白細胞介素10在銀屑病中的表達特征及影響

鄭易，潘麗娜，高宇

1.溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院（生命科學學院），浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 皮膚科，浙江 溫州 325027

銀屑病是一種常見的慢性復發(fā)性炎癥性皮膚病，目前全球的發(fā)病率約為2%[1]。銀屑病的臨床癥狀主要表現(xiàn)為邊界清楚的紅斑、丘疹、斑塊和鱗屑等，表皮和真皮中炎癥細胞浸潤，如T淋巴細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等[2-3]。盡管銀屑病臨床表現(xiàn)明確，但確切病因和發(fā)病機制尚不明確?，F(xiàn)有研究認為銀屑病與遺傳、感染、代謝障礙、內(nèi)分泌紊亂和免疫失調(diào)等因素均有關(guān)，且反復發(fā)作的紅斑、瘙癢和脫屑使患者的生活質(zhì)量受到影響，甚至造成極大的心里負擔[4-5]。

白介素10（interleukin-10, IL-10）是一種多細胞源、多功能的細胞因子，調(diào)節(jié)細胞的生長與分化，參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，是公認的炎癥與免疫抑制因子[6]。FIORENTINO等[7]首次發(fā)現(xiàn)了一種可以抑制Th1細胞合成γ干擾素（interferon-γ, IFN-γ）的細胞因子，稱之為IL-10，它是IL-10依賴的調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）發(fā)揮免疫負向調(diào)控作用的重要細胞因子。既往研究大部分針對銀屑病患者血中IL-10水平，對于皮損部位的IL-10含量和分布沒有檢測，相對不夠全面[8-9]。本研究采用咪喹莫特乳膏（imiquimod，IMQ）誘導野生型和IL-10-/-小鼠建立銀屑病動物模型，同時結(jié)合臨床銀屑病患者樣本，進一步明確IL-10在病損部位的分布與表達，探討其在銀屑病發(fā)生發(fā)展中的作用機制，從而為銀屑病患者的治療提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1 .1 臨床患者：選取2018年10月至2019年12月于溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院收治的40例進行期銀屑病患者，經(jīng)本院病理科病理活檢確診，均為初發(fā)或者6個月內(nèi)未使用過糖皮質(zhì)激素或者免疫抑制劑者，并無其他皮膚病及全身系統(tǒng)性疾病。本研究經(jīng)過患者知情同意并且通過溫州醫(yī)科大學倫理委員會審查。

1.1 .2 實驗動物：C57BL/6野生型小鼠購于中國科學院上海實驗動物中心，IL-10-/-小鼠購于上海南方模式生物科技股份有限公司。所有小鼠均置于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級屏障環(huán)境中飼養(yǎng)。動物許可證號：SYXK（浙）2015-0009。

1.1 .3 主要藥物與試劑：IMQ購自四川明欣藥業(yè)有限責任公司，IgG H&L（HRP）、Anti-CD19抗體（ab245235）、Anti-IL-10抗體（ab189392）、Anti-CD4抗體（ab183685）和CD4二抗（Alexa Fluor?488，ab150077）購自美國Abcam公司；超敏SABC免疫組化檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，DAB底物試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2 .1 患者臨床資料收集：收集銀屑病患者信息，包括初發(fā)年齡、性別、銀屑病面積和嚴重程度指數(shù)（psoriasis area and severity index, PASI）評分等。

1.2 .2 小鼠銀屑病模型建立及評價：取12～16周的C57BL/6小鼠（WT）和IL-10敲除（IL-10-/-）小鼠，分別分為造模組和對照組，即WT對照組、WT造模組和IL-10-/-對照組、IL-10-/-造模組，每組8只。剔除背部毛發(fā)，面積約2 cm×3 cm，造模組每日用棉簽蘸取62.5 mg IMQ均勻涂抹背部剃毛區(qū)域和左耳，對照組小鼠相同區(qū)域涂抹等量凡士林，均連續(xù)7 d，每天用游標卡尺量取各組小鼠左耳厚度并拍照記錄背部皮損情況。依據(jù)PASI評分準則進行模型評價，因皮損面積均為背部且大小一致，不予考慮面積百分比，從皮損處紅斑顏色、鱗屑及皮膚浸潤厚度三項指標進行評價，分別記0～4分，三者得分相加記為總分。0分：無；1分：輕度；2分：中度；3分：重度；4分：極重度。

1.2 .3 組織病理觀察：末次給藥24 h后，吸入CO2處死小鼠，用九宮格法取1 cm×1 cm面積大小背部皮損及左耳置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，HE染色制作病理切片。患者HE切片由醫(yī)院提供。

1.2 .4 免疫組化：各組石蠟包埋樣本使用石蠟切片機切5～6 μm薄片，65 ℃脫蠟后進行水化和抗原修復，5% BSA封閉，一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃恒溫濕盒孵育1 h，TBST清洗3次后DAB顯色，蘇木素復染，脫色透明，用中性樹膠封片后于光學顯微鏡下觀察。免疫組化評分標準及結(jié)果判斷：根據(jù)細胞染色強度，評分為4級：無陽性著色（陰性）計0分，淡黃色（弱陽性）計1分，棕黃色（陽性）計2分，棕褐色（強陽性）計3分。本研究將評分大于1分的細胞記為陽性細胞。計數(shù)20倍鏡下隨機5個視野的陽性細胞數(shù)，再求一個平均數(shù)即為這張片子的陽性細胞數(shù)。

1.2 .5 免疫熒光：末次給藥24 h后，吸入CO2處死小鼠，用九宮格法取1 cm×1 cm面積大小背部皮損用OCT冷凍包埋，并在冷凍切片機上切成8～10 μm切片。在0.1% Titon-X100和封閉液孵育1 h，加一抗（1:200）濕盒中4 ℃冰箱孵育過夜，在PBS中洗滌3次，然后在室溫下孵育二抗2 h，DAPI復染后用防熒光淬滅劑封片后于激光共聚焦顯微鏡下觀察。銀屑病患者病損部位冰凍切片免疫熒光處理方式同上。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，不同時間點之間的比較采用重復測量資料的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病患者結(jié)果

2.1 .1 銀屑病患者PASI評分及分析：銀屑病患者年齡為（38.2±13.2）歲，男24例，女16例，PASI評分為9.36±5.92，其中病情較輕者（PASI＜9分）有23例，病情較重者（PASI≥9分）有17例。

2.1 .2 銀屑病患者皮膚樣本HE染色結(jié)果：銀屑病患者皮損部位存在角化過度，皮突延長，表皮增厚，棘層中有Kogoj海綿狀膿瘍，真皮層有單核細胞浸潤等現(xiàn)象，見圖1。

圖1 銀屑病患者皮膚樣本HE染色結(jié)果圖（×200）

2.1 .3 銀屑病患者皮膚樣本免疫熒光染色結(jié)果：銀屑病患者皮損部位的CD4+T細胞主要定位于真皮層和棘層下部。當定位于棘層下部時，常伴隨著淋巴細胞聚集而成的微膿腫。見圖2。

圖2 銀屑病患者皮膚樣本免疫熒光染色結(jié)果（×200）

2.2 銀屑病小鼠模型

2.2 .1 小鼠皮損臨床表現(xiàn)及PASI評分：造模后7 d，WT對照組和IL-10-/-對照組小鼠背部區(qū)域皮膚光滑平整，無任何炎性癥狀和增厚現(xiàn)象，而WT造模組和IL-10-/-造模組小鼠均出現(xiàn)銀屑病樣臨床癥狀，背部皮損區(qū)域出現(xiàn)紅斑并覆蓋大量多層鱗屑，表皮增厚隆起。IL-10-/-造模組小鼠皮損處紅斑、鱗屑及肥厚的程度較WT造模組嚴重。見圖3A。

PASI評分結(jié)果表明，WT造模組和IL-10-/-造模組小鼠從造模后第2天開始皮損處紅斑評分、鱗屑評分、皮膚浸潤厚度評分及PASI總評分和耳朵厚度均升高，而后逐漸加重并于第7天達到高峰，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與對應(yīng)的對照組相比，造模后第2天至第7天WT造模組和IL-10-/-造模組小鼠皮損處紅斑評分、鱗屑評分、皮膚浸潤厚度評分及PASI總評分和耳朵厚度均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；除造模后第2天WT造模組和IL-10-/-造模組小鼠皮損處紅斑評分差異無統(tǒng)計學意義外 （P＞0.05），IL-10-/-造模組小鼠皮損處紅斑評分、鱗屑評分、皮膚浸潤厚度評分及PASI總評分和耳朵厚度與WT造模組相比均顯著升高（P＜0.05）。WT對照組和IL-10-/-對照組小鼠皮膚狀況差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3B。

圖3 小鼠銀屑病模型背部皮膚PASI評分和耳朵厚度

2.2 .2 組織病理學表現(xiàn)：WT對照組和IL-10-/-對照組小鼠的背部區(qū)域皮膚表皮平坦，角質(zhì)層較薄，顆粒層為1～3層，未出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。WT造模組和IL-10-/-造模組小鼠均出現(xiàn)表皮明顯增厚、顆粒層減少或消失、角質(zhì)層角化過度、表皮層棘層肥厚、表皮突向下延伸和真皮層炎癥細胞浸潤等銀屑病皮損典型的病理特征。IL-10-/-造模組小鼠的背部皮膚炎癥反應(yīng)強于WT造模組小鼠且表皮增厚現(xiàn)象更為明顯。耳部皮損改變趨勢與背部相一致。見圖4。

圖4 小鼠皮膚組織HE染色結(jié)果（×200）

WT造模組小鼠背部皮膚表皮垂直厚度大于WT對照組，IL-10-/-造模組小鼠背部皮膚表皮垂直厚度大于IL-10-/-對照組和WT造模組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同樣，WT造模組小鼠耳朵皮膚表皮垂直厚度大于WT對照組，IL-10-/-造模組小鼠耳朵皮膚表皮垂直厚度大于IL-10-/-對照組和WT造模組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠皮損部位表皮平均垂直厚度比較（每組n=8，±s，μm）

表1 各組小鼠皮損部位表皮平均垂直厚度比較（每組n=8，±s，μm）

與WT對照組比：aP＜0.05；與IL-10-/-對照組比：bP＜0.05；與WT造模組比：cP＜0.05

部位 組別 表皮平均垂直厚度背部 WT對照組 20.40±6.82 WT造模組 48.05±3.80a IL-10-/-對照組 14.14±3.51 IL-10-/-造模組 67.48±9.51bc耳朵 WT對照組 12.83±4.50 WT造模組 20.90±7.51a IL-10-/-對照組 10.45±3.15 IL-10-/-造模組 43.32±9.71bc

2.2 .3 免疫組化染色：WT造模組小鼠皮損組織中IL-10陽性表達率低于WT對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。WT造模組和WT對照組小鼠皮損CD19陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而IL-10-/-造模組小鼠CD19陽性表達率略高于IL-10-/-對照組和WT造模組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 小鼠背部病損皮膚組織IL-10及CD19免疫組化染色結(jié)果（×200）

2.2 .4 免疫熒光染色：WT對照組和IL-10-/-對照組小鼠CD4的陽性表達主要分布于表皮-真皮交界處，而WT造模組中CD4的陽性表達遍布整個表皮層，IL-10-/-造模組小鼠皮膚組織表皮層和真皮層均存在明顯的陽性表達。這提示隨著銀屑病的發(fā)展與炎癥程度的加深，輔助性T細胞的增殖逐步從表皮-真皮交界處向表皮遷移，進而引起皮膚的增厚。見圖6。

圖6 小鼠免疫熒光染色結(jié)果（×200）

3 討論

銀屑病是一種多因素引起的慢性炎癥性皮膚病，目前發(fā)病機制不明，一般認為是免疫系統(tǒng)紊亂和皮膚組織細胞相互作用的結(jié)果，可引起紅斑、界限清楚的橢圓形斑塊，以及鱗屑等臨床癥狀[10]。近年來，免疫和炎癥性因素被認為是造成銀屑病的主要原因。

IMQ是Toll樣受體（Toll-like receptors, TLR）7/8的激動劑，臨床研究結(jié)果表明其可誘導小鼠皮膚出現(xiàn)銀屑病樣皮損及病理生理變化[11]。本研究采用連續(xù)7 d涂抹IMQ，使其局部作用于WT小鼠和IL-10-/-小鼠背部和耳朵皮膚，誘導銀屑病動物模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模組小鼠涂藥部位皮膚明顯增厚并出現(xiàn)紅斑、磷屑，且IL-10-/-造模組小鼠皮膚相較于WT造模組變化更大，HE結(jié)果顯示造模組小鼠皮膚表皮層出現(xiàn)不同程度的增厚，IL-10-/-造模組小鼠背部皮膚改變程度比WT造模組小鼠更強，明顯可見角質(zhì)層角化過度，Munro微膿腫，透明層顆粒減少或消失，并且表皮層棘層過度肥厚，出現(xiàn)Kogoj海綿狀微膿瘍并向下延伸呈釘突狀，真皮層部位存在炎癥細胞浸潤以及血管擴張等現(xiàn)象。同時結(jié)合臨床患者樣本比較，確認通過IMQ造模能產(chǎn)生類銀屑病樣皮損，該造模方法省時可靠并操作簡便，較適合于常規(guī)實驗的開展。

IL-10是一類具有免疫抑制作用的細胞因子，單核巨噬細胞是其主要生理來源，輔助性T細胞、樹突狀細胞（dendritic cells, DC）、調(diào)節(jié)性T細胞等也具有產(chǎn)生IL-10的能力[12-13]；IL-10能降低抗原提呈細胞（antigen-presenting cells, APC）對抗原的提呈能力及誘導DC細胞的凋亡，對APC起到明顯抑制作用[14]；并能抑制DC和巨噬細胞分泌促炎因子如IL-1、IL-6和TNF等，從而導致T細胞活性和免疫應(yīng)答能力的降低[15]。MAVROPOULOS等[16]通過阿普斯特（Apremilast，PDE4的抑制劑，可以增加IL-10分泌）治療30例銀屑病和20例銀屑病關(guān)節(jié)炎患者，發(fā)現(xiàn)阿普斯特治療后B10（IL-10+CD19+）細胞在所有患者體內(nèi)均有所增加，并與銀屑病患者皮膚和關(guān)節(jié)的臨床改善相關(guān)。張力文等[17]采用免疫組織化學法發(fā)現(xiàn)Foxp3、IL-10在尋常性銀屑病患者皮損組織中的表達顯著低于正常皮膚組織；本研究在動物模型中發(fā)現(xiàn)野生型小鼠造模后皮損組織IL-10陽性表達低于對照組，與該文獻結(jié)果一致，提示隨著模型的建立，局部皮膚部位IL-10表達受到抑制，從而導致炎癥反應(yīng)加重。另外，CD19是B細胞的主要表面標記物。近年來有研究發(fā)現(xiàn)B細胞可能在銀屑病的發(fā)病機制中也起了十分重要的作用[18-19]。在野生型小鼠中，造模組皮損區(qū)CD19的含量較對照組有下降的趨勢，推測局部皮膚組織消耗B細胞來對抗炎癥的產(chǎn)生。但是在IL-10-/-小鼠中，造模組皮損區(qū)CD19含量又有所升高，提示可能由于IL-10的敲除，導致B細胞在該類型小鼠皮膚內(nèi)局部病灶區(qū)域表達有所增加。

CD4是T淋巴細胞的表面標記物，可用于識別輔助性T細胞。CD4+輔助性T細胞（Th細胞）對機體的特異性免疫和非特異性免疫均有重要的調(diào)節(jié)作用，其功能為產(chǎn)生多種細胞因子，促進T/B細胞分化增殖，是機體內(nèi)一類重要的免疫調(diào)節(jié)細胞。根據(jù)Th細胞分泌的細胞因子類型的不同，Th分成兩個亞型：Th1與Th2[20]。IL-10是主要由CD4+Th2細胞分泌的一種發(fā)揮負調(diào)控作用的細胞因子，具有強大的抗炎作用。本研究中免疫熒光結(jié)果顯示，CD4在WT對照組和IL-10-/-對照組中的陽性表達主要定位于表皮-真皮交界處，而在WT造模組中CD4的陽性表達遍布整個表皮層，IL-10-/-造模組皮膚組織真皮層也存在明顯的陽性表達。提示隨著銀屑病的發(fā)展與炎癥程度的加深，輔助性T細胞的增殖逐步從表皮-真皮交界處向表皮遷移，進而引起皮膚的增厚。IL-10-/-小鼠由于本身存在免疫缺陷，機體缺少抑炎因子作用。病灶中輔助性T細胞在真皮內(nèi)部陽性的聚集和增加可能是由于局部增殖或體外增殖的T細胞再循環(huán)而聚集。Th1及其分泌的IFN-γ對銀屑病的產(chǎn)生起主導作用[21-22]，IL-10的缺失加劇了銀屑病中Th1/Th2細胞平衡失調(diào)，所以病情的發(fā)生與進展更加嚴重。近年來也有研究顯示在銀屑病患者外周血中存在Th17/Treg失衡并與其發(fā)病有著一定的關(guān)系[23-26]。 OWCZARCZYK-SACIONEK等[27]通過探究銀屑病患者皮膚和血清中Treg標記物以及保護性細胞因子的表達情況，發(fā)現(xiàn)血清中IL-17、IL-23水平隨尋常型銀屑病的加重而上升，血清IL-10、TGF-β水平隨之而下降，說明尋常型銀屑病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)生了Th17/Treg細胞及相關(guān)細胞因子的失衡。IL-10本身抑制Th1細胞的IFN-γ產(chǎn)生，IFN-γ缺乏就會增強APC的失活，IL-10也可以減少巨噬細胞分泌IL-23，這種細胞因子對于Th17細胞免疫是必須的[28]。

本研究利用IL-10-/-和WT小鼠共同探討IL-10與銀屑病的關(guān)系，成功建立了IMQ誘導的銀屑病模型，同時結(jié)合銀屑病臨床患者樣本，從形態(tài)學方面對兩者的關(guān)系進行初步探索，明確了IL-10相對或絕對的缺乏，會導致持續(xù)的免疫激活，加重銀屑病的發(fā)生和進展，其可能通過增加鱗屑發(fā)生，促進皮膚表皮層角質(zhì)形成細胞的增殖與分化，從而加重銀屑病樣皮損改變。但銀屑病病因及發(fā)病機制復雜，仍需進一步深入的研究及探索。