苜蓿與根瘤菌專一性共生及可遺傳性共生體選育

康文娟，劉暢，師尚禮

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中‐美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

根瘤菌（Rhizobium）是一類與豆科植物共生形成根瘤，將大氣中的無機(jī)氮固定轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮，從而供給植物營養(yǎng)的有益細(xì)菌。苜蓿與根瘤菌的共生固氮作用對苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)的改善至關(guān)重要。草地畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家在種植苜蓿時(shí)均普遍接種根瘤菌，然而由于多種內(nèi)在（如苜?；蛐秃透鼍蛐停┖屯庠冢ㄖ饕ㄍ寥览砘蜃?、草地種植年限、播種方式、根瘤菌劑接種方式和土著根瘤菌等）因素的影響，人工接種根瘤菌劑的結(jié)瘤固氮效果不太理想［1］。內(nèi)生根瘤菌（Endophytic rhizobia）是指定殖于宿主植物不同組織內(nèi)部，外部不引起任何病理反應(yīng)，能優(yōu)先結(jié)瘤固氮并具有明顯促生作用的內(nèi)生菌群［2-3］。內(nèi)生根瘤菌普遍存在于苜蓿種子中，且通過種子進(jìn)行垂直傳播。利用內(nèi)生根瘤菌的結(jié)瘤促生優(yōu)勢及其穩(wěn)定遺傳特性，通過接種構(gòu)建“根瘤菌-苜?！惫采w，培育內(nèi)生根瘤菌苜蓿共生體新種質(zhì)，是解決人工接種根瘤菌劑低效問題的重要途徑，也是推進(jìn)農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的有效措施。筆者從苜蓿根瘤菌共生效應(yīng)高效利用的角度出發(fā)，提出了 “共生育種”的概念，闡述了苜蓿-根瘤菌共生育種的理論基礎(chǔ)、實(shí)施過程及其一般程序。

1 共生固氮效應(yīng)的應(yīng)用現(xiàn)狀

土壤氮素供應(yīng)不足是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中普遍存在的問題。依靠化學(xué)肥料解決作物缺氮問題，可在一定時(shí)期內(nèi)促進(jìn)作物增產(chǎn)。然而，我國已進(jìn)入高質(zhì)量發(fā)展階段，應(yīng)牢固樹立綠水青山就是金山銀山的發(fā)展理念，走可持續(xù)發(fā)展之路，僅依靠化學(xué)氮肥提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)既不符合國家政策，也無益于經(jīng)濟(jì)和生態(tài)文明建設(shè)。1886年，德國植物化學(xué)家H.Hellriegel 和 H.Wilfarth 等［4］研究證明豆科植物能固定空氣中的氮。1888 年，荷蘭學(xué)者 M.W.Beijerinck［5］從豆科植物根瘤中分離出第一株固氮細(xì)菌純培養(yǎng)物，并將其命名為根瘤菌（Rhizobium）。從此，關(guān)于根瘤菌與豆科植物共生固氮的研究逐漸成為各國學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)［6］。共生固氮是指微生物與植物緊密生活在一起，由固氮微生物在與植物共生的狀態(tài)下直接將大氣中的分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化成化合態(tài)氮的過程［7］。廣義上，由共生固氮體系產(chǎn)生的對共生雙方的生長促進(jìn)作用以及對共生環(huán)境的改良作用即為共生固氮效應(yīng)，而在豆科植物-根瘤菌固氮體系中，共生效應(yīng)指共生系統(tǒng)的干物質(zhì)和蛋白質(zhì)生產(chǎn)效率［8］。豆科植物與根瘤菌共生固氮體系從空氣中固定的總氮量達(dá)到 200~400 kg/（hm2·a）［9］，極大程度上減少了化學(xué)肥料的使用，具有良好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。

目前，人工接種根瘤菌是提高豆科作物和牧草產(chǎn)量及其品質(zhì)的重要方法之一，主要是通過播種前拌種或制成包衣種子等方式將適宜的根瘤菌劑接種于豆科作物或飼料作物。1893年，Nobbe 和 Hiltner首次針對德國的豆科作物進(jìn)行商業(yè)根瘤菌劑的生產(chǎn)［10-11］，隨后美國、加拿大和澳大利亞等國也在種植豆科作物時(shí)接種商業(yè)根瘤菌劑［12］。我國從1980年開始進(jìn)行豆科牧草根瘤菌資源的采集、鑒定、保藏、評價(jià)及利用研究，研制出了多種商業(yè)根瘤菌劑產(chǎn)品［13］。由于根瘤菌株與宿主的匹配性、自然環(huán)境差異，土著根瘤菌競爭及多種生物與非生物脅迫等因素顯著影響了目標(biāo)根瘤菌在豆科植物根部接種的成功率［14］，導(dǎo)致人工接種根瘤菌劑的效果不佳。而且，與內(nèi)生根瘤菌相比，“優(yōu)良植物品種選育-匹配根瘤菌株篩選-根瘤菌劑研制-根瘤菌劑接種”的根瘤菌劑應(yīng)用程序，一定程度上增加了菌劑載體基質(zhì)及其他環(huán)境因子對植物與根瘤菌株專一性識別因子（如類黃酮、結(jié)瘤因子、表面多糖等）的影響［15］，可能淡化苜?；蛐团c根瘤菌生物型間的專一性識別及精準(zhǔn)性結(jié)合，削弱共生固氮體系中豆科植物與根瘤菌的微協(xié)調(diào)互作過程，限制根瘤菌固氮潛力的充分發(fā)揮。

2 共生育種

共生是指一個(gè)有機(jī)體與另一個(gè)不同的有機(jī)體緊密接觸，并通過長期協(xié)同進(jìn)化產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)和新陳代謝，最終形成的互利關(guān)系［16］。有的共生生物需要借助共生來維系生命，屬于專性共生（Obligate symbiosis）；有的共生只是提高了共生生物的生存幾率，并不會對宿主產(chǎn)生影響，屬于兼性共生（Facultative symbiosis）。共生關(guān)系有時(shí)是不對稱的，很可能出現(xiàn)一種生物是專性共生而另一種生物是兼性共生的現(xiàn)象。植物與微生物的共生體系主要包括藍(lán)藻共生體系（藍(lán)藻與真菌、苔蘚、蕨類、裸子和被子植物）［9］、豆科植物共生體系（根瘤菌與豆科植物）、非豆科植物共生體系（根瘤菌與榆科植物［9］、弗蘭克氏放線菌（Frankia）［17］與榿木屬、楊梅屬、美洲茶屬等植物［8］）及叢枝菌根真菌（Ar‐buscular mycorrhizal fungi，AMF）共生體系（與禾本科植物等）［18］。

育種是通過創(chuàng)造遺傳變異、改良遺傳特性，以培育優(yōu)良生物新品種的技術(shù)。育種以遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，需綜合應(yīng)用生態(tài)、生理、生化、病理和生物統(tǒng)計(jì)等多種學(xué)科知識。植物育種又稱為以高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效為目標(biāo)的品種創(chuàng)制［19］。目前的植物育種方法主要包括聚合育種、誘變育種、雜交育種、單倍體育種、多倍體育種、基因工程（轉(zhuǎn)基因）育種、細(xì)胞工程育種、植物激素育種、分子設(shè)計(jì)育種、組學(xué)輔助育種（Genomics-assisted breeding，GAB）［20-21］等。這些植物育種方法均是建立在植物種單獨(dú)改造的原理之上，以植物自身的遺傳基礎(chǔ)或基因?yàn)檠芯繉ο螅灾参镒儺惾后w（基因或基因組發(fā)生了變化的群體）為試驗(yàn)材料，人工選擇獲得農(nóng)藝性狀優(yōu)良穩(wěn)定的植物品種。然而，就牧草育種而言，以“牧草之王”紫花苜蓿（豆科）和“禾草之王”羊草（禾本科）為例，其多倍體遺傳、嚴(yán)重的近交衰退、異花授粉、自交不親和及品種內(nèi)個(gè)體間具有較大的遺傳變異和表型差異等特點(diǎn)，嚴(yán)重限制了其功能基因組研究和育種發(fā)展［22］。

共生育種（Symbiosis breeding）是指通過兩種密切接觸的不同生物之間形成的互利關(guān)系創(chuàng)造兩種生物互利的遺傳變異，改良互利的遺傳特性，以培育優(yōu)良共生生物新組合的技術(shù)。兩種不同生物的共生育種有別于單種生物育種，是生物育種的新技術(shù)，對生物育種理論與技術(shù)的拓展具有十分重要的意義。

3 苜蓿與根瘤菌共生育種的理論基礎(chǔ)

苜蓿與根瘤菌的共生育種是指以“苜蓿-內(nèi)生根瘤菌”和諧共生、互利共棲的生活方式為基礎(chǔ)，以選育的優(yōu)良苜?；蛐推贩N和高效精準(zhǔn)匹配的固氮根瘤菌生物型為材料，通過接種將目的根瘤菌生物型導(dǎo)入親屬關(guān)系密切的苜蓿基因型品種的植物組織，利用根瘤菌在苜蓿植株體內(nèi)的運(yùn)移和定殖特性建構(gòu)內(nèi)生根瘤菌種子，并使高效共生固氮特性通過種子在代際間穩(wěn)定傳遞的育種方法。

3.1 苜蓿與根瘤菌的共生方式

實(shí)現(xiàn)苜蓿與根瘤菌共生育種的關(guān)鍵在于明確二者互利共生的具體方式。依據(jù)根瘤菌發(fā)揮其共生作用的主要位置及其方式，可將苜蓿與根瘤菌的共生分為：（1）結(jié)瘤共生，即根瘤菌在植株根部結(jié)瘤并在根瘤內(nèi)進(jìn)行固氮共生［22］；（2）組織內(nèi)生共生，即根瘤菌以內(nèi)生菌的方式生活在未離體植物組織內(nèi)，增強(qiáng)植物抗逆性［23］，并隨著植株生長不斷運(yùn)移和定殖到根部進(jìn)行結(jié)瘤固氮［24-25］；（3）聯(lián)合共生，即根瘤菌主要存在于根際土壤［26］或叢枝菌根真菌-植物-根瘤菌的共生體界面［27］，二者相互作用共同發(fā)揮其固氮、促生、抗逆和土壤修復(fù)等功能的過程［28］；（4）種子內(nèi)生共生，即根瘤菌通過結(jié)瘤共生、內(nèi)生共生或聯(lián)合共生等途徑進(jìn)入并定殖在苜蓿種子內(nèi)，隨著種子發(fā)芽優(yōu)先進(jìn)入植物組織或土壤，再次以結(jié)瘤共生、內(nèi)生共生或聯(lián)合共生的方式發(fā)揮共生互惠作用［29］。因此，種子內(nèi)生共生是構(gòu)建苜蓿與根瘤菌共生體、創(chuàng)制高效固氮共生體新種質(zhì)的主要方式。

3.2 苜蓿內(nèi)生根瘤菌的結(jié)瘤固氮、抗逆及促生優(yōu)勢

與外源根瘤菌相比，內(nèi)生根瘤菌受外部自然環(huán)境及土著根瘤菌的影響較小，在結(jié)瘤競爭等方面有明顯優(yōu)勢［24］。從苜蓿植株體內(nèi)分離的根瘤菌株，回接后依然對植株結(jié)瘤能力、生物量和粗蛋白含量有顯著促進(jìn)作用［30-31］。同時(shí)，內(nèi)生根瘤菌對抗生素、鹽、pH和高低溫等脅迫條件均具有不同程度的抗性［32-34］，可有效提高苜蓿植物抗生物脅迫和非生物脅迫能力［33，35］。內(nèi)生根瘤菌能通過分泌生長素IAA和溶解有機(jī)磷、無機(jī)磷等促進(jìn)植株生長［30，36］。祁娟［33］研究發(fā)現(xiàn)，分離自不同紫花苜蓿品種的22株內(nèi)生根瘤菌中有14株能夠溶解有機(jī)磷，溶磷圈D/d 比值在1.117~2.567；有1株菌能溶解無機(jī)磷，D/d比值達(dá)到2.31；有73%的菌株具有分泌IAA的能力，其中分泌能力中強(qiáng)以上的菌株占90%［33］。

3.3 苜蓿內(nèi)生根瘤菌的垂直穩(wěn)定傳播特性

苜蓿種子中存在大量內(nèi)生根瘤菌，隨著種子的萌發(fā)和幼苗的生長，內(nèi)生根瘤菌會不斷的運(yùn)移并定殖在苜蓿植株的不同部位［37-38］；其中根毛是根瘤菌分布的主要部位，植株地上部分根瘤菌數(shù)量不足根內(nèi)的0.23%，且僅存在于莖、花芽、花（莢果）。到達(dá)花蕾以后，根瘤菌采用兩種可能的路徑經(jīng)由繁殖器官垂直傳播到下一代植株種子［23］：（1）在現(xiàn)蕾期和花期，存在于花粉表面和子房壁的根瘤菌進(jìn)入子房壁和珠被的細(xì)胞間隙，或通過由花粉萌發(fā)后穿過柱頭和花柱到達(dá)珠被的花粉管進(jìn)入胚珠；（2）在花期和結(jié)莢期，根瘤菌先富集于子房壁，再通過子房壁與胚珠珠被聯(lián)結(jié)的營養(yǎng)輸送通道進(jìn)入胚珠；前者使根瘤菌進(jìn)入胚珠并迅速增殖，后者使根瘤菌伴隨著營養(yǎng)物質(zhì)一同補(bǔ)充到種子中去［39］。

3.4 植物與微生物的共生育種

目前以植物和微生物共生體為直接對象的育種主要在內(nèi)生真菌與其共生的禾草植物之間［40-41］。禾草內(nèi)生真菌通過種子進(jìn)行垂直傳播，具有高效、穩(wěn)定和安全的種傳特性，遺傳性狀表達(dá)穩(wěn)定［42-43］。這種類似于“可遺傳性”的特征是植物內(nèi)生菌作為植物育種手段為人類所利用的必要保障［44］，被譽(yù)為“下一代的分子育種”［45］。利用內(nèi)生真菌對禾草抗性的提升進(jìn)行的植物、牧草和草坪草育種體系已初步建立，為苜蓿與根瘤菌的共生育種奠定了良好基礎(chǔ)。

因此，在內(nèi)生根瘤菌共生方式和功能如此多樣、遺傳性狀穩(wěn)定又較容易獲得的基礎(chǔ)上，利用共生育種的思想，可通過向苜蓿植株導(dǎo)入特異性功能根瘤菌，培育苜蓿植株與目的根瘤菌的共生種質(zhì)或品種。

4 苜蓿與根瘤菌共生育種的實(shí)施過程

4.1 苜蓿根瘤菌種質(zhì)資源篩選

優(yōu)良根瘤菌種質(zhì)資源（主要指高效結(jié)瘤固氮根瘤菌株、促進(jìn)生長根瘤菌株和抗逆性根瘤菌株）的篩選是苜蓿與根瘤菌共生育種的關(guān)鍵。苜蓿根瘤菌的結(jié)瘤能力受到苜蓿品種、季節(jié)和土壤類型的影響，與苜蓿品種專一性匹配的根瘤菌株在適宜的光、溫、水及土壤綜合條件下才能發(fā)揮較強(qiáng)的結(jié)瘤能力和較高的根瘤存活率［46］。促生根瘤菌株是指能夠通過固氮、溶磷和/或分泌生長素等促進(jìn)植物生長的根瘤菌。苜蓿根瘤菌具有較強(qiáng)的溶解有機(jī)磷和分泌生長素IAA（3‐吲哚乙酸）的能力，實(shí)驗(yàn)室通常采用蒙金娜有機(jī)磷和PKO無機(jī)磷固體培養(yǎng)基以及比色法對溶磷和IAA能力強(qiáng)的根瘤菌株進(jìn)行鑒定［47］?？鼓嫘愿鼍臧望}、耐酸堿、耐高低溫和耐旱等菌株，通過野外根瘤菌分離純化和室內(nèi)抗逆性能力測試，可篩選出高抗逆性根瘤菌株，為苜蓿新種質(zhì)創(chuàng)新和品種選育提供優(yōu)良根瘤菌資源。甘肅不同生態(tài)區(qū)域的苜蓿根瘤菌株抗逆性普遍較強(qiáng)，且具有菌株種質(zhì)和地域差異性［46］。

苜蓿根瘤菌存在著菌株、促生功能和環(huán)境分布的多樣性，三者之間的協(xié)同是苜蓿根瘤菌存在與發(fā)展的必然趨勢。通過擴(kuò)大品種和區(qū)域范圍的研究，可篩選出固氮、促生、抗逆單個(gè)功能強(qiáng)大或多個(gè)功能兼得、促生效應(yīng)更加突出的優(yōu)良菌株資源。因此，優(yōu)良根瘤菌種質(zhì)資源的篩選應(yīng)綜合考慮根瘤菌生態(tài)分布與固氮、促生、抗逆等方面，采用區(qū)域分類→田間調(diào)查→分離→初篩選→多功能復(fù)篩選的篩選程序。

4.2 苜蓿與根瘤菌共生性狀相向變異選擇強(qiáng)化

快速、準(zhǔn)確地選擇苜蓿與根瘤菌種群中具有共生性狀相向變異的組合，篩選具有強(qiáng)烈共生優(yōu)越性的苜蓿品種和根瘤菌株，再通過構(gòu)建內(nèi)生根瘤菌苜蓿種子強(qiáng)化共生性狀的相向變異，是培育苜蓿-根瘤菌共生新種質(zhì)的捷徑。共生性狀相向變異組合的篩選需進(jìn)行大量根瘤菌株接種苜蓿品種的試驗(yàn)，如將分離自5個(gè)紫花苜蓿（Medicago sativa）品種的32株中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）進(jìn)行回接，基于主成分分析從14個(gè)共生指標(biāo)中篩選出地上干重為共生效應(yīng)代表指標(biāo)，比較分析接種與未接種（CK）苜蓿品種的地上干重差異顯著性［8，48］。當(dāng)接種根瘤菌的苜蓿品種地上干重顯著高于未接種CK時(shí)，將共生效應(yīng)標(biāo)記為“正效應(yīng)”E（Effective），表明苜蓿品種與根瘤菌株的共生相向性變異強(qiáng)烈；顯著低于CK時(shí)（P<0.05）標(biāo)記為“負(fù)效應(yīng)”I（Inhibitive），表明苜蓿品種與根瘤菌株的共生相向性變異較弱；與CK差異不顯著時(shí)標(biāo)記為“無效應(yīng)”O(jiān)（Noneffective），表明苜蓿品種與根瘤菌株間不存在共生相向性變異［22］。研究發(fā)現(xiàn)1株根瘤菌最多可與2個(gè)苜蓿品種產(chǎn)生強(qiáng)烈的相向性變異，共生優(yōu)越性強(qiáng)（圖1）。利用苜蓿品種和根瘤菌株專一性相向共生組合構(gòu)建種子共生體，培育共生種質(zhì)，可進(jìn)一步強(qiáng)化優(yōu)良共生性狀的相向性變異，使其隨共生種子穩(wěn)定續(xù)傳。

圖1 Sinorhizobiun meliloti菌株在5個(gè)苜蓿品種上的共生效應(yīng)Fig.1 Symbiotic efficiency of E.meliloti strains on five alfalfa cultivars

4.3 苜蓿與根瘤菌共生體構(gòu)建和共生種子培育

苜蓿與根瘤菌共生體構(gòu)建是通過外部接種使根瘤菌侵入植株體內(nèi)，運(yùn)移并大量定殖于苜蓿種子，培育出內(nèi)生根瘤菌并能穩(wěn)定結(jié)瘤固氮發(fā)揮共生效應(yīng)的種子的過程。前期研究表明，在甘農(nóng)5號紫花苜?；ㄆ诤徒Y(jié)莢期利用花部噴射和根部澆灌方法接種熒光標(biāo)記根瘤菌gn5f和12531f，收獲的種子中均能檢測到gn5f和12531f［24-25，49］。在甘農(nóng)5號和WL343HQ 紫花苜蓿品種植株的不同生育時(shí)期，采用適宜的接種方法（如根部澆灌、主根微破損澆灌、花部噴射、莢果皮噴射、切根浸潤、切葉涂抹等）、添加適宜的外源物質(zhì)（如硼、赤霉素、苦參堿、磷酸氫二鉀、黃腐酸等）接種熒光標(biāo) 記 根 瘤 菌RhizobiumLH3436（f3436f）、gn5f和12531f，能在收獲初期及保存6個(gè)月后的種子中分別檢測到 3種熒光標(biāo)記根瘤菌［25，49-51］。

4.4 共生性狀代際間垂直續(xù)傳及三性檢測

苜蓿與根瘤菌共生種子的共生性狀在代際間的垂直續(xù)傳及其“三性檢驗(yàn)”，即特異性、一致性和穩(wěn)定性檢測，是驗(yàn)證共生種質(zhì)培育成功與否的關(guān)鍵。收獲含有熒光標(biāo)記根瘤菌gn5f和12531f的甘農(nóng)5號紫花苜蓿種子，采用（S1）25 ℃+自然濕度（45%RH）、（S2）25 ℃+硅膠干燥（20%RH）、（S3）4 ℃+冰箱冷藏濕度（55%RH）和（S4）-4 ℃+冰箱冷凍濕度（50%RH）條件貯藏3年后種植，次代苜蓿植株組織和種子中依舊可檢測到兩種熒光標(biāo)記根瘤菌［29］。在S1條件下貯藏的內(nèi)生gn5f的種子和S2條件下貯藏的內(nèi)生12531f的種子形成的次代植株，其苗期單株結(jié)瘤數(shù)、根瘤等級、固氮酶活性、單株葉片數(shù)、株高、根長、地上鮮重、地上干重、根鮮重、根干重較CK（不含根瘤菌的種子形成的次代植株）分別有不同程度的增長［29］，說明內(nèi)生根瘤菌種子在適宜的條件下貯藏時(shí)，其共生性狀能夠在代際間垂直續(xù)傳，且次代植株的共生性狀明顯優(yōu)于未內(nèi)生根瘤菌的種子，共生特異性明顯，穩(wěn)定性和一致性較強(qiáng)。然而，內(nèi)生根瘤菌苜蓿種子的共生性狀究竟能續(xù)傳多少代，特異性、穩(wěn)定性和一致性如何延續(xù)，需要進(jìn)行更長時(shí)間和空間的驗(yàn)證和跟蹤。

5 苜蓿與根瘤菌共生育種的一般程序

綜上，采用共生性狀相向性變異強(qiáng)烈的優(yōu)良苜蓿品種與根瘤菌株組合進(jìn)行共生育種，在適宜的外源擾動物質(zhì)、接種方法和貯藏條件的選擇下，構(gòu)建內(nèi)生高效結(jié)瘤固氮根瘤菌的種子，并通過檢驗(yàn)種子內(nèi)生根瘤菌在植物代際間的傳代和功能延續(xù)性，可獲得良好的苜蓿-根瘤菌共生新種質(zhì)。

基于多年的苜蓿與根瘤菌專一性相向共生理論研究與實(shí)踐，提出共生育種的一般步驟為：① 優(yōu)良根瘤菌種質(zhì)篩選或創(chuàng)制；②苜蓿品種與根瘤菌共生性狀相向性變異選擇；③ 目的生物型根瘤菌內(nèi)棲苜蓿繁殖體形成共生貯主——種子；④ 內(nèi)棲根瘤菌苜蓿種子穩(wěn)定保藏條件選擇；⑤ 種子內(nèi)棲根瘤菌代際續(xù)傳能力和共生效應(yīng)檢驗(yàn)；⑥內(nèi)棲根瘤菌苜蓿種子后代群體主要性狀特異性、穩(wěn)定性、一致性檢驗(yàn)。