環(huán)指蛋白187在乳癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

繆姍姍,紀(jì)涵青,吳琍

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科,山東 青島 266003)

環(huán)指蛋白187(RNF187)是一種E3泛素-蛋白連接酶。它含有E3泛素連接酶的環(huán)結(jié)構(gòu)域，因而具有E3泛素連接酶活性并可以促進(jìn)底物泛素化，再通過MAP3K1通路應(yīng)答生長(zhǎng)因子信號(hào)。有研究表明，下調(diào)MAP3K1可以抑制食管癌和乳癌細(xì)胞的增殖[1-2]。RNF187被鑒定為一種共激活物，主要連接c-Jun和Ras信號(hào)。相關(guān)研究表明，多種癌基因如Ras、Bcr-Abl、Met和c-Fos傳遞的癌基因信號(hào)都依賴c-Jun的激活，RNF187通過c-Jun信號(hào)通路參與癌基因信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)癌癥進(jìn)展[3-4]。RNF187被證實(shí)在肝癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和骨肉瘤中過表達(dá)，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[5-6]。然而，RNF187在乳癌中的表達(dá)及其臨床意義尚不清楚。本研究旨在探討RNF187在乳癌中的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇青島大學(xué)附屬醫(yī)院2019 年 5月—2020年5月行乳癌改良根治術(shù)的女性病人52例，收集其乳癌組織和癌組織邊緣5 cm以上的正常乳腺組織樣本。病人納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前活檢確診為乳癌；②術(shù)前未接受新輔助治療；③臨床病理資料完整并同意接受手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有其他惡性腫瘤史或轉(zhuǎn)移性乳癌病史的病人；②特殊類型乳癌、炎性乳癌等；③合并其他慢性疾病或不能接受手術(shù)治療的病人。按TNM 國(guó)際分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期28例，Ⅱ期22例，Ⅲ期2例。腫瘤直徑0.8～4.5 cm，平均(1.8±0.4)cm。根據(jù)病人有無(wú)間質(zhì)脈管癌栓發(fā)生，分為高風(fēng)險(xiǎn)組(有間質(zhì)脈管癌栓)29例和低風(fēng)險(xiǎn)組(沒有間質(zhì)脈管癌栓)23例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與研究對(duì)象或其家屬簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

所用TRizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser以及SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ (TliRNaseH Plus)購(gòu)自TaKaRa(寶生物)公司；ROX plus合成引物購(gòu)自GENEWIZ公司；鼠抗人RNF187 抗體購(gòu)自北京博奧森公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自Servicebio公司。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)方法檢測(cè)RNF187 mRNA的表達(dá)情況

按照TRizol試劑盒說明書提取總 RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。使用20 ng cDNA、200 nmol/L正反向引物以及Taqman Master Mix(德國(guó)羅氏診斷公司)進(jìn)行RNF187和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的PCR擴(kuò)增。引物及其序列見表1。PCR在光循環(huán)機(jī)中進(jìn)行45個(gè)周期，每個(gè)周期包括：95 ℃變性15 s，引物55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40 ℃冷卻30 s。本檢測(cè)方法以GAPDH 作為內(nèi)參，RNF187mRNA 相對(duì)表達(dá)量用 2-△△Ct法計(jì)算。

表1 qRT-PCR引物及其序列

1.4 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)RNF187蛋白的表達(dá)

將標(biāo)本固定、脫水、切片后，滴加兔抗人(1∶60)多克隆一抗，4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)溫，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育30 min，DAB避光顯色，沖洗后蘇木精復(fù)染，透明，封片，觀察RNF187蛋白表達(dá)情況。RNF187表達(dá)陽(yáng)性呈棕黃顆粒染色，顏色越深表明表達(dá)越強(qiáng)；若未出現(xiàn)棕黃顆粒染色則為陰性。采用BI-2000圖像分析系統(tǒng)，隨機(jī)選取5個(gè)視野，檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞平均積分光密度值，以平均積分光密度值≥2為高表達(dá)，<2為低表達(dá)。染色強(qiáng)度分為0～3級(jí)：0級(jí)，陰性染色；1級(jí)，弱陽(yáng)性染色；2級(jí)，中度陽(yáng)性染色；3級(jí)，強(qiáng)陽(yáng)性染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 乳癌及癌旁正常組織中RNF187 mRNA的表達(dá)比較

乳癌組織中RNF187mRNA表達(dá)量為2.52±0.60，明顯高于癌旁正常組織(0.67±0.04)，差異有顯著性(t=2.887，P<0.05)。高風(fēng)險(xiǎn)組RNF187mRNA表達(dá)量為2.76±0.42,明顯高于低風(fēng)險(xiǎn)組(0.88±0.07)，差異有顯著性(t=3.676，P<0.05)。

2.2 乳癌及癌旁正常組織中RNF187表達(dá)比較

RNF187陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核中，以胞質(zhì)為主(圖1A、C)；乳癌細(xì)胞呈明顯深染(圖1B、C)，而癌旁正常組織RNF187呈淡染(圖1A)。乳癌細(xì)胞RNF187高表達(dá)37例(71%)，低表達(dá)15例(29%)；相應(yīng)的癌旁正常組織中RNF187高表達(dá)13例(25%)，低表達(dá)39例(75%)，差異有顯著性(χ2=22.190，P<0.01)。高風(fēng)險(xiǎn)組RNF187高表達(dá)者23例(79%)，低風(fēng)險(xiǎn)組RNF187高表達(dá)者12例(52%)，差異有顯著性(χ2=4.293，P<0.05)。

A：癌旁正常組織；B：乳癌組織低表達(dá)組；C：乳癌組織高表達(dá)組。SP染色，400倍。圖1 乳癌及癌旁正常組織中RNF187的免疫組化檢測(cè)

2.3 乳癌組織中RNF187表達(dá)與病人臨床病理特征的關(guān)系

RNF187的表達(dá)與乳癌病人年齡、發(fā)病時(shí)間、月經(jīng)情況、生育情況、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)陽(yáng)性率的關(guān)系差異無(wú)顯著性(P>0.05)，與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、有無(wú)間質(zhì)脈管癌栓有關(guān)(χ2=4.293，H=3.445～37.510，P<0.05)。見表2。

表2 乳癌病人RNF187表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

3 討 論

乳癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳癌病人預(yù)后不良的關(guān)鍵因素[7]。根據(jù)乳癌NCCN指南,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管癌栓侵犯是乳癌病人不良預(yù)后的重要指標(biāo),也直接影響后續(xù)治療方案的選擇。調(diào)查顯示,伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和瘤周脈管侵犯的乳癌病人總生存率遠(yuǎn)低于對(duì)照組。穆凌光等[8]研究顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性是乳癌改良根治術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。目前，乳癌的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)因能特異性地識(shí)別降解底物蛋白,在細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用。蛋白泛素化過程由3種酶依次催化完成：E1泛素激活酶、E2泛素連接酶和E3泛素連接酶。E3泛素連接酶決定了泛素化底物的特異性，同時(shí)也是是腫瘤靶向治療的有效靶標(biāo)[9]。RNF187是具有N端RING結(jié)構(gòu)域的RING型E3連接酶家族之一，具有E3泛素連接酶活性并可促進(jìn)底物的泛素化，在DNA損傷修復(fù)中起著抑制性作用[10]。

已有研究表明，RNF187與細(xì)胞分化、增殖、凋亡和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[11]。過表達(dá)RNF187可誘導(dǎo)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，并與Ras基因協(xié)同促進(jìn)腫瘤生成。RNF187通過MAP3K1途徑響應(yīng)生長(zhǎng)因子信號(hào)。MAP3K1屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶家族，在細(xì)胞增殖過程中起重要作用，可與Ras直接反應(yīng)參與Ras信號(hào)傳導(dǎo)途徑。MAP3K1基因缺陷小鼠乳癌的轉(zhuǎn)移受到抑制[12]。相關(guān)研究表明，RNF187通過MAP3K1通路，作為Jun介導(dǎo)的基因激活的輔助激活物，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移[13]。RNF187過表達(dá)激活了Wnt和Ras通路，加速了結(jié)腸上皮瘤的發(fā)生[14]。高水平的RNF187增強(qiáng)了骨肉瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖[15]。另有研究表明，上調(diào)RNF187表達(dá)明顯增強(qiáng)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和集落形成，高水平的RNF187主要通過激活有絲分裂原活化蛋白激酶和PI3K信號(hào)，通過誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化和凋亡抵抗來促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌病情的進(jìn)展[15];卵巢癌中高水平的RNF187表達(dá)與惡性表型顯著相關(guān)，能促進(jìn)卵巢癌的增殖和遷移，抑制卵巢癌的分化，RNF187的高表達(dá)與卵巢癌病人預(yù)后不良密切相關(guān)，是獨(dú)立的預(yù)后因素[16-18]。

本文研究檢測(cè)了乳癌細(xì)胞和癌旁正常組織中RNF187基因和蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，無(wú)論是在轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平，乳癌組織RNF187的表達(dá)均高于相應(yīng)的鄰近癌旁組織，提示乳癌組織中RNF187的高表達(dá)與異常的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，RNF187高表達(dá)與乳癌病人的侵襲性臨床病理特征相關(guān)，如腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、間質(zhì)脈管癌栓、臨床分期晚等，提示RNF187可能與乳癌預(yù)后不良密切相關(guān)。本文根據(jù)乳癌病人有無(wú)間質(zhì)脈管癌栓的發(fā)生，將乳癌病人分為不同風(fēng)險(xiǎn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組(有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或臨床中晚期)病人RNF187的表達(dá)顯著高于低風(fēng)險(xiǎn)組(無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或臨床早期)病人。提示RNF187的高表達(dá)可能與乳癌的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)。

綜上所述，乳癌組織中RNF187的高表達(dá)可能與復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后有關(guān)，可能為乳癌的獨(dú)立預(yù)后因素。對(duì)RNF187進(jìn)行深入研究將有助于我們發(fā)現(xiàn)新的治療靶標(biāo)，在未來的乳癌治療中發(fā)揮積極作用。