靶向肝X受體對(duì)PD-1單抗治療原發(fā)性肝癌的增敏作用

周宇，張偉偉，高悠婷

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 感染科，浙江 溫州 325200

原發(fā)性肝癌是世界上最常見、惡性度最高的腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率分別位于各類腫瘤第六位以及第四位[1]。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是肝癌最主要的組織類型，占70%～85%[2]。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是制約HCC治療效果、影響患者預(yù)后的重要因素[3]。近年來，臨床數(shù)據(jù)顯示以程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1, PD-1）/程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1, PD-L1）單抗為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）已在包括HCC在內(nèi)的多種惡性腫瘤中取得了良好的治療效果[4]。然而，目前PD-1單藥治療的反應(yīng)率（客觀緩解率）為15%～20%[5]，亟需在探索PD-1單抗治療的耐藥性的基礎(chǔ)上，尋找新的聯(lián)合手段，以進(jìn)一步提高ICIs治療原發(fā)性肝癌的療效。

肝臟X受體（hepatic X receptor, LXR）是核受體家族的重要成員之一，主要參與調(diào)控膽固醇、脂肪酸和糖代謝等生理過程，存在α和β兩種亞型[6]。研究表明，激活LXR能顯著抑制肝癌、乳腺癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等多種惡性腫瘤生長(zhǎng)[7-13]。 邵衛(wèi)清等[14]在肝癌中還發(fā)現(xiàn)LXR特異性激動(dòng)劑T0901317（以下簡(jiǎn)稱T09）能通過調(diào)控膽固醇代謝，提高肝癌細(xì)胞對(duì)多種靶向藥物包括索拉非尼、瑞格非尼的敏感性。然而，到目前為止，關(guān)于LXR受體及其激動(dòng)劑在調(diào)控肝癌免疫逃逸及ICIs療效方面的作用尚不明確。本研究通過臨床樣本、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和在體動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，全面探討LXR與肝癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)的相關(guān)性，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討LXR激動(dòng)劑T09對(duì)PD-1單抗協(xié)同治療的增效作用，旨在為肝癌免疫治療提供新的增敏靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系MHCC-97H由復(fù)旦大學(xué)腫瘤轉(zhuǎn)移研究所饋贈(zèng)。小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。所有細(xì)胞系均在37 ℃、5% CO2環(huán)境 下，在添加10% FBS的高糖DMEM中培養(yǎng)。16只雄性、4周齡C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002]，體質(zhì)量約20 g。

LXR激動(dòng)劑T0901317購自美國(guó)Selleck公司，DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司，PD-1單抗購自吉滿生物科技公司。LXR、PD-L1免疫組化單克隆抗體分別購自美國(guó)Abcam和Proteintech公司。相關(guān)基因引物由上海杰李生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。

20例HCC患者的腫瘤石蠟標(biāo)本（包含腫瘤組織和癌旁正常肝組織）收集自瑞安市人民醫(yī)院，均接受手術(shù)切除，由病理證實(shí)為HCC，且均未接受任何術(shù)前治療。本研究通過瑞安市人民醫(yī)院倫理學(xué)審查（批件號(hào)：M20190003）。

1.2 方法

1.2 .1 相關(guān)性分析：利用網(wǎng)頁工具GEPIA分析TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌組織LXR、ABCA1表達(dá)水平和PD-L1表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.2 .2 免疫組織化學(xué)染色：取石蠟切片，采用 Novolink聚合物檢測(cè)系統(tǒng)（德國(guó)萊卡公司）的兩步方案進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。樣本常規(guī)脫蠟水化后，采用高壓修復(fù)方式修復(fù)抗原，用過氧化物酶阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。非免疫性動(dòng)物血清封閉后，切片在4 ℃下與一抗（兔抗人PD-L1，濃度1:400；鼠抗人LXR，濃度1:200）孵育過夜，在37 ℃下與二抗孵育30 min。DAB染色，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯固定，放置在蓋玻片下。將染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比納入半定量評(píng)分，LXR評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，陽性細(xì)胞數(shù)＜5%；1分，陽性細(xì)胞數(shù)5%～25%；2分，陽性細(xì)胞數(shù)26%～50%；3分，陽性細(xì)胞數(shù)50%以上；0～1分定義為陰性，2～3分定義為陽性。PD-L1評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，陽性細(xì)胞數(shù)＜1%；1分，陽性細(xì)胞數(shù)2%～5%；2分，陽性細(xì)胞數(shù)5%～10%；3分，陽性細(xì)胞數(shù)大于10%；0～1分定義為陰性，2～3定義為陽性。

1.2 .3 細(xì)胞培養(yǎng)：將MHCC-97H、Hepa1-6細(xì)胞置于含10%胎牛血清、105 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)，采用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化并傳代。

1.2.4 慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾：所有shRNA構(gòu)建均來自Sigma-Aldrich。將C末端標(biāo)記的AMFR克隆到pCDH中，獲得AMFR過表達(dá)質(zhì)粒。所有質(zhì)粒均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，密度60%～80%的HEK-293T細(xì)胞包裝病毒，48 h后收取HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min離心10 min，使用0.45 μm濾膜過濾后，即為含病毒上清液，-80 ℃保存。將 Hepa1-6細(xì)胞提前1 d接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。第2天，細(xì)胞密度為20%～30%，棄去培養(yǎng)基后加入1 mL制備好的病毒上清液和2 mL新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)加入3 μL（1 000×）Polybrene，感染18～24 h后換成新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基。48 h和72 h分別使用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光狀態(tài)，當(dāng)＞80%細(xì)胞發(fā)出熒光時(shí)，加入puromycin（終濃度2 μg/mL）篩選。

1.2 .5 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測(cè)：在細(xì)胞裂解緩沖液中收集細(xì)胞，煮沸15 min。使用BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量。所有蛋白質(zhì)在8%～12% SDS-PAGE上分離。以β-肌動(dòng)蛋白（Actin）作為內(nèi)對(duì)照。

1.2 .6 小鼠皮下瘤移植干預(yù)實(shí)驗(yàn)：取C57BL/6小鼠，在潔凈條件下的層流柜中飼養(yǎng)。將Hepa1-6細(xì)胞（1×107）接種于小鼠右側(cè)皮下。當(dāng)形成可觸及的腫瘤時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為4組（每組4只），分別為對(duì)照組（PBS每隔1 d灌胃）、T09組（30 μg/g，每隔1 d 灌胃）[14]、PD-1單抗組（每3 d腹腔注射100 μg）、PD-1單抗+T09組（劑量同單藥組），3周后處死小鼠測(cè)量皮下腫瘤體積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料使用±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料使用例數(shù)表示，采用Fisher檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌組織PD-L1和LXR、ABCA1表達(dá)水平的相關(guān)性 利用網(wǎng)頁工具GEPIA分析TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌組織LXR及其下游靶基因ABCA1表達(dá)水平和PD-L1表達(dá)水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，在肝癌組織中，ABCA1表達(dá)水平與PD-L1表達(dá)水平呈正相關(guān) （r=0.12，P=0.021），LXR表達(dá)水平與PD-L1表達(dá)水平也呈正相關(guān)（r=0.20，P＜0.001），見圖1。

圖1 生物信息數(shù)據(jù)庫分析LXR及其下游基因ABCA1表達(dá)和PD-L1表達(dá)的相關(guān)性

2.2 肝癌組織中PD-L1和LXR表達(dá)情況及兩者的相關(guān)性 免疫組化結(jié)果顯示，LXR作為細(xì)胞核受體，特征性表達(dá)于細(xì)胞核中，而PD-1主要表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜。高表達(dá)LXR的患者往往合并PD-L1高表達(dá)，20例肝癌腫瘤組織中，兩者均為陽性表達(dá)的有7例，均為陰性表達(dá)的共8例，免疫組化統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，兩者表達(dá)具有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖2、表1）。

表1 肝癌組織中LXR和PD-L1表達(dá)的相關(guān)性分析

圖2 代表性病例4和19免疫組化染色結(jié)果

2.3 細(xì)胞體外敲除LXR對(duì)PD-L1表達(dá)的影響 在體外運(yùn)用人肝癌細(xì)胞系MHCC-97H，通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，穩(wěn)定降低細(xì)胞中LXR的表達(dá)，分析敲除后細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)變化，Western blot結(jié)果顯示，和對(duì)照細(xì)胞系相比，兩條干擾（序列LXR-sh1和LXR-sh2）均能顯著降低肝癌細(xì)胞內(nèi)LXR的表達(dá)水平，PD-L1的表達(dá)水平亦顯著下調(diào)，見圖3。

圖3 LXR敲除對(duì)PD-L1表達(dá)的影響

2.4 聯(lián)合LXR激動(dòng)劑T09和PD-1單抗對(duì)Hepa1-6小鼠模型皮下腫瘤生長(zhǎng)的影響 對(duì)照組腫瘤體積為（2 540.0±348.7）mm3，PD-1單抗+T09組小鼠皮下瘤體積為（217.2±66.3）mm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.543，P＜0.001）。PD-1單抗組腫瘤體積為（1 430.0±134.1）mm3，與PD-1單抗+T09組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.106，P＜0.01），見圖4，說明LXR激動(dòng)劑T09可增強(qiáng)體內(nèi)PD-1單抗的抗腫瘤作用。

圖4 免疫健全小鼠體內(nèi)試驗(yàn)評(píng)價(jià)LXR激動(dòng)劑T09聯(lián)合PD-1單抗治療肝癌的效果

3 討論

LXR于1994年作為核受體家族的重要成員被發(fā)現(xiàn)[13]，曾一度被認(rèn)為是孤核受體。隨著JANOWSHI等[15]報(bào)道羥固醇可內(nèi)源性激活LXR以來，其生理功能才被逐步認(rèn)識(shí)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，LXR主要參與調(diào)控膽固醇、脂肪酸等多種生理代謝過程[6，16]。近年來發(fā)現(xiàn)，LXR與多種惡性腫瘤有關(guān)，被認(rèn)為是藥物治療靶點(diǎn)之一[17-19]。

膽固醇作為真核細(xì)胞至關(guān)重要的脂質(zhì)分子，既可作為前體合成類固醇激素、膽汁酸等，又可作為細(xì)胞膜的組成部分調(diào)控多種跨膜信號(hào)通路[20-22]。研究表明，腫瘤細(xì)胞膽固醇累積可通過激活多種促癌信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[23-27]。SHAO等[25]在肝癌研究中發(fā)現(xiàn)，激活LXR可調(diào)控膽固醇代謝水平，進(jìn)而抑制表皮生長(zhǎng)因子受體及其下游信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

PD-L1是腫瘤細(xì)胞膜表面除RTKs外的又一重要的細(xì)胞膜蛋白，其作為主要的ICIs，可介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸[28]。最近的一項(xiàng)研究表明，膽固醇積累通過上調(diào)包括PD1在內(nèi)的各種免疫檢查點(diǎn)蛋白表達(dá)，導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭[29]。然而膽固醇代謝如何維持PD-1/PD-L1信號(hào)途徑，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，作為膽固醇代謝途徑的調(diào)控核受體，LXR和肝癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)高度正相關(guān)，抑制LXR表達(dá)可顯著下調(diào)細(xì)胞內(nèi)PD-L1表達(dá)水平，提示LXR可能通過調(diào)控PD-L1水平介導(dǎo)肝癌免疫逃逸。

PD-1單抗進(jìn)入臨床應(yīng)用以來，已經(jīng)在肝癌中展現(xiàn)了初步的治療效果。臨床研究表明，單獨(dú)或聯(lián)合使用PD-1單抗可作為晚期肝癌的一線治療藥物[29]。 然而，數(shù)據(jù)表明，在肝癌中單藥使用PD-1的效果仍不理想，客觀緩解率僅15%左右[5]。因此，尋找PD-1單抗有效的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和潛在增敏藥物意義重大。本研究發(fā)現(xiàn)，LXR的激動(dòng)劑T09可在小鼠體內(nèi)大大改善PD-1抗肝癌治療的療效。

綜上，本研究在肝癌臨床樣本中發(fā)現(xiàn)LXR和PD-L1表達(dá)相關(guān)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)明確了LXR激動(dòng)劑聯(lián)合PD-1單抗治療能顯著增加PD-1治療肝癌的療效，為肝癌免疫治療提供了新的代謝增敏靶點(diǎn)。