丁酸鹽對糖尿病腎病小鼠腎損傷的保護作用及機制

葉凱麗，黃詩琴，胡婷，趙艷玲

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州 325027

糖尿病腎病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病最常見的死亡原因及常見的微血管并發(fā)癥，目前普遍認為慢性炎癥、氧化應(yīng)激、糖脂代謝紊亂是DN進展的最主要因素[1-2]。研究表明[3-4]DN小鼠與正常小鼠相比腸道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異，并出現(xiàn)不同程度的能量代謝異常，YANG等[5]認為腸道微生物代謝物可作為一種特殊的信號分子通過腸道屏 障-腸黏膜進入血液循環(huán)而影響機體重要器官的功能，包括心、腦、腎等器官，其中短鏈脂肪酸尤為重要。丁酸鹽是一種重要短鏈脂肪酸，它可通過腸道屏障進入血液循環(huán)影響腸外器官的功能，如調(diào)控胰島素敏感性、抗炎、抗氧化等[6-7]。目前，越來越多的研究表明腸道菌群可以通過其代謝產(chǎn)物影響腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究以db/db小鼠為研究對象，從GLP-1R/AMPK途徑來探討腸道菌群代謝物丁酸鹽對2型DN小鼠腎臟的保護作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 主要儀器及試劑 羅氏血糖儀購自德國Roche Diagnostics GmbH公司，丁酸鈉購自上海Macklin公司（CAS號：156-54-7），蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、過碘酸-希夫（PAS）染色試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司，尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）、血肌酐（serum creatinine, SCr）、甘油三酯（triglyceride, TG）、血清總膽固醇（total cholesterol, TC）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，白細胞介素-6（interleukin-6, IL-6）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；尿微量白蛋白、尿肌酐酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購自上海撫生實業(yè)有限公司。Phospho-AMPKα（Thr172）Rabbit mAb（#2535）、AMPKα Rabbit mAb（#5831）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；胰高血糖素樣肽（glucagon-like peptide-1, GLP-1）受體（GLP-1R）抗體（ab218532）購自英國Abcam公司。

1.2 實驗動物 24只13周齡SPF級雄性db/db小鼠，體質(zhì)量（45±7）g，10只同周齡雄性db/m小鼠，體質(zhì)量（27±2）g，均購自常州卡文斯實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（蘇）2016-0010，動物質(zhì)量合格證號：202118368。所有實驗小鼠飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗動物房，溫度（22 ℃±2 ℃），相對濕度（55%±10%），光照/黑暗周期為12 h，小鼠可自由飲水和進食，普通飼料喂養(yǎng)，定期更換墊料。該研究通過溫州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會的批準（wydw2021-0336）。

1.3 實驗分組 實驗前所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，尾靜脈采血測定空腹血糖（fasting blood glucose, FBG）（禁食6 h），連續(xù)3 d測得小鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L即認為模型復(fù)制成功。將db/db小鼠隨機分為3組：糖尿病腎病組（DN組）、丁酸鈉500 mg·kg-1·d-1組（NaB1組）和丁酸鈉 1 000 mg·kg-1·d-1組（NaB2組），選取同周齡的10只雄性db/m小鼠為空白對照組（NC組）。根據(jù)之前研究，丁酸鈉的灌胃劑量和給藥時間在此基礎(chǔ)上確 定[6-8]。DN組和NC組各10只，NaB1和NaB2組各7只。

1.4 藥物制備及給藥 按500 mg·kg-1及1 000 mg·kg-1劑量精密稱取丁酸鈉粉末溶于適量無菌0.9%氯化鈉溶液中，在振蕩器中震蕩至完全溶解，用0.22 μm微孔濾膜抽濾，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存。NaB1組和NaB2組小鼠每日予0.3 mL丁酸鈉溶液灌胃，DN組和NC組小鼠予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天1次，灌胃持續(xù)8周后處死小鼠。

1.5 實驗取材及測定 實驗結(jié)束前24 h，小鼠禁食不禁水，收集24 h尿液后處死，留取小鼠尿液標本低溫高速離心后取上清液于-80 ℃保存。摘除小鼠眼球取血，室溫靜置2 h后離心取上清液，用于生化分析；小鼠心臟灌流后取腎組織，部分進行石蠟包埋用于HE、PAS染色，部分組織-80 ℃冷凍保存用于Western blot檢測和RT-qPCR實驗。

1.6 小鼠一般情況、體質(zhì)量及腎臟質(zhì)量 實驗過程中觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、飲食飲水量、尿量、行為學(xué)變化等情況，每兩周監(jiān)測小鼠體質(zhì)量變化并計算平均值，繪制各組小鼠體質(zhì)量變化的趨勢圖；去除小鼠腎臟包膜后稱量小鼠腎臟質(zhì)量，并計算腎肥大指數(shù)（腎肥大指數(shù)=腎質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。

1.7 小鼠血糖及尿白蛋白肌酐比值（urine albumin creatine ratio, UACR）測定 羅氏血糖儀檢測各組小鼠給藥前（0w）及灌胃8周后尾靜脈空腹血糖濃度，并繪制血糖柱形圖；收集小鼠24 h尿液，4 ℃離心取上清液。按照制造商的說明，分別用尿微量白蛋白試劑盒、尿肌酐試劑盒檢測小鼠尿白蛋白、尿肌酐水平，并計算尿白蛋白和肌酐的比值，即UACR=尿白蛋白/尿肌酐。

1.8 小鼠血液生化分析及腎組織IL-6濃度測定 眼 球取血后分離血清，使用相應(yīng)試劑盒檢測血清樣本中的BUN、SCr、TG、TC、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST）水平。分別取30 mg腎組織加入到200 μL PBS溶液里面，充分勻漿后離心收集上清液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定上清液總蛋白水平；同時按照ELISA試劑盒的說明測定腎組織中的IL-6水平，繪制標準曲線并求得上清液IL-6水平，組織上清液IL-6水平=IL-6數(shù)值/相應(yīng)蛋白濃度。

1.9 Western blot檢測 取適量腎組織在含有磷酸酶及蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液中剪碎后勻漿，離心提取蛋白上清液，置于-80 ℃冷凍保存。按BCA蛋白定量試劑盒說明方法操作并繪制標準蛋白曲線，依據(jù)樣本OD值計算出樣本蛋白濃度并配制蛋白體系。SDS-PAGE電泳分離樣品[每個樣品取等量蛋白上樣（40 μg）]，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5% BSA溶液封閉2 h后TBST洗滌，將PVDF膜與不同的一抗在4 ℃條件下孵育過夜。TBST洗膜后與特異性HRP偶聯(lián)的二抗室溫孵育2 h，洗去二抗，隨后用Omni-ECLTM超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒顯影條帶，然后通過Image-Lab軟件測量條帶強度并進行光密度分析。以β-actin為內(nèi)參計算蛋白的相對表達量。

1.10 RT-qPCR檢測 取適量腎組織按照TRIzol法提取腎臟組織總RNA，按照Prime ScriptTMRT Master mix試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，并配制RT-qPCR反應(yīng)體系。其循環(huán)反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s， 95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s，反應(yīng)40個循環(huán)。以GADPH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT方法定量分析小鼠腎組織中PGC-1α、MFN1及OPA1 mRNA的表達。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列

1.11 腎臟組織病理學(xué)評價 將石蠟包埋后的腎臟組織4 μm切片后置于60 ℃的烘箱2 h，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后用蘇木素、伊紅染液行常規(guī)HE染色，高倍鏡（×400）下觀察腎臟病理形態(tài)變化；脫蠟水化后腎臟切片依次使用氧化劑、Schiff染色液、蘇木素染色液和分化液處理行PAS染色，每張切片高倍鏡（×400）下隨機選擇5～10個視野，應(yīng)用image-pro plus 6.0軟件測定并計算，腎小球系膜基質(zhì)相對面積=腎小球內(nèi)PAS陽性染色面積/腎小球毛細血管袢總面積×100%。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件及Graphpad prism 9.0進行數(shù)據(jù)處理和繪制圖片。計量資料用±s進行描述。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗和Dunnett’s T3法檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丁酸鈉對小鼠一般情況、體質(zhì)量和腎質(zhì)量的影響 NC組小鼠一般狀況良好，毛色正常、反應(yīng)靈敏；DN組均表現(xiàn)為典型的DN癥狀，包括多飲、多食、多尿，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍或行動緩慢；經(jīng)丁酸鈉治療8周后小鼠多飲多食多尿癥狀改善，活動較前增多。灌胃期間每2周監(jiān)測一次小鼠體質(zhì)量，DN組、NaB1組和NaB2組小鼠體質(zhì)量均顯著高于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與DN組比，NaB1組及NaB2組小鼠體質(zhì)量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。與NC組比，DN組、NaB1組和NaB2組小鼠腎臟質(zhì)量增加，腎肥大指數(shù)減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與DN組比，NaB1組和NaB2組腎質(zhì)量及腎肥大指數(shù)減小；且這種差異在NaB2組更加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

圖1 丁酸鈉降低db/db小鼠體質(zhì)量

表2 丁酸鈉對DN小鼠腎質(zhì)量的影響（±s）

表2 丁酸鈉對DN小鼠腎質(zhì)量的影響（±s）

與NC組比：aP＜0.05；與DN組比：bP＜0.05

組別 n 腎質(zhì)量（g） 腎肥大指數(shù)（%）NC組 10 0.20±0.02 7.64±0.84 DN組 10 0.28±0.04a 6.05±1.39a NaB1組 7 0.23±0.05ab 5.25±1.36ab NaB2組 7 0.21±0.02ab 4.83±0.61ab

2.2 丁酸鈉對小鼠UACR、血糖及腎組織IL-6水平的影響 與DN組比，NaB1組及NaB2組小鼠UACR值下降顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但兩治療組之間的UACR值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。DN組血糖明顯高于NC組，經(jīng)丁酸鈉8周灌胃治療后，NaB1組及NaB2組小鼠血糖濃度下降顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且與NaB1組比，NaB2組血糖下降更加明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。連續(xù)給予8周丁酸鈉溶液灌胃治療，檢測小鼠腎組織IL-6的變化，DN組小鼠腎臟IL-6水平較NC組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)丁酸鈉8周治療后，NaB1組及NaB2組的腎臟IL-6水平較DN組下降，且與NaB1組比，NaB2組IL-6水平下降顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組UACR、血糖濃度及腎臟IL-6水平

2.3 丁酸鈉對小鼠血液BUN、SCr、TC、TG等指標的影響 與DN組比，NaB1組及NaB2組的ALT、AST水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示這兩種劑量下的丁酸鈉對兩治療組小鼠的肝功能無明顯損傷作用。NC組小鼠血BUN、SCr與DN組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)過8周治療后兩治療組均出現(xiàn)不同程度的下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。DN組小鼠TC和TG值高于NC組（P＜0.05），經(jīng)8周丁酸鈉治療后，兩治療組小鼠血TC、TG值下降但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 丁酸鈉對各組小鼠血液生化指標的影響（±s）

表3 丁酸鈉對各組小鼠血液生化指標的影響（±s）

與NC組比：aP＜0.05；與DN組比：bP＜0.05

項目 NC組（n=10） DN組（n=10） NaB1組（n=7） NaB2組（n=7）TC（mmol/L） 1.92± 0.53 3.46± 1.32a 3.06± 0.44a 2.87± 1.20 TG（mol/L） 0.65± 0.27 1.77± 0.66a 1.63± 0.51a 1.41± 0.43a BUN（mmol/L） 7.06± 1.33 11.51± 2.77a 7.91± 1.10b 6.91± 1.00b SCr（umol/L） 29.04± 6.91 129.63±18.67a 103.36±11.61ab 106.44± 6.18ab ALT（U/L） 27.81± 6.56 63.87±23.06a 45.39±13.52a 46.96±17.26a AST（U/L） 49.12±14.55 94.50±31.18a 74.02±18.57 79.84±20.83

2.4 丁酸鈉對DN小鼠腎臟病理的影響 與NC組比較，肉眼見DN組小鼠腎組織體積明顯增大。對各組小鼠腎組織進行HE及PAS染色，DN組小鼠出現(xiàn)典型的DN病理改變，表現(xiàn)為腎小球腫脹肥大，腎小管上皮排列紊亂且伴有管腔擴張，基底膜增厚，系膜基質(zhì)相對面積增加，NaB1和NaB2組小鼠的腎小球面積減小，腎小管擴張程度減輕，系膜基質(zhì)糖原沉積面積減小，且在NaB2治療組減少更加顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠腎組織病理改變

2.5 丁酸鈉對腎臟GLP-1R、p-AMPK/AMPK蛋白的表達的影響 DN組小鼠中的p-AMPK/AMPK比值明顯低于NC組、NaB1組及NaB2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；且與NaB1組比，NaB2組P-AMPK/AMPK蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。GLP-1R 蛋白在NC組、NaB1組及NaB2組中均有豐富的表達，在DN組小鼠中可見蛋白表達減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且與NaB1組比，GLP-1R蛋白在NaB2組顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組p-AMPK/AMPK及GLP-1R蛋白表達水平

2.6 丁酸鈉對腎組織PGC-1α、MFN2及OPA1 mRNA表達的影響 與NC組比，DN組腎小球PGC-1α、MFN2及OPA1 mRNA明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療8周后，NaB1組及NaB2組的PGC-1α、MFN2及OPA1 mRNA水平明顯上升；且NaB2組PGC-1α、MFN2及OPA1 mRNA水平升高更加顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組小鼠PGC-1α、MFN2及OPA1 mRNA表達水平

3 討論

DN是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生發(fā)展可能與GLP-1作用受抑制有關(guān)。DN發(fā)生時腸道內(nèi)分泌L細胞釋放的GLP-1減少[9]，同時機體內(nèi)NF-κB及其介導(dǎo)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)激活，導(dǎo)致各種炎癥因子在體內(nèi)蓄積，尤其是IL-6[10]。有研究證實小鼠發(fā)生DN時，腎小球內(nèi)皮細胞上的GLP-1R通過泛素化或血管緊張素II介導(dǎo)的降解機制被激活，導(dǎo)致GLP-1R降解增多，GLP-1不能與GLP-1R結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能[11]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在DN小鼠中，血糖血脂和炎癥因子IL-6水平顯著升高，腎功能受損，腎臟GLP-1R蛋白表達顯著降低。

相關(guān)研究報道丁酸鹽不僅能上調(diào)腸道細胞緊密連接蛋白1（recombinant tight junction protein 1, TJP1）的表達，改善腸道黏膜屏障功能，還能進一步降低慢性腎臟病患者血液中IL-1、TNF-α的水平，減輕腎臟的氧化應(yīng)激和纖維化損傷，降低尿白蛋白排泄，改善腎功能[8，12-13]，同時還抑制了組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase inhibitor,HDAC）活性。除此之外，丁酸與細胞表面G蛋白偶聯(lián)蛋白41（GPR41）和GPR43結(jié)合促進遠端回腸及結(jié)腸L細胞分泌釋放GLP-1，從而提高機體對GLP-1R敏感性，發(fā)揮降血糖、抗炎及抗氧化作用。本研究中，經(jīng)丁酸鹽治療后小鼠的一般情況改善，血糖、體質(zhì)量及UACR顯著下降，SCr、BUN和腎組織IL-6水平降低，但小鼠肝功能無明顯損傷，表明丁酸鹽能減輕DN小鼠體質(zhì)量，降低血糖濃度，抑制DN小鼠發(fā)生發(fā)展過程中伴隨的炎癥反應(yīng)，減輕腎組織損傷。還發(fā)現(xiàn)與500 mg·kg-1·d-1丁酸鈉治療量相比， 1 000 mg·kg-1·d-1丁酸鈉治療量在降低DN小鼠血糖濃度及腎組織IL-6水平方面療效更加顯著，或許為尋找適宜丁酸鈉治療濃度提供了證據(jù)。

AMPK是細胞重要的能量感受器，能調(diào)節(jié)細胞能量代謝[14]。既往的大量研究證實DN小鼠存在能量代謝失衡，腎臟中AMPK磷酸化水平在不同程度上被抑制，應(yīng)用5-氨基咪唑-354-甲酰胺-1-β-d-呋喃核糖核苷（AICAR）或白藜蘆醇等AMPK激動劑可以減輕DN小鼠尿蛋白和腎臟纖維化，減少腎細胞凋亡并改善腎臟肥大[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)DN組小鼠p-AMPK/AMPK蛋白表達顯著降低，補充丁酸鹽治療后小鼠p-AMPK/AMPK蛋白表達增加，因此推測丁酸鹽與AMPK激動劑有類似的效果，能促進AMPK磷酸化從而影響腎臟功能，但具體的通路和機制還有待進一步研究。

線粒體是生物發(fā)生合成、脂肪酸氧化和能量代謝的重要場所，KANG等[17]證實DN時脂肪酸氧化過程被抑制，腎小球PGC-1α mRNA表達明顯減少，而PPAR與PGC-1α是影響脂肪酸吸收氧化相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵[18]。OPA1蛋白及用于編碼線粒體的融合基因MFNl、MFN2作為PGC-1α的重要下游因子對線粒體功能維持至關(guān)重要，研究表明PGC-1α表達下降可導(dǎo)致線粒體功能障礙和結(jié)構(gòu)異常，同時生成過量的活性氧作用于生物膜及大分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷，從而促進DN的進展。丁酸鹽可在一定條件下活化AMPK，AMPK具有促進下游因子PGC-1α合成的功能，從而調(diào)控PGC-1α及其下游信號因子進而影響線粒體的功能，且這種效應(yīng)可以被AMPK抑制劑Compound C抑制[19]。為了研究丁酸鹽對線粒體功能的影響，進一步分析了線粒體內(nèi)融合基因表達，本研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α mRNA和線粒體融合基因MFN2和OPA1 mRNA表達在DN小鼠中受到抑制，而在丁酸鹽治療組中小鼠PGC-1α、MFN2和OPA1 mRNA表達抑制得到一定程度的緩解。推測丁酸鹽可能是通過AMPK/PGC-1α信號通路恢復(fù)損傷線粒體的功能，增加線粒體代謝產(chǎn)物，干預(yù)機體代謝，減少腎臟脂肪酸堆積，減輕腎組織損傷。

DN小鼠中普遍存在腸道菌群失衡，主要表現(xiàn)為產(chǎn)丁酸的細菌的減少，機體內(nèi)丁酸含量下降，本研究證實補充外源性的丁酸鹽能抑制DN小鼠炎癥反應(yīng)，促進GLP-1R蛋白合成，激活A(yù)MPK信號通路改善線粒體結(jié)構(gòu)及能量代謝障礙，表明丁酸鈉可作為連接“腸-腎”軸的重要介質(zhì)參與DN發(fā)生發(fā)展，同時還探究了丁酸鈉對腎臟起保護作用的適宜濃度，為治療DN提供新證據(jù)及思路。