老年復(fù)發(fā)性房顫病人血漿DNMT3A表達對PI3K/Akt信號通路的影響

周盼盼,趙映璇,趙玉蘭

(1 鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,河南 鄭州 450000； 2 河南大學(xué)附屬頤和醫(yī)院CCU)

心房顫動(房顫)的致殘和致死率較高，因射頻消融等治療方式的效果有限，房顫常演變?yōu)閺?fù)發(fā)性房顫，老年病人的病情相對而言更加復(fù)雜、預(yù)后生存情況更差[1-2]。房顫病人多伴發(fā)心肌纖維化現(xiàn)象，兩者可相互影響并促進疾病進展[3]。心肌細胞纖維化受到相關(guān)基因調(diào)控的影響，包括多種microRNAs DNA甲基化的影響。其中，microRNA-200b(miR-200b)表達異常在房顫的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并可以靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ZEB2基因表達[4-5]。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1可以通過miR-200b誘導(dǎo)人Tenon成纖維細胞(HTFs)發(fā)生纖維化，從而抑制磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)基因的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[6]。TGF-β1還可以通過上調(diào)miR-200b表達水平，促進α-平滑肌肌動蛋白、纖維連接蛋白和COL1A1在HTFs中的表達。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)是催化多種microRNAs發(fā)生啟動子特異位點甲基化的關(guān)鍵功能酶，是調(diào)控基因表觀遺傳沉默的重要參與者[7]。DNMT3A和miR-200b在心肌成纖維細胞的自噬活性調(diào)控與心肌纖維化過程中扮演重要角色[8]。DNMT3A表達水平的上調(diào)與miR-200b在纖維化組織和心肌成纖維細胞中的表達有關(guān)，可能是影響miR-200b功能表達的重要因素之一[9]。而磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是參與房顫發(fā)生發(fā)展的重要通路。本研究旨在探討老年復(fù)發(fā)性房顫病人血漿DNMT3A的表達及其對miR-200b和PI3K/Akt信號通路表達的影響，從而為房顫的分子靶向治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2020年1月—2021年6月，選擇在本院診斷為非瓣膜性房顫的老年病人184例，包括初發(fā)房顫102例(初發(fā)組，病程<48 h)和復(fù)發(fā)房顫82例(復(fù)發(fā)組，術(shù)后>3個月時復(fù)發(fā)且持續(xù)時間>30 s)，另選擇本院80例性別和年齡相匹配的健康老年人作為對照組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>60歲；②具有房顫心電圖典型表現(xiàn)，P波消失，表現(xiàn)出波幅、大小完全不同的顫動波；③符合醫(yī)學(xué)倫理要求，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①先天性心臟病、瓣膜性心臟病；②嚴(yán)重肝腎功能障礙、自身免疫性疾病。

1.2 檢測方法

在房顫病人入院48 h內(nèi)且未進行藥物治療前完成采血和超聲檢查，采用彩色多普勒超聲檢測左心房和左心室體積以及左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，采用放射免疫法檢測血清N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)水平，實時定量PCR(qRT-PCR)法檢測血清DNMT3AmRNA和miR-200b表達，Western blot法檢測血清PI3K和Akt蛋白表達。

1.2.1超聲檢測心臟體積和LVEF 檢測所用儀器為美國飛利浦IE Elite 超聲診斷儀，配套S5-1心臟探頭(頻率為1.0～5.0 MHz)和經(jīng)食管三維X7-2t探頭(頻率為2.0～7.0 MHz)。在胸骨旁左心室長軸切面上，二維超聲清晰顯示主動脈根部和左心房，從主動脈根部垂直左心房測量左心房前后徑。采用面積-長度法測量左心房的最大容積，計算左心房容積指數(shù)(左心房容積/體表面積)。采用改良雙平面Simpson法分別測量心尖四室和心尖兩室心臟切面上的左心室舒張末期容積(LVEDV)和收縮末期容積(LVSDV)，并計算LVEF，LVEF=(LVEDV-LVSDV)/LVEDV×100%。

1.2.2放射免疫法檢測血清NT-proBNP水平 采集病人清晨空腹外周靜脈血8 mL于抗凝管中，以3 500 r/min離心15 min，取上清液，-80 ℃保存待集中檢測。試劑購自美國Sigma公司，批間和批內(nèi)變異度<15%。根據(jù)試劑說明書步驟進行檢測，測量3次取平均值。

1.2.3qRT-PCR檢測血清DNMT3AmRNA以及miR-200b的表達 血清樣本以3 500 r/min離心20 min，取上清液，采用異硫氰酸胍氯化銫超速離心法提取RNA，用紫外吸收法測定RNA的濃度和純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Santa Cruz公司)提示步驟合成目的基因cDNA。所用引物序列見表1。然后按照PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)配制反應(yīng)體系50 μL。PCR擴增參數(shù)：93 ℃預(yù)變性2 min；93 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物與DNA Lad-der在20 g/L瓊脂糖凝膠上電泳、染色，檢測產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶，結(jié)果以2-△△Ct表示。

表1 PCR引物序列

1.2.4Western blot法檢測血清PI3K和Akt蛋白表達 血清樣本以3 500 r/min離心20 min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒(美國R&D公司)測定蛋白濃度和純度，用內(nèi)參β-actin抗體進行劑量標(biāo)準(zhǔn)化。取30 μg樣品蛋白和等量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，經(jīng)80 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，將分離區(qū)帶電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，滴加小鼠抗人PI3K/Akt和β-actin抗體一抗(稀釋度為1∶2 000，美國Sigma公司)靜置過夜，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，滴加兔抗小鼠抗體二抗(1∶500，美國Sigma公司)室溫孵育4 h，以PBS洗滌后進行增強型化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色。應(yīng)用Lab Works 4.5凝膠成像軟件(美國Invitrogen 公司)進行半定量分析，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的條帶灰度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組一般臨床資料比較

各組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、高血壓、糖尿病和吸煙情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，初發(fā)組和復(fù)發(fā)組病人房顫類型比較差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組一般臨床資料比較

2.2 各組心臟體積比較

復(fù)發(fā)組左心房容積和容積指數(shù)較初發(fā)組和對照組明顯增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.635、7.532，P<0.05)，但各組左心室體積比較差異無顯著意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組心臟體積的比較

2.3 各組LVEF和NT-proBNP比較

各組LVEF和血清NT-proBNP水平比較差異均無顯著性(P>0.05)。見表4。

表4 各組LVEF和NT-proBNP的比較

2.4 各組血清DNMT3A mRNA和miR-200b水平比較

與初發(fā)組和對照組相比較，復(fù)發(fā)組病人的血清DNMT3AmRNA水平明顯升高，miR-200b水平明顯降低，差異有顯著性(F=219.094、219.600，P<0.05)。見表5。

表5 各組血清DNMT3A mRNA和miR-200b水平比較

2.5 各組血清PI3K和Akt蛋白表達比較

復(fù)發(fā)組血清PI3K和Akt蛋白水平較初發(fā)組和對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=156.719、46.498，P<0.05)。見表6。

表6 各組血清PI3K和Akt蛋白水平比較

2.6 相關(guān)性分析

Pearson檢驗顯示，血清DNMT3AmRNA水平與左心房容積和容積指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.829、0.81，P<0.05)，血清PI3K和Akt蛋白水平與左心房容積和容積指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.653～0.868，P<0.05)，而miR-200b與左心房容積和容積指數(shù)、血清DNMT3AmRNA水平、PI3K和Akt蛋白表達均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.964～-0.777，P<0.05)。

3 討 論

SOHNS等[10]指出，房顫的概念已從單純的心律失常發(fā)展到基于心律失常底物的心肌病。晚期釓增強心臟磁共振成像可顯示心房纖維化，心房纖維化是房顫介入治療結(jié)果的有力預(yù)測指標(biāo)。個體化和纖維化導(dǎo)向的房顫治療策略雖然看起來很有希望，但還有待于前瞻性、多中心試驗研究的結(jié)果證實。DZESHKA等[11]認(rèn)為，房顫病人存在明顯的心肌纖維化，房顫與心房的結(jié)構(gòu)、大小和收縮性重塑密切相關(guān)。心房纖維化的發(fā)生和發(fā)展是房顫結(jié)構(gòu)重塑的標(biāo)志，被認(rèn)為是房顫持續(xù)存在的基礎(chǔ)。而心室纖維化可能可以促進心臟舒張性和收縮性的異常及心力衰竭的發(fā)展。鑒于房顫和心力衰竭經(jīng)常并存，而且二者均會影響病人的預(yù)后，故更好地了解房顫纖維化和心力衰竭的相互作用具有重要意義[12]。

心肌細胞纖維化受到多種microRNAs的DNA甲基化的影響。ZHOU等[13]研究證實，miR-221異常表達在大鼠心肌梗死模型中具有心肌保護和抗纖維化的作用。CHE等[14]研究則發(fā)現(xiàn)，褪黑素通過抑制糖尿病心肌病中l(wèi)ncRNA-MALAT1/miR-141介導(dǎo)的炎性小體NLRP3的炎癥反應(yīng)和TGF-β1/Smads信號通路活化，減輕心肌纖維化。DNMT3A是催化多種microRNAs發(fā)生啟動子特異位點甲基化的關(guān)鍵功能酶，已證實血清miR-200b、DNMT3A水平與房顫發(fā)生及進展相關(guān)?；诖?，本研究重點分析老年復(fù)發(fā)性房顫病人的心房結(jié)構(gòu)和血清miR-200b、DNMT3A表達的關(guān)系，結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)組病人左心房容積和容積指數(shù)比初發(fā)組和對照組明顯增大，但各組左心室體積、LVEF和血清NT-proBNP水平差異無顯著性，提示左心房結(jié)構(gòu)變化與房顫的發(fā)生尤其是房顫復(fù)發(fā)具有密切關(guān)系。與初發(fā)組和對照組比較，復(fù)發(fā)組血清DNMT3AmRNA和PI3K、Akt蛋白水平明顯升高，而miR-200b水平明顯降低，提示復(fù)發(fā)房顫可能與血清miR-200b表達下調(diào)、DNMT3A活性上調(diào)以及PI3K/Akt信號通路激活具有密切聯(lián)系。PANG等[15]的研究表明，MYC和DNMT3A介導(dǎo)的DNA甲基化抑制miR-200b在三陰性乳癌中的表達。TAO等[16]的研究結(jié)果也表明，DNMT3A沉默Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族1亞型A(RASSF1A)通過上調(diào)ERK1/2表達促進心肌纖維化。心肌纖維化是房顫的發(fā)病機制之一，DNA甲基化在維持心肌纖維化中起著重要作用，RASSF1A在心肌纖維化中的表達下調(diào)與DNMT3A有關(guān)；DNMT3A抑制劑5-AzaDc可以抑制心肌成纖維細胞增殖，還可以防止RASSF1A在激活的心肌成纖維細胞中表達丟失[17]。以往多認(rèn)為RASSF1A與肺癌有關(guān)，為重要的抑癌基因[18-19]。而現(xiàn)已經(jīng)證實RASSF1A的下調(diào)與心肌纖維化和成纖維細胞的活化密切相關(guān)，DNMT3A基因敲除可以促進心肌成纖維細胞中RASSF1A表達的升高[20]。

本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清DNMT3AmRNA和PI3K、Akt蛋白水平與左心房容積和容積指數(shù)呈正相關(guān)，miR-200b與左心房容積和容積指數(shù)、血清DNMT3AmRNA水平、PI3K和Akt蛋白表達呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。可見，老年復(fù)發(fā)性房顫病人左心房結(jié)構(gòu)的改變與miR-200b表達下調(diào)、DNMT3A活性上調(diào)以及PI3K/Akt信號通路激活具有密切聯(lián)系[21-22]。除了左心房結(jié)構(gòu)改變是觸發(fā)和維持房顫的重要因素之外，機體異常表達miR-200b以及影響其基因甲基化酶的DNMT3A，也可能通過PI3K/Akt信號通路參與心肌細胞的纖維化過程[23-25]。

綜上所述，DNMT3A可能影響miR-200b表達和PI3K/Akt信號通路活性，參與老年復(fù)發(fā)性房顫的發(fā)生。miR-200b、DNMT3A以及PI3K/Akt信號通路在老年復(fù)發(fā)性房顫的發(fā)生以及心肌纖維化的過程中可能發(fā)揮重要作用。本研究不足之處：未能觀察到房顫病人的心房肌細胞發(fā)生纖維化；血清中miR-200b、DNMT3A以及PI3K/Akt的異常表達可能存在多個干擾因素，尚不能得出與房顫的直接關(guān)系；miR-200b的異常表達是否與DNMT3A直接相關(guān)還有待深入分析。因此，老年復(fù)發(fā)性房顫發(fā)生的具體機制還有待動物模型和體外細胞實驗的進一步研究。