子宮內(nèi)膜癌組織DBC1與SIRT1蛋白表達(dá)及意義

趙舸,鄒存華,宋冬冬,趙淑萍

(青島大學(xué)附屬青島市婦女兒童醫(yī)院,山東 青島 266034 1 婦科中心； 2 普通外科)

子宮內(nèi)膜癌(EC)在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中占比20%～30%[1-4]。近年來EC發(fā)病率呈明顯上升和年輕化趨勢[5-8]。目前EC治療以手術(shù)為主，輔助放療和化療的綜合治療方式可獲得較高的存活率，但化療毒副作用大，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。EC發(fā)病機(jī)制目前仍不十分明確，探索腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制，尋求新的治療靶點具有重要的臨床意義。已有研究發(fā)現(xiàn),沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)在白血病、結(jié)直腸癌、前列腺癌等多種癌細(xì)胞中高表達(dá)，且與基因調(diào)控、細(xì)胞凋亡和增殖及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[9-12]。同時，SIRT1的關(guān)鍵內(nèi)源性抑制劑乳癌缺失因子1(DBC1)可通過特異性抑制SIRT1來促進(jìn)P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13]。近年來已有多項研究表明，DBC1及SIRT1與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，同時與P53介導(dǎo)的凋亡途徑密切相關(guān)。但有關(guān)DBC1及SIRT1與EC的相關(guān)研究較少，具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究擬通過免疫組織化學(xué)方法，檢測EC組織、不典型增生子宮內(nèi)膜組織及對照組子宮內(nèi)膜組織DBC1及SIRT1的表達(dá)情況，并分析二者在EC中的關(guān)聯(lián)性?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集青島大學(xué)附屬青島市婦女兒童醫(yī)院2019年10月—2020年12月手術(shù)切除的EC組織標(biāo)本60例，不典型增生子宮內(nèi)膜40例。另選取同時期子宮肌瘤子宮全切術(shù)且術(shù)后病理診斷為正常子宮內(nèi)膜組織40例作為對照組。病人年齡為35～66歲，平均(48.00±0.02)歲。EC根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2009年分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期：ⅠA～ⅠB期36例，Ⅱ～Ⅳ期24例；高分化25例，中/低分化35例；肌層浸潤深度<1/2為23例，≥1/2為37例。所有病人均未行放化療等。

1.2 免疫組織化學(xué)方法檢測各組織中DBC1和SIRT1蛋白的表達(dá)

組織標(biāo)本石蠟包埋，切片，烤片。將組織切片依次在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液中各浸泡15 min后，在無水及體積分?jǐn)?shù)0.95、0.85、0.70乙醇中各浸泡5 min，以使切片脫蠟、脫水。沖洗10 min，用PBS沖洗4次，每次2 min。室溫下用體積分?jǐn)?shù)0.03過氧化氫孵育15 min，雙蒸水沖洗3次，PBS沖洗4次，每次3 min。在煮沸的檸檬酸抗原修復(fù)液(pH 6.0)中放入組織切片，繼續(xù)加熱2 min，室溫冷卻，雙蒸水沖洗3次，PBS沖洗4次，每次2 min，以使抗原修復(fù)。切片滴加一抗(DBC1兔抗人單克隆抗體(abcam公司，ab215852)，滴度1∶200；SIRT1兔抗人單克隆抗體(abcam公司，ab189494)，滴度1∶200)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗4次，每次2 min。在組織切片上滴加過氧化物酶標(biāo)記的抗兔聚合物，孵育30 min，PBS沖洗4次，每次2 min。切片滴加DAB辣根法顯色液，顯微鏡下觀察顯色反應(yīng)以便及時中止顯色。蘇木精復(fù)染，脫水，封片。PBS代替抗體作為陰性對照，已知的EC SIRT1和DBC1陽性表達(dá)組織作為陽性對照。

1.3 結(jié)果判定

細(xì)胞胞漿或胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。高倍鏡(100倍)下隨機(jī)選擇10個視野，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比及染色強(qiáng)度進(jìn)行評分。①染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：無著色0分，染色淺黃色1分，染色黃色2分，染色棕黃色3分；②陽性細(xì)胞所占百分比評分：陽性細(xì)胞<5%為0分，陽性細(xì)胞5%～25%為1分，陽性細(xì)胞26%～50%為2分，陽性細(xì)胞51%～75%為3分，陽性細(xì)胞76%～100%為4分。將①和②的評分結(jié)果相加，根據(jù)總分判定結(jié)果：≤3分為陰性表達(dá)，≥4分為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同子宮內(nèi)膜組織中DBC1和SIRT1蛋白表達(dá)比較

DBC1蛋白陽性表達(dá)位于子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞核或胞質(zhì)中，SIRT1蛋白陽性表達(dá)位于子宮內(nèi)膜組織的細(xì)胞漿或胞膜中。DBC1蛋白在EC組織中的陽性表達(dá)率(70.0%)明顯高于不典型增生子宮內(nèi)膜(65.0%)及對照組子宮內(nèi)膜(37.5%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.260,P<0.05)。其中EC組與對照組比較、不典型增生組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.343、6.054,P<0.05)。

SIRT1蛋白在EC中的陽性表達(dá)率(65.0%)高于不典型增生子宮內(nèi)膜(62.5%)及對照組子宮內(nèi)膜(30.0%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.370,P<0.05)。其中EC組與對照組比較、不典型增生組與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.765、6.599,P<0.05)。見圖1。

A～C為DBC1蛋白表達(dá)，D～F為SIRT1蛋白表達(dá)。A、D：正常子宮內(nèi)膜組織；B、E：不典型增生子宮內(nèi)膜組織；C、F：EC組織。免疫組化SP染色，100倍。圖1 EC、不典型增生子宮內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜組織DBC1和SIRT1蛋白表達(dá)

2.2 EC組織DBC1和SIRT1蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

DBC1蛋白表達(dá)與EC組織臨床分期(χ2=5.833，P<0.05)、手術(shù)病理分級(χ2=9.878，P<0.05)、肌層浸潤深度(χ2=8.733，P<0.05)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=5.945，P<0.05)，而與病人年齡分布無關(guān)(χ2=1.837，P>0.05)。

SIRT1蛋白表達(dá)與EC組織惡性程度(χ2=5.910，P<0.05)、手術(shù)病理分級(χ2=8.308，P<0.05)、肌層浸潤深度(χ2=10.972，P<0.05)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=5.918，P<0.05)，而與病人年齡分布無關(guān)(χ2=0.188，P>0.05)。見表1。

表1 EC組織DBC1蛋白及SIRT1蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3 EC組織DBC1蛋白和SIRT1蛋白表達(dá)的相關(guān)性

Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果表明，EC組織DBC1和SIRT1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.358，P<0.05)。見表2。不典型增生子宮內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜組織DBC1和SIRT1蛋白表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)。

表2 EC中DBC1蛋白及SIRT1蛋白表達(dá)的關(guān)系(例)

3 討 論

針對EC分子靶點的研究對于改善病人預(yù)后以及指導(dǎo)藥物治療等具有重要的意義。SIRT1是一種Ⅲ型組蛋白去乙酰化酶，屬于組蛋白去乙?；?HDACs)家族。已有研究顯示，HDAC3與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)；同時SIRT1在人宮頸癌組織中高表達(dá),且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、臨床病理分期密切相關(guān)[14-18]。有研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1在人EC中的表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織，敲除SIRT1可明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長[16]。此外，SIRT1高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞順鉑類以及紫杉醇化療耐藥有關(guān)，SIRT1抑制劑能有效逆轉(zhuǎn)這種耐藥抵抗[17]。SIRT1抑制劑已被應(yīng)用于乳癌、前列腺癌、慢性髓性白血病、肝癌等腫瘤的臨床研究中[18]。已有研究表明，SIRT1通過靶向作用于P53的賴氨酸382位點使其去乙?；⒔档推浠蜣D(zhuǎn)錄活性等機(jī)制導(dǎo)致腫瘤形成[19]。在腫瘤細(xì)胞中存在著SIRT1/P53通路的激活，其可以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡過程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活。目前，SIRT1已成為有效的抗癌靶點[20-23]。本研究結(jié)果顯示，SIRT1蛋白在EC組織表達(dá)部位為細(xì)胞核，其陽性表達(dá)率明顯高于不典型增生子宮內(nèi)膜及對照組子宮內(nèi)膜，提示SIRT1蛋白的表達(dá)與EC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

DBC1 最早被發(fā)現(xiàn)位于乳癌病人染色體8p21缺失區(qū)域[24]。已有研究表明，DBC1是SIRT1的內(nèi)生抑制劑[25]。最近的研究結(jié)果表明，DBC1可與SIRT1催化活性中心結(jié)合，從而抑制SIRT1去乙?；富钚?競爭性抑制SIRT1與底物P53結(jié)合[24]。DBC1與SIRT1的相互作用受磷酸化、SUMO化等翻譯后修飾的調(diào)節(jié)，去SUMO化酶SENP1可使DBC1去SUMO化，抑制DBC1與SIRT1的相互作用[26-27]。關(guān)于DBC1與腫瘤發(fā)病機(jī)制的關(guān)系尚存在爭議，DBC1的缺失與腫瘤發(fā)生的因果關(guān)系尚未確定。多項研究結(jié)果表明，DBC1在多種惡性腫瘤如乳癌、肝癌、結(jié)直腸癌中過表達(dá)，并且與不良預(yù)后有關(guān)[28-30]。然而也有研究表明，胃腺癌中DBC1的表達(dá)與較低的腫瘤學(xué)分期、較低的組織學(xué)分級以及更高的病人生存率密切相關(guān)[25]。表明SIRT1蛋白及DBC1蛋白在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。但有關(guān)DBC1在EC中的表達(dá)情況報道較少。本文研究結(jié)果顯示，DBC1蛋白表達(dá)部位多數(shù)位于細(xì)胞核，其在EC組織中的陽性表達(dá)率明顯高于不典型增生子宮內(nèi)膜及對照組子宮內(nèi)膜，表明DBC1蛋白的表達(dá)對EC的發(fā)生發(fā)展起到一定的促進(jìn)作用。

本文研究了EC組織中DBC1及SIRT1蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果表明，SIRT1、DBC1蛋白的表達(dá)與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤程度以及腫瘤分化程度有關(guān)，SIRT1蛋白及DBC1蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EC組織中的陽性表達(dá)率明顯高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，病理分級中/低分化EC組織的陽性表達(dá)率明顯高于高分化組織，而與病人年齡無關(guān)。表明DBC1及SIRT1蛋白的過表達(dá)能夠促進(jìn)EC的侵襲及轉(zhuǎn)移。本實驗結(jié)果還顯示，EC組織DBC1蛋白及SIRT1蛋白表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系，提示DBC1/SIRT1信號通路可能在EC的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。結(jié)合EC術(shù)后病理P53的檢測結(jié)果，推測EC 中DBC1及SIRT1可能受磷酸化及SUMO化調(diào)節(jié)，從而影響了DBC1-SIRT1間的相互作用，導(dǎo)致其相互作用減弱，釋放其中的SIRT1，進(jìn)而影響P53的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡作用減弱，癌細(xì)胞存活，從而促進(jìn)了癌癥的發(fā)生發(fā)展過程。但具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，DBC1及SIRT1與EC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，DBC1、SIRT1可能成為EC新的抗癌靶點。本研究尚存在不足，如樣本量過少，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏倚以及缺乏細(xì)胞實驗等。進(jìn)一步研究DBC1/SIRT1信號通路的作用有望為EC的治療開辟新的途徑。