磁性四氧化三鐵納米粒的制備、表面改性及表征*

王高強(qiáng)，卯明艷，余開湖，2**

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.咸寧市中心醫(yī)院)

在醫(yī)藥領(lǐng)域，針對氧化鐵的研究很多，這主要是因?yàn)檠趸F比其他磁性材料具有更好的靶向性、生物兼容性、生物降解性和生物安全性[1]。氧化鐵在自然界中自然存在，也可以在實(shí)驗(yàn)室中合成。超順磁性氧化鐵納米粒(SPIONS)是一種新型的超順磁性納米材料，已廣泛應(yīng)用于磁共振成像、腫瘤熱療、靶向給藥系統(tǒng)等領(lǐng)域[2]。SPIONS在生物分布、代謝速度、熱穩(wěn)定性以及矯頑力等理化性質(zhì)方面展現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性，上述性質(zhì)主要取決于SPIONS的粒徑、磁性、結(jié)構(gòu)以及表面偶聯(lián)、枝接的材料[3]，其高滲透性和滯留效應(yīng)以及超順磁性有助于它們在靶點(diǎn)上的大量富集和實(shí)現(xiàn)靶向給藥，從而達(dá)到精準(zhǔn)治療目的。

研究表明[4]，在納米粒子上負(fù)載各種治療和診斷試劑可以特異性地識別靶細(xì)胞，或調(diào)節(jié)納米粒子的電荷并靶向識別基團(tuán)，使其更容易進(jìn)入靶細(xì)胞。磁性納米球結(jié)構(gòu)中的殼層大多都具有良好的生物相容性，對人體不會造成傷害，沒有毒副作用，磁性納米微球的磁核可以很方便的從人體內(nèi)自然排出。磁性載體的生物相容性和生物降解性在生物醫(yī)學(xué)方面更為重要，因此，磁性載體在生物醫(yī)學(xué)治療中具有非常廣闊的前景。

本文主要研究檸檬酸/四氧化三鐵納米粒的合成方法，不僅可以在病變細(xì)胞周圍富集，而且具有高飽和磁化強(qiáng)度(Ms)的超順磁性，簡化納米粒子的純化，提高純化效率，并且它的靶向性在外加磁場的作用下，可以作為靶向藥物載體，應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)研究的多個(gè)方面，包括治療藥物、基因靶向和放射性核素的遞送、熱療和造影劑在磁共振成像(MRI)中的應(yīng)用等[5]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

所需的實(shí)驗(yàn)試劑名稱、規(guī)格及廠家見表1。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器見表2。

表1 具體實(shí)驗(yàn)試劑

表2 設(shè)備與儀器

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磁性四氧化三鐵納米粒(SPIONS)的制備

將1.5g乙酰丙酮鐵Fe(Acac)3加入15mL二芐醚和15mL油胺溶液中，于三頸圓底燒瓶中混合均勻，期間勻速充入氮?dú)?，置于集熱磁力攪拌器上，油封隔絕空氣，維持30min。加熱至100℃維持1h，然后以15℃/10min并維持5min，將溫度升至295℃。當(dāng)出現(xiàn)3次白霧現(xiàn)象后停止反應(yīng)，冷卻至室溫后，用無水乙醇洗滌，重復(fù)3次直至上清無渾濁，收集產(chǎn)物，置于真空干燥箱中，調(diào)節(jié)溫度至50℃進(jìn)行干燥過夜。

1.2.2 檸檬酸四氧化三鐵納米粒(SPIONS@CA)的制備

三頸圓底燒瓶內(nèi)加入10mL DCB、10mL DMF充分混合，取120mg干燥的SPIONS加入混合液中，超聲分散均勻，通入氮?dú)?，持續(xù)攪拌。稱取0.1g CA加入其中，升溫至110℃，持續(xù)反應(yīng)24h后停止加熱，待其自然降至常溫，加入過量乙醚沉淀產(chǎn)物，以磁鐵分離產(chǎn)物，去除上清，適量丙酮洗滌產(chǎn)物3次，磁體分離，50℃真空干燥，獲得CA修飾氧化鐵納米粒(SPIONS@CA)，終產(chǎn)物置于干燥鍋內(nèi)保存待用。

1.3 測試及表征

1.3.1 X射線衍射(XRD)

取少許干燥樣品，用瑪瑙研缽研細(xì)，平鋪于載玻片上，X射線衍射儀進(jìn)行分析測定。測量參數(shù)：加速電壓40kv，電流30mA，測量2θ角范圍為10°～80°，Cu-Kα靶。XRD數(shù)據(jù)圖譜用Origin 2019 b進(jìn)行分析處理繪圖。

1.3.2 傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)

SPIONS、SPIONS@CA、CA紅外表征：各稱取2mg干燥樣品，分別與100mg KBr置于紅外燈下干燥。充分混勻，倒入瑪瑙研缽中繼續(xù)研磨，用液壓儀制成薄片，在紅外光譜儀中進(jìn)行檢測。

1.3.3 粒徑及Zeta電位測試

分別取少量樣品超聲分散于2mL RO水中，超聲功率40%，每次5min，共15min。取超聲分散后溶液50μL加入2mL RO水中，經(jīng)兩倍稀釋后用動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)分析粒度分布及Zeta電位。通過Scherrer公式計(jì)算出制得樣品的平均粒徑D：

D=Kλ/(βcosθ)

D：平均粒徑；K：形態(tài)因子(一般取0.89)；λ：X射線波長(0.15406nm)；β：衍射峰半高度；θ：布拉格衍射角。

2 結(jié) 果

2.1 X射線衍射(XRD)

為了確定制得的產(chǎn)品是否為Fe3O4，對其進(jìn)行XRD測定。圖1為樣品XRD譜圖。從譜圖來看，衍射峰的位置、強(qiáng)度結(jié)果與Fe3O4標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)基本吻合，2θ=30.46°、35.35°、43.68°、54.31°、57.13°、63.75°處的六個(gè)衍射峰分別對應(yīng)(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)的六個(gè)晶體面，這說明通過高溫?zé)峤夥ㄖ频玫漠a(chǎn)物為Fe3O4，并具備立方晶體結(jié)構(gòu)。

圖1 Fe3O4的XRD譜圖

2.2 傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)

為驗(yàn)證CA與Fe3O4納米粒接枝成功，對純CA、未經(jīng)CA改進(jìn)的Fe3O4、CA改進(jìn)的Fe3O43種樣品進(jìn)行測定，相應(yīng)的的紅外光譜如圖2所示。

從圖2(a)曲線可以看出，在波數(shù)584cm-1處的吸收峰是由Fe-O鍵的振動(dòng)引起的，此為Fe3O4的特征吸收峰；從圖2(b)曲線可以看出，在波數(shù)596cm-1處的吸收峰是由Fe-O鍵的振動(dòng)引起的，也是Fe3O4的特征吸收峰，在波數(shù)1357cm-1、1608cm-1處的吸收峰是-CO鍵的特征吸收峰，顯示Fe3O4納米粒子表面成功修飾上了CA，證明CA分子成功包覆在Fe3O4納米粒子表面；從圖2(c)曲線可以看出，在3495cm-1、1695cm-1、1394cm-1處的振動(dòng)吸收峰分別為CA分子當(dāng)中-OH的振動(dòng)吸收峰以及-CO的振動(dòng)吸收峰。由此，也可以表明CA分子確實(shí)修飾在了Fe3O4納米粒上面。

圖2 CA、SPIONS@CA、SPIONS的紅外光譜圖

2.3 粒徑及Zeta電位測試

高溫?zé)峤夥ㄖ苽涞腇e3O4納米粒表面包覆有油胺，導(dǎo)致其疏水性強(qiáng)，在極性較大的溶液中容易沉淀，不利于其在生物體中的應(yīng)用。為了便于Fe3O4納米粒長時(shí)間參與生物體內(nèi)的血液循環(huán)，所以它的表面要用CA進(jìn)行修飾，以促進(jìn)Fe3O4納米粒由疏水性向親水性轉(zhuǎn)變，實(shí)現(xiàn)Fe3O4納米粒在水溶液中的均勻分散。SPIONS和SPIONS@CA的粒徑測量結(jié)果見圖3。

如圖3(a)所示，合成的SPIONS粒徑為(91.24±7)nm；圖3(b)所示，SPIONS@CA的粒徑為(119.41±7)nm，PDI(多分散指數(shù))=0.223，分散均勻。粒徑分布較窄，可見包覆CA之后，粒徑增大了30nm左右。

圖3 SPIONS、SPIONS@CA的粒徑分布圖

通過圖4(a)SPIONS和圖4(b)SPIONS@CA的Zeta電勢結(jié)果可知，合成的SPIONS和SPIONS@CA的Zeta電勢分別為-37.53mV和-20.6mV，包覆CA之后，Zeta電勢明顯增大。粒徑和電勢的結(jié)果在一定程度上可以說明CA和SPIONS的成功包覆。

(a)SPIONS電勢分布；(b)SPIONS@CA電勢分布

3 討 論

高溫?zé)峤夥ɑ驹硇枰袡C(jī)金屬前驅(qū)體(organometallic precursor)在高溫下分解，同時(shí)在體系中引入合適的表面活性劑[6]，來調(diào)控粒子的成核和生長。常用的金屬-有機(jī)前體一般為金屬乙酰丙酮絡(luò)合物，如Fe(CO)5、Co2(CO)8等[7]。表面活性劑一般用長鏈脂肪族羧酸、長鏈族脂肪胺、有機(jī)磷化合物，如油酸、油胺等[8]。由于該反應(yīng)需要使用化學(xué)性質(zhì)比較活潑的金屬-有機(jī)前體，因此，經(jīng)常需要不斷地向反應(yīng)體系中持續(xù)通入氮?dú)庖匀コ諝?，反?yīng)條件相對苛刻；而且由于反應(yīng)過程中需要用到一些有毒試劑，如有機(jī)金屬-前體等，環(huán)境友好性較差，因此，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程需要在通風(fēng)廚中進(jìn)行。

該方法合成的四氧化三鐵納米粒由于其特定的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，在表面大多都有強(qiáng)疏水基團(tuán)覆蓋，使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到了限制，不能直接用于科研或臨床需要。在合成納米顆粒的表面修飾過程中，磁性納米顆粒的化學(xué)穩(wěn)定性和單分散性，促進(jìn)了功能分子的進(jìn)一步連接，擴(kuò)大了其應(yīng)用空間，因此，對四氧化三鐵納米粒表面進(jìn)行修飾改性，增加修飾基團(tuán)是不可或缺的一步。另一方面，由于反應(yīng)是在高溫下進(jìn)行的，反應(yīng)體系是非極性溶劑，以及表面活性劑分子的應(yīng)用[9]，所有這些因素使得最終樣品的晶體形狀和粒度分布都比較理想，此外，產(chǎn)品的產(chǎn)量也相當(dāng)可觀[10]。

磁球藥物載體是納米技術(shù)和現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)相融合的產(chǎn)物，具有尺寸效應(yīng)小、優(yōu)良的靶向性、生物相容性、生物降解性和功能基團(tuán)等優(yōu)點(diǎn)，因此，它有望解決傳統(tǒng)藥物在循環(huán)系統(tǒng)中無法滯留并達(dá)到有效濃度、無法達(dá)到特定靶點(diǎn)、無法在機(jī)體內(nèi)某一部位形成高濃度聚集而沒有毒副作用等問題。目前，常用的磁性材料有Fe-Co合金、Fe2O3、Fe3O4等，對其采用適當(dāng)?shù)姆绞娇梢院芊奖愕氐玫郊{米級的磁性材料。由于磁性顆粒表面覆蓋有功能基團(tuán)，它們可以連接生物活性物質(zhì)，同時(shí)，磁性顆粒表面的特定靶向分子也可以通過靶向分子與細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向治療、基因治療、生物醫(yī)學(xué)同位素標(biāo)記等[11]。

本實(shí)驗(yàn)首先以乙酰丙酮鐵Fe(Acac)3為原料，以二芐醚和油胺溶液為溶劑，以檸檬酸為穩(wěn)定劑，使用高溫?zé)峤夥ㄖ苽錂幟仕岣倪M(jìn)的Fe3O4納米粒，并分別用X射線衍射儀、傅立葉變換紅外光譜儀、激光粒度儀等儀器對其進(jìn)行表征；下一步工作，將會把檸檬酸改進(jìn)的Fe3O4納米粒與FUNDC1-TTC融合蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，繼續(xù)運(yùn)用前述方法以及考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行表征與驗(yàn)證。

本研究使用高溫?zé)峤夥ㄖ苽涑鯢e3O4@CA納米粒子，制備和純化方法簡單，成本低。通過用檸檬酸對Fe3O4進(jìn)行修飾后，檸檬酸可以很好地包覆在Fe3O4納米粒子表面。在Fe3O4納米粒子表面增添羧基基團(tuán)后，后續(xù)可進(jìn)行相關(guān)蛋白的偶聯(lián)工作，為制備新型的納米藥物載體提供了一種新的方法，同時(shí)對磁球靶向載藥系統(tǒng)的研究也有進(jìn)一步的推動(dòng)作用。磁球靶向載藥系統(tǒng)在外加磁場的作用下，可以通過動(dòng)脈或者靜脈注入的方式，把攜帶藥物的載體一同運(yùn)輸?shù)綑C(jī)體病變的部位或者細(xì)胞靶點(diǎn)，使其在病變部位富集并產(chǎn)生效應(yīng)。但為了治療深層組織或器官，則需要對磁球的磁場強(qiáng)度做進(jìn)一步的改善，又因?yàn)槲⑶虮砻娴耐繉訒蟠蠼档痛判晕⑶虻拇判裕砸勾徘虻拇艔?qiáng)得到進(jìn)一步增強(qiáng)是比較困難的，而且粒徑大小的控制也是亟待解決的問題。