋白胨5 g/L),將改良培養(yǎng)基分裝到厭氧瓶中,高壓蒸汽滅菌20 min。將5 g土壤樣品、誘導劑苯酚(200 mg/L)分別加入滅菌后的改良培養(yǎng)基中,并放置于厭氧箱中進行培養(yǎng),篩選出對苯酚有較好耐受性的厭氧菌群,提取后在30 ℃、100 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng),得到JAC1培養(yǎng)液。

1.2.2 JAC1富集培養(yǎng)及群落結構測定

取出5 mL JAC1培養(yǎng)液轉接到新的含有改良培養(yǎng)基的厭氧瓶中進行富集培養(yǎng),上述操作均在厭氧培養(yǎng)箱中進行,利用紫外分光光度計測定JAC1培養(yǎng)液在600 nm下的吸光度(記為OD600),用以表征微生物的增長情況。當培養(yǎng)液OD600接近0.7時,說明微生物處于對數(shù)增長期,代謝活動旺盛,且數(shù)量較多,將此時的JAC1菌液用于后續(xù)的石油污染土壤降解能力分析和微生物群落結構解析。利用脫氧核糖核酸(DNA)提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取JAC1菌群的基因組DNA,干冰保存后進行宏基因組測序。測序后利用Fastp軟件對原始數(shù)據(jù)進行質控,利用Blastp與NR數(shù)據(jù)庫進行比對,可獲得微生物群落結構信息。

1.2.3 降解系統(tǒng)的構建及影響因素分析

向自封袋中裝入50 g污染土壤樣品,將一定JAC1菌液加入土壤樣品中,擠出自封袋中的空氣并放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱培養(yǎng),在培養(yǎng)第20、40、60、80天取樣測定土壤中TPH含量,計算TPH降解率。TPH具體測定方法參考文獻[8]。為考察土壤pH、NaCl含量、TPH濃度、接菌量等因素對于TPH降解效果的影響,設計單因子條件優(yōu)化實驗。在分析pH影響時,取50 g實際污染土壤樣品,用稀HCl溶液與稀NaOH溶液調節(jié)土壤pH分別為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5,加入7.5 mL JAC1菌液攪拌均勻,分別進行厭氧降解實驗;在進行TPH濃度分析時,將未受TPH污染的清潔土與實際污染土壤樣品按一定比例混合,制備成TPH質量濃度為10、30、50、100 mg/kg的污染土壤樣品,取50 g加入7.5 mL JAC1菌液攪拌均勻,分別進行厭氧降解實驗;在考察NaCl含量影響時,取50 g實際污染土壤樣品,采用NaCl溶液調節(jié)土壤樣品中NaCl的質量濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%,加入7.5 mL JAC1菌液攪拌均勻,分別進行厭氧降解實驗;在分析接菌量的影響時,取50 g實際污染土壤樣品,分別加入2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL JAC1菌液攪拌均勻,即接菌量分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL/g進行厭氧降解實驗。每個條件設置3個平行樣,同時以不加JAC1菌液的實際污染土樣為對照組進行厭氧降解實驗。

1.2.4 優(yōu)化條件下厭氧降解過程動力學分析

采用一級動力學模型(見式(1))對TPH厭氧降解過程進行描述,根據(jù)式(2)計算TPH降解半衰期。

(1)

(2)

式中：C0為土壤中TPH初始質量濃度,mg/L;Ct為培養(yǎng)第t天土壤中TPH質量濃度,mg/L;K為一級降解速率常數(shù),d-1;t為降解時間，d；t1/2為降解半衰期,d。

1.2.5 不同石油烴組分的分析

采用氣相色譜質譜聯(lián)用儀(GC/MS)對降解后土壤中不同石油烴組分進行分析。氣相色譜柱采用DB-5石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),柱初溫50 ℃,程序升溫：升溫速度15 ℃/min,至120 ℃;載氣流速1.4 mL/min。質譜離子源為電子轟擊源,離子源溫度為250 ℃,電子轟擊能量70 eV。

1.2.6 石油污染土壤降解前后群落結構組成分析

單因子優(yōu)化條件實驗結束后,取各影響因子中TPH降解率最高的土壤樣品,等質量混合均勻,取5～10 g保存于無菌自封袋中,記為降解土；取未經處理的實際污染土壤記為原土,分別進行土壤微生物群落結構組成分析,測序方法同厭氧菌群JAC1群落結構測定方法。

1.3 數(shù)據(jù)存儲

此次的宏基因組學原始序列已提交至美國國家生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫,檢索號為SRX15405799、SRX15405800、SRX15405801、SRX15405802。

2 結果與討論

2.1 厭氧菌群JAC1的群落結構

采用針對16S rRNA的338F/806R引物進行測序,獲得JAC1中微生物群落結構組成信息,結果見表1。

表1 JAC1中微生物在屬水平上的相對豐度Table 1 Relative percentage of community abundance in JAC1 at the genus level

由表1可見,菌群JAC1中的優(yōu)勢菌屬依次為腸桿菌、克雷伯氏菌、硫酸鹽還原菌、檸檬酸桿菌、沙雷氏菌。腸桿菌對輕質原油具有很好的降解效果[9],克雷伯氏菌在缺氧條件下能對菲進行厭氧降解[10],硫酸鹽還原菌能夠厭氧降解萘[11],檸檬酸桿菌在石油污染海域環(huán)境下可高效降解烷烴[12],從油泥沉積物中分離出的沙雷氏菌屬對中長直鏈烷烴降解率較高[13]。鄭金秀[14]認為,混合菌群具有協(xié)同降解共生作用,互相利用中間代謝產物,其降解效果較單菌有明顯優(yōu)勢。

2.2 TPH降解條件的優(yōu)化結果

pH會影響微生物對營養(yǎng)物質的利用和轉化作用[15],pH過高或過低都會引起微生物電荷發(fā)生變化,從而抑制細胞酶的活性。土壤pH對TPH降解效果的影響見圖1。在厭氧培養(yǎng)第80天時,pH為7.5的實驗組TPH降解率最高,為53.42%,其次為pH為8.5的實驗組,TPH的降解率為51.21%,其他實驗組TPH的降解率均在50%以下。由此可知,pH在7.5～8.5時石油烴的降解效果最好。由于石油烴降解過程中會有大量有機酸代謝產物產生,導致土壤pH有一定程度降低[16],因此中性偏堿的環(huán)境更適合微生物對石油烴的厭氧降解。

圖1 不同pH下的TPH降解率Fig.1 TPH degradation rates under different pH

土壤中TPH質量濃度對TPH降解效果的影響見圖2?？傮w看來,隨著土壤中TPH質量濃度的升高,TPH降解率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢,TPH為50 mg/kg的實驗組石油烴降解效果最明顯,厭氧培養(yǎng)第80天時TPH降解率達到54.50%。這是因為TPH濃度增加時,可以為土壤中的微生物提供更多有機碳源,有助于微生物的生長繁殖,然而TPH濃度達到100 mg/kg時,TPH降解率反而有所降低,這是因為高濃度的石油烴通常會聚集在土壤顆粒表面從而抑制微生物降解,同時會對微生物產生毒害,可見石油烴不僅是微生物的生長底物,同時也對微生物存在一定毒害作用[17]。

圖2 不同TPH質量濃度下的TPH降解率Fig.2 TPH degradation rates under different TPH mass concentrations

土壤中NaCl質量分數(shù)對TPH降解效果的影響見圖3。由圖3可見,隨著土壤中NaCl質量分數(shù)升高,TPH降解率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢,NaCl質量分數(shù)為0.3%的實驗組石油烴降解效果最明顯,厭氧培養(yǎng)第80天時TPH降解率達到56.18%。由此可知,適量的鹽分可促進微生物的生長,但鹽分含量過高,會對JAC1的生理機能產生不利影響，反而不利于TPH降解。

圖3 不同NaCl質量分數(shù)下的TPH降解率Fig.3 TPH degradation rates under different NaCl mass fractions

土壤接菌量對TPH降解效果的影響見圖4。由圖4可見,厭氧培養(yǎng)第20天時,JAC1接菌量越高石油烴的降解效果越顯著,隨著厭氧培養(yǎng)的繼續(xù)進行,JAC1接菌量為0.15 mL/g時石油烴的降解效果最佳,在第80天時TPH降解率達到55.40%。這是因為當JAC1接菌量過高時,培養(yǎng)后期會產生大量細菌代謝產物抑制細菌生長,導致石油烴降解速率緩慢?？傮w看來,JAC1的最佳接菌量為0.15 mL/g。

圖4 不同接菌量下的TPH降解率Fig.4 TPH degradation rates under different inoculation quantity

2.3 JAC1對石油烴降解過程的動力學分析

由表2可知,不同條件下,石油烴的厭氧降解均符合一級動力學,相關系數(shù)R2均在0.9以上,這與李金成等[18]提出的微生物降解遵循一級動力學模型符合。一級降解速率常數(shù)K可用于指示不同條件下JAC1對石油烴的降解速率[19],K越大,石油烴降解速率越快,半衰期相應也會縮短。根據(jù)表2結果可知,JAC1降解石油烴的最優(yōu)條件為pH 7.5～8.5,TPH質量濃度50 mg/kg,NaCl質量分數(shù)0.3%,接菌量0.15 mL/g。

2.4 石油烴的組分分析

以最優(yōu)條件下進行厭氧降解的土壤樣品為實驗組,以不添加JAC1進行厭氧降解的實際土壤樣品為對照組,對實驗組與對照組中土壤殘留組分進行GC/MS分析,計算出不同石油烴組分的降解率,結果見表3。

由表3可知,隨著碳原子數(shù)的增加,石油烴組分降解率逐漸降低,其中C23H40的降解率最低,僅為11.0%,這表明芳香烴較直鏈烷烴更難降解。MAN等[20]研究發(fā)現(xiàn),微生物降解石油烴的難易順序為環(huán)烷烴>芳香烴>支鏈烷烴>直鏈烷烴,與本研究結論總體相符。實驗中部分長鏈烷烴降解率高于短鏈烷烴,推測部分長鏈烷烴在降解過程中先分解為短鏈烷烴,然后再進行降解。因此,可以利用化學法將石油烴中難降解的組分分解為更容易被微生物利用的短鏈烷烴,從而進一步提高石油烴的去除效率。

2.5 降解前后土壤群落結構組成分析

石油烴降解過程中,土壤微生物群落存在演替現(xiàn)象。借助Diamond比對軟件將測序數(shù)據(jù)與NR數(shù)據(jù)庫進行比對,可以在不同分類層級上獲得各種微生物的相對豐度。表4顯示了原土與降解土在門水平和屬水平上物種相對豐度分布情況。

從門水平上看,降解土微生物群落中主要菌門有變形菌門、放線菌門、廣古菌門、擬桿菌門、厚壁菌門。與原土相比,降解土新增廣古菌門微生物,相對豐度為4.05%,放線菌門和厚壁菌門的相對豐度有明顯提高,擬桿菌門相對豐度明顯減少。從屬水平上看,降解土微生物群落中主要菌屬有苯基桿菌屬、厭氧黏細菌屬、甲烷八疊球菌屬、假單胞菌屬和短波單胞菌屬。與原土相比,降解土新增有甲烷八疊球菌屬、短波單胞菌屬微生物,由此可以判斷此時甲烷生成處于活躍狀態(tài)?？梢?隨著厭氧降解的進行,各種理化因子的綜合作用驅動了土壤微生物群落的演替。

隨著土壤中TPH濃度的逐漸降低,化學脅迫作用減弱,土壤中的微生物群落豐度有所增加,說明土壤微生物群落多樣性與TPH濃度呈負相關。有研究表明,變形菌門、放線菌門和厚壁菌門與多環(huán)芳烴的降解密切相關[21]。變形菌門是土壤生物處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌門,大部分參與有機物降解過程的微生物均屬于此菌門。厚壁菌門在石油烴降解和有機物的厭氧發(fā)酵中發(fā)揮著關鍵作用[22]。厭氧黏細菌屬已被證實對環(huán)境中重金屬、石油烴污染具有重要的生物修復功能[23]。假單胞菌屬中的一些物種屬于兼性厭氧菌,能夠在厭氧條件下降解多環(huán)芳烴[24]。甲烷八疊球菌屬屬于廣古菌門,能在厭氧環(huán)境中利用有機物產生甲烷[25]。加入?yún)捬趸旌暇篔AC1后,土壤中上述功能菌群的相對豐度均呈現(xiàn)出不同程度升高,說明投加JAC1有助于建立一個高效的微生物降解體系來強化石油烴降解。

表2 不同條件下TPH的降解速率常數(shù)及半衰期Table 2 Degradaion rate constant and half-value period of TPH under different conditions

表3 石油烴中不同組分的降解率Table 3 Degration rate of different petroleum hydrocarbon compositions %

表4 門水平和屬水平的物種相對豐度Table 4 Relative abundances of species at the phylum level and genus level

雖然厭氧條件下的TPH降解率相比于有氧條件下低,但鑒于地下深層和石油滲漏均屬于缺氧環(huán)境,微生物活動主要以厭氧為主,因此厭氧降解在修復污染源較深、條件較差的石油污染地區(qū)來說仍然具有重要作用。通過GC/MS分析可知,芳香烴較直鏈烷烴更難降解,且芳香烴常與沉積物結合,降解機制較為復雜。由于石油烴在污染環(huán)境中易形成多環(huán)芳烴,而多環(huán)芳烴比較穩(wěn)定,難于降解,對生態(tài)環(huán)境具有毒性,因此本研究用苯酚誘導來篩選微生物就可解決核心毒性,并起到降解石油烴的效果。微生物群落組成結構演替是綜合作用的結果,群落之間存在相互代謝作用機制及復雜的能量轉換與電子轉移等,共養(yǎng)微生物可將污染物轉化為甲烷,這對于微生物修復及能源回收具有積極意義?？梢?通過微生物強化作用提高石油烴的降解代謝能力具有很大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3 結 論

(1) 單因子優(yōu)化實驗結果表明,厭氧菌群JAC1降解TPH的最佳條件為pH 7.5～8.5,土壤TPH質量濃度50 mg/kg,NaCl質量分數(shù)0.3%,接菌量0.15 mL/g,不同條件下的TPH降解均符合一級動力學模型。

(2) 隨著碳原子數(shù)增加,JAC1對石油烴組分的降解率逐漸降低。芳香烴較直鏈烷烴更難降解,部分長鏈烷烴可能先分解為短鏈烷烴后再被降解。

(3) 土壤微生物群落多樣性與TPH濃度呈負相關,投加JAC1后土壤中與石油烴降解有關的功能菌群相對豐度呈現(xiàn)出不同程度升高,說明投加JAC1有助于建立一個高效的微生物降解體系來強化石油烴降解。