miRNA-1在大鼠心搏驟停心肺復(fù)蘇后心肌焦亡及損傷中的作用

殷佳娜，李炳燦，周培森，雷遠(yuǎn)麗，王東升，許華清，宋文興，何愛(ài)文，李章平

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325027；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬衢州醫(yī)院 衢州市人民醫(yī)院 急診科，浙江 衢州 324000

心搏驟停（cardiac arrest, CA）是臨床危急重癥，心肺復(fù)蘇（cardiopulmonary resuscitation,CPR）是對(duì)CA后患者所實(shí)施的一種緊急搶救措施。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)院外心臟驟停（out-of-hospital cardiac arrest, OHCA）后的存活出院率低于1%[1]。CA/CPR是全身缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury, IRI）的過(guò)程，CA/CPR后出現(xiàn)的不同程度的心腦功能障礙是自主循環(huán)恢復(fù)（return of spontaneous circulation, ROSC）后患者死亡的主要原因，其病理生理機(jī)制復(fù)雜。深入闡明其機(jī)制，在ROSC后患者的治療中，對(duì)于提高患者預(yù)后具有極為重要的價(jià)值[2]。

細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是一種特殊的程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death, PCD），它在本質(zhì)上是細(xì)胞發(fā)生的炎癥性壞死，主要形態(tài)學(xué)特征是細(xì)胞水腫、崩解、胞膜小孔形成，并伴隨釋放大量的炎癥因子[3]。LIU等[4]和LOU等[5]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡在心肌IRI后發(fā)揮著重要作用。但CA/CPR患者ROSC后的心肌細(xì)胞焦亡情況尚不清楚。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一種長(zhǎng)度為18～22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA分子，可調(diào)控30%以上人類(lèi)基因表達(dá)[6]。其中，miR-1是肌肉組織特異性表達(dá)miRNA，占所有成年人心臟miRNA的40%[7]，是參與心肌損傷過(guò)程的一種重要miRNA[8]。但在CA/CPR后心肌功能障礙形成中，miR-1的變化和作用尚未明確，其和細(xì)胞焦亡的關(guān)系也有待研究。本研究通過(guò)建立大鼠窒息型CA/CPR模型，觀察ROSC后心肌細(xì)胞焦亡和損傷變化，并探討miR-1在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 RNA提取試劑TRIzol（美國(guó)Invitrogen公司），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司），SYBR Green試劑盒（上海Toroivd公司）。miR-1抑制劑（antago miR-1）、miR-1模擬物（ago miR-1）、miR抑制劑陰性對(duì)照物（antago miR NC）、miR模擬物陰性對(duì)照物（ago miR NC）均訂購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司，TUNEL染色試劑盒（英國(guó)Roche公司），核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3NOD（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3）抗體、 天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白1（Caspase-1）抗體、白介素-1β（interleukine-1 beta, IL-1β）抗體、白介素-18（interleukine-18, IL-18）抗體（美國(guó)Proteintech公司），大鼠肌肉B型肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme muscle B, CK-MB）、 心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I, cTnI）ELISA試劑盒（上海博蘊(yùn)生物公司）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、Gel DocTM XR+自動(dòng)曝光機(jī)（美國(guó)伯樂(lè)公司），小型動(dòng)物呼吸機(jī)RWD407（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.2 大鼠窒息型CA/CPR模型建立 SPF級(jí)成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2021-0017，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)遵守溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心管理和使用規(guī)定，并遵守中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。實(shí)驗(yàn)前自由飲水，禁食12 h。參照TIAN等[9]、QIN等[10]的方法建立CA/CPR模型。腹腔注射2%戊巴比妥鈉 3 mL/kg麻醉下，保定，頸部正中切口，分離右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈置管，接壓力換能器行血壓監(jiān)測(cè)，記錄基礎(chǔ)平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure, MAP）。分離氣管，切開(kāi)后插管；暴露頸靜脈建立靜脈通路。待大鼠血壓和心率穩(wěn)定后，CA/CPR組在大鼠呼氣末夾閉氣管導(dǎo)管制備CA/CPR模型。CA后5 min時(shí)開(kāi)始純氧機(jī)械通氣（頻率70次/min，潮氣量6 mL/kg），同時(shí)進(jìn)行人工胸外心臟按壓，按壓頻率為150～180次/min， 深度為大鼠胸廓前后徑的1/3，同時(shí)經(jīng)頸靜脈注射腎上腺素0.02 mg/kg，直至恢復(fù)ROSC時(shí)停止按壓。CA判斷標(biāo)準(zhǔn)為心電圖呈室顫、停搏或無(wú)脈性電活動(dòng)，收縮壓≤25 mm Hg（1 mmHg=0.133 kPa）。ROSC判斷標(biāo)準(zhǔn)為心電圖出現(xiàn)自主節(jié)律，收縮壓＞60 mm Hg， 并持續(xù)10 min以上。所有大鼠在ROSC后6 h取心尖部心肌組織、血樣待測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 36只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法被均分為6組，干預(yù)劑注射方法均參照BIAN等[11]的研究方法：①假手術(shù)對(duì)照（Sham）組：僅實(shí)施麻醉、組織血管分離、插管等手術(shù)操作，未進(jìn)行窒息性操作。②心搏驟停復(fù)蘇（CA）組：使用窒息法構(gòu)建 窒息型CA/CPR模型。③CA+miR-1抑制劑（CA+antago miR-1）組：術(shù)前3 d通過(guò)尾靜脈注射200 pmol（/kg·d） antago miR-1，連續(xù)注射3 d，進(jìn)行窒息型CA操作。④CA+miR抑制劑陰性對(duì)照（CA+antago miR NC）組：在與CA+antago miR-1組同一時(shí)間點(diǎn)，注射等劑量antago miR NC，進(jìn)行窒息型CA操作。⑤CA+miR-1模擬物（CA+ago miR-1）組：術(shù)前3 d通過(guò)尾靜脈通路注射100 pmol（/kg·d） ago miR-1，連續(xù)注射3 d， 進(jìn)行窒息型CA操作。⑥CA+miR模擬物陰性對(duì)照（CA+ ago miR NC）組：在與CA+ago miR-1組同一時(shí)間點(diǎn)，注射等劑量ago miR NC，進(jìn)行窒息型CA操作。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative poly-merase chain reaction, qPCR）檢測(cè)細(xì)胞miRNA-1水平 按照RNA提取試劑TRIzol的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，提取心肌組織總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)，以U6作內(nèi)參。PCR擴(kuò)增條件為： 95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。使用的引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，序列如下：miR-1 F 5’-GCGCGTGGAATGTAA AGAAGT-3’；miR-1 R 5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’； U6 F 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；U6 R 5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。以Sham組表達(dá)量為 1，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的表達(dá)量。

1.5 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞焦亡率 參照陳穎 等[12]的研究方法，使用TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞焦亡率。按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，將各組心肌組織取出后，用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行脫水、包埋、切片，枸櫞酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）清洗2次，加入含0.2% Triton X-100的PBS，室溫孵育5 min，PBS清洗2次，加入TUNEL檢測(cè)液，37 ℃ 避光孵育60 min，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）復(fù)染樣品，正置熒光顯微鏡成像。對(duì)每個(gè)視野下TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)得出各組細(xì)胞焦亡率（焦亡率= TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野細(xì)胞核總數(shù)）。

1.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測(cè)NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法定量。細(xì)胞蛋白經(jīng)凝膠電泳、電轉(zhuǎn)移和緩沖液封閉后，加入一抗NLRP3（1:500）、GAPDH（1:1 000）、Caspase-1（1:1 000）、IL-18（1:1 000）或IL-1β（1:1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后加入二抗（1:500）常溫孵育2 h。再次洗膜后，加入1 mL 電化學(xué)發(fā)光液與膜充分接觸，于成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。以Sham組默認(rèn)為1比較，實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組的蛋白條帶吸光度（absorbance, A）值相對(duì)比值表示目的蛋白的表達(dá)量。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血清CK-MB、cTnI含量 采用尾部斷尾采血方法采集外周血。采集的血液，先放在37 ℃培養(yǎng)箱溫浴1 h，4 ℃冰箱過(guò)夜；取出以3 000 r/min離心15 min分離出血清。采用ELISA測(cè)定大鼠血清CK-MB、cTnI的含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，并采用Bonferroni校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、基礎(chǔ)MAP的比較 各組大鼠體質(zhì)量、基礎(chǔ)MAP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、基礎(chǔ)MAP水平比較（每組n=6，±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、基礎(chǔ)MAP水平比較（每組n=6，±s）

組別 體質(zhì)量（g） 基礎(chǔ)MAP（mmHg）Sham組 276.0±14.0 111.7±5.6 CA組 271.5±12.1 110.2±3.3 CA+antago miR-1組 280.3± 9.4 111.3±4.2 CA+ago miR-1組 272.3± 8.3 111.8±6.3 CA+antago miR NC組 278.3±11.9 111.2±7.6 CA+ago miR NC組 270.8±14.7 108.3±5.6 F 2.250 0.353 P 0.145 0.749

2.2 各組大鼠心肌miRNA-1水平比較 各組大鼠心肌miRNA-1水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=207.2，P＜ 0.01）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與Sham組比，CA組、CA+ antago miR-1組、CA+ago miR-1組、CA+antago miR NC組、CA+ago miR NC組大鼠心肌miR-1表達(dá)均有升高（均P＜0.01）。與CA組比，CA+antago miR-1組大鼠心肌miR-1表達(dá)降低（P＜0.01），CA+ago miR-1組大鼠心肌miR-1表達(dá)升高（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織miRNA-1表達(dá)量

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 與CA組比，CA+antago miR-1組大鼠心肌焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18表達(dá)降低 （P＜0.05），CA+ago miR-1組大鼠心肌焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18表達(dá)升高（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞焦亡率的比較 經(jīng)TUNEL法檢測(cè)，與CA組比較，CA+antago miR-1組大鼠心肌焦亡率降低（P＜0.01），CA+ago miR-1組大鼠心肌焦亡率升高（P＜0.01），CA+antago miR NC組、CA+ago miR NC組大鼠心肌焦亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見(jiàn)圖3、圖4。

圖4 各組大鼠心肌細(xì)胞焦亡率的比較

2.5 各組大鼠CA/CPR后血清中CK-MB、cTnI水平變化 經(jīng)ELISA法檢測(cè)，與CA組比較，CA+antago miR-1組大鼠心肌CK-MB、cTnI水平降低（均P＜0.05），CA+ago miR-1組大鼠心肌CK-MB、cTnI水平升高（P＜0.01），CA+antago miR NC組、CA+ago miR NC組大鼠心肌CK-MB、cTnI水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠CA/CPR后血清中CK-MB、cTnI水平

3 討論

miR-1作為肌肉組織特異性表達(dá)miRNA，在肌肉及心肌組織中具有重要作用，JAYAWARDENA等[13]研究表明，miR-1在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷時(shí)發(fā)生的凋亡中發(fā)揮顯著作用。ZHOU等[14]的研究表明，miR-1通過(guò)改變Bax和Bcl-2影響心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而對(duì)心肌損傷具有促進(jìn)作用，即抑制miR-1可減輕心肌損傷。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞焦亡都屬于程序性細(xì)胞死亡，細(xì)胞凋亡是經(jīng)典的PCD模式，它的主要特征是細(xì)胞皺縮以及凋亡小體的形成[15]；而細(xì)胞焦亡由外源性感染導(dǎo)致的，它的特征是會(huì)釋放出IL-1β和其他小分子物質(zhì)，從而導(dǎo)致發(fā)生炎癥反應(yīng)[16]。

本研究根據(jù)以往心肺復(fù)蘇后心肌損傷的不同時(shí)間點(diǎn)變化，選取大鼠CA/CPR ROSC后心肌損傷的高峰時(shí)間點(diǎn)，即ROSC后6 h為觀察點(diǎn)，比較Sham組、CA組、CA+ago miR-1組和CA+antago miR-1組的心肌細(xì)胞miR-1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CA組、CA+ago miR-1組和CA+antago miR-1組miR-1表達(dá)均顯著高于Sham組，加用ago miR-1后比CA組miR-1表達(dá)顯著增高，加用antago miR-1后比CA組miR-1表達(dá)顯著降低，而兩個(gè)NC組和CA組miR-1表達(dá)無(wú)差別，提示在大鼠CA/CPR模型中，靜脈通路加用ago miR-1可以促進(jìn)心肌細(xì)胞miR-1的表達(dá)，靜脈通路加用antago miR-1可以減少心肌細(xì)胞miR-1的表達(dá)，也說(shuō)明可以使用靜脈通路加用ago miR-1或antago miR-1來(lái)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞miR-1的表達(dá)從而觀察miR-1對(duì)相關(guān)指標(biāo)的影響。

CK-MB和cTnI均是常用的心肌損傷標(biāo)志物，廣泛應(yīng)用于臨床診斷多年[17]。與CK-MB相比，cTnI在診斷心肌損傷中敏感性和特異性更高[18]。研究發(fā)現(xiàn)，在CA/CPR動(dòng)物模型及患者身上，血清中CK-MB、cTnI都明顯升高，提示出現(xiàn)了明顯的心肌損傷[19-20]。 本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，CA組大鼠ROSC后6 h血清CK-MB和cTnI均明顯升高，提示存在心肌損傷，和上述他人研究結(jié)果一致。本研究進(jìn)一步使用靜脈通路加用ago miR-1或antago miR-1來(lái)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞miR-1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與CA組相比，CA+antago miR-1組大鼠心肌CK-MB、cTnI水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的降低，而CA+ago miR-1組大鼠心肌CK-MB、cTnI水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的升高，但還是均高于對(duì)照組，提示調(diào)節(jié)心肌miR-1可以調(diào)控心肌損傷，表明miR-1促進(jìn)了CA/CPR后的心肌損傷，減少CA/CPR后心肌miR-1的表達(dá)具有心臟保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)[21-22]，細(xì)胞焦亡與許多心肌疾病、動(dòng)脈粥樣硬化以及各種導(dǎo)致器官功能障礙的疾病有著十分密切的關(guān)系。焦亡的經(jīng)典途徑在于活化的NLRP3 與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein, ASC）寡聚形成ASC斑點(diǎn)。pro-Caspase-1在形成的ASC斑點(diǎn)誘導(dǎo)作用下，將被切割后變?yōu)槌墒斓腃aspase-1，而Caspase-1又對(duì)pro-IL-1β、pro-IL-18進(jìn)行分裂作用，使其形成成熟的IL-1β、IL-18并釋放到細(xì)胞外[23-24]。因此，焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β和直接用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞焦亡率均可作為觀測(cè)焦亡水平的指標(biāo)。心肺復(fù)蘇后心肌細(xì)胞焦亡情況目前少有研究，本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，CA組大鼠ROSC后6 h心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β和焦亡率均明顯增加，提示CA/CPR后存在明顯的細(xì)胞焦亡的現(xiàn)象。進(jìn)一步與CA組比較，靜脈加用ago miR-1促使心肌miR-1表達(dá)后，CA+ago miR-1組大鼠心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β和焦亡率更是明顯增加，靜脈使用antago miR-1抑制心肌細(xì)胞miR-1表達(dá)后，CA+antago miR-1組大鼠心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β和焦亡率明顯減少，提示改變CA/CPR后心肌miR-1表達(dá)可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞焦亡水平，過(guò)表達(dá)miR-1會(huì)加劇心肌焦亡，減少miR-1表達(dá)則可抑制心肌焦亡，結(jié)合細(xì)胞焦亡必然引起組織損傷，提示CA/CPR后心肌miR-1表達(dá)促進(jìn)心肌損傷可能是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞焦亡的途徑。

綜上所述，靜脈使用ago miR-1和antago miR-1可以調(diào)節(jié)CA/CPR后大鼠心肌細(xì)胞miR-1的表達(dá)，進(jìn)而可促進(jìn)或減少心肌損傷，其機(jī)制可能和miR-1調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞焦亡有關(guān)，抑制CA/CPR后心肌細(xì)胞的miR-1表達(dá)，可降低心肌細(xì)胞的焦亡水平，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞，是潛在的治療靶點(diǎn)。