antagomir-30d轉(zhuǎn)染BMSCs聯(lián)合CPC支架材料的異位成骨作用

陳威，汪艷，金瓊，黃慧

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 兒童口腔科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 種植科，浙江 溫州 325000；3.上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院 修復(fù)科，上海 200011

本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了antagomir-30d正性調(diào)控大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化作用[1]，針對這一研究成果，本研究擬建立體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-30d對成骨調(diào)控的作用。研究假設(shè)由骨生長調(diào)控因子miRNA、種子細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）、生物支架材料磷酸鈣骨水泥（calcium phosphate cement, CPC）構(gòu)建的組織工程骨復(fù)合物可以用作理想的骨再生材料。實(shí)驗(yàn)中，我們將復(fù)合物植入到裸鼠皮下，并分別于植入后2周、4周、8周取出植入體。其中，2周的植入體用于抽提RNA進(jìn)行RT-PCR檢測，分析成骨基因堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、骨鈣素（osteocalcin, OC）和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runtrelated transcription factor 2, RUNX2）mRNA水平的表達(dá)情況。植入后4周、8周的植入體取出進(jìn)行苦味酸品紅組織學(xué)染色和組織形態(tài)學(xué)計(jì)量觀察分析新骨生成情況。實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建骨重建調(diào)控因子antagomir-30d/種子細(xì)胞BMSCs/CPC支架材料組織工程骨復(fù)合物用于BALB/c裸鼠皮下異位成骨模型，探討其與新生骨形成之間可能的聯(lián)系，為深入研究miRNAs的功能及體內(nèi)應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料 8周齡SPF級BALB/c裸鼠15只，雄性，健康。所有動(dòng)物及培養(yǎng)條件均由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SYXK（滬）2020-0025。多孔支架材料CPC，由上海瑞邦生物材料有限公司提供，孔徑400～500 μm，孔隙率約為72%。成品為圓柱形外觀，直徑5 mm，高2 mm，經(jīng)高溫高壓消毒備用。α-MEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit購自日本Takara公司，Superscript II反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司，RNAse Free Water購自美國Ambion公司，品紅購自上海邁坤化工有限公司，苦味酸購自上海順勃生物工程有限公司。

1.2 大鼠BMSCs的獲取和培養(yǎng)方法 大鼠脫臼處死，置于75%乙醇中浸泡消毒10 min，在無菌條件下取其脛骨和股骨，剔除其周圍附著肌肉，將其兩端干骺端剪除，暴露骨髓腔。10 mL無菌注射器吸取含有肝素（200 U/mL）和10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔至由紅色變?yōu)榘咨?。?xì)胞懸液以 1 800 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清液，加入標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液10 mL，用滴管輕輕吹散細(xì)胞團(tuán)后接種于10 cm培養(yǎng)皿上。放置于37 ℃，5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日首次換液，以后每3 d換液。待鏡下觀察細(xì)胞呈80%匯合時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，0.25%胰酶和0.02% EDTA消化貼壁細(xì)胞，在1～2 min于鏡下見貼壁細(xì)胞皺縮后，加入適量培養(yǎng)液終止消化，吸取培養(yǎng)液輕吹尚未脫落的細(xì)胞至所有細(xì)胞懸起，然后轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，吹打使之分散均勻。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。將細(xì)胞懸液以1 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清液，加入α-MEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，輕輕吹打使細(xì)胞分散均勻，接種于數(shù)個(gè)10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37 ℃，5% CO2，飽和濕度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和形態(tài)變化。待細(xì)胞80%匯合時(shí)按上述操作進(jìn)行傳代。采用第2或第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞行成骨誘導(dǎo)分化時(shí)，需采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。

1.3 細(xì)胞處理 采用第2或第3代BMSCs鋪板于6孔板底，每孔的細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔。實(shí)驗(yàn)共分3組：空白對照組、antagomir-30d組、NC組（NC為采用無意義的一段核苷酸，用于antagomir-30d的陰性對照）。鋪板后次日antagomir-30d組與NC組分別加入antagomir-30d與NC使之終濃度為150 nmol/L，空白對照組不做處理。48 h后更換成骨誘導(dǎo)液，每3 d換液，培養(yǎng)至7 d，收集細(xì)胞。

1.4 裸鼠異位成骨分析

1.4 .1 實(shí)驗(yàn)分組：本研究分為3組：CPC+未做轉(zhuǎn)染的BMSCs（空白對照組）；CPC+轉(zhuǎn)染150 nmol/L antagomir-30d的BMSCs（antagomir-30d組）；CPC+轉(zhuǎn)染150 nmol/L NC的BMSCs（NC組）。

1.4 .2 細(xì)胞支架材料復(fù)合物的體外構(gòu)建：①將直徑為5 mm，高2 mm的圓柱形多孔CPC材料放入EP管中，消毒備用。②處理細(xì)胞，成骨誘導(dǎo)7 d后，0.25% 胰酶和0.02% EDTA消化收集細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，使其終濃度為1×107個(gè)/mL，然后將各組細(xì)胞（未做轉(zhuǎn)染的BMSCs、轉(zhuǎn)染150 nmol/L antagomir-30d的BMSCs、轉(zhuǎn)染150 nmol/L NC的BMSCs）分別接種于消毒備用的圓柱狀CPC支架材料上，使材料飽和而沒有含細(xì)胞的培養(yǎng)液流出。③將各組細(xì)胞因子支架材料復(fù)合體植入裸鼠皮下（方法見1.4.3）。④剩余細(xì)胞材料復(fù)合體于體外繼續(xù)培養(yǎng)。待體外培養(yǎng)至1、3 d后，收集細(xì)胞材料復(fù)合體于掃描電鏡下觀察超微形態(tài)。將細(xì)胞材料復(fù)合體于預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液中固定。固定完成后，不同濃度乙醇中梯度脫水（50%、70%、80%、90%、100%、100%）。各乙醇濃度分別脫水10 min。抽真空，噴金，掃描電鏡觀察細(xì)胞黏附與伸展。

1.4 .3 手術(shù)方法：①SPF級BALB/c裸鼠行乙醚吸入麻醉。取其正中俯臥位，將其背部脊柱兩側(cè)術(shù)區(qū)用75%乙醇消毒。②在裸鼠背部正中兩側(cè)，距脊柱約10 mm處，沿脊柱長軸切開，作長約15 mm的長條形切口，鈍性分離至切口下約10 mm。共作3個(gè)切口[2]。③隨機(jī)將antagomir-30d組、空白對照組和NC組細(xì)胞因子支架材料復(fù)合體植入裸鼠背部各切口處。4-0縫線縫合，放回籠內(nèi)飼養(yǎng)。

1.4 .4 術(shù)后動(dòng)物大體觀察：觀察術(shù)后動(dòng)物的精神、飲食情況、傷口有無感染以及有無材料排出等異 常[2]。

1.4 .5 植入物大體觀察：分別于術(shù)后第2、第4、第8周，處死裸鼠5只。取出植入物，并觀察其形態(tài)、色澤及包膜情況。

1.5 RT-PCR TRIzol法抽提細(xì)胞總RNA。依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)NCBI網(wǎng)站 GenBank數(shù)據(jù)庫查詢大鼠相關(guān)基因的mRNA序列，應(yīng)用Oligo 6.71軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)[3]。

1.6 組織學(xué)染色

1.6 .1 硬組織切片的制備：分別于術(shù)后4周、8周取出植入物，經(jīng)過固定，脫水，透明，滲透，包埋后切片處理。

1.6 .2 硬組織切片苦味酸品紅組織學(xué)染色：標(biāo)本超聲去雜質(zhì)30 s，雙蒸水沖洗2 min；將切片置于0.1%甲酸溶液中3 min，流水沖洗2 min；置于20%甲醇中2 h，流水沖洗2 min；將切片置于60 ℃恒溫水浴箱內(nèi)，Stevenol藍(lán)染液染色5 min；60 ℃雙蒸水沖洗2 min，并擦干；室溫下，用現(xiàn)配的苦味酸品紅溶液染色，染色8 min；100%乙醇洗滌2次，切片盒中操作。顯微鏡下觀察和拍照。

1.6 .3 組織形態(tài)學(xué)分析：將第4周及第8周的組織學(xué)切片，置于低倍顯微鏡下電腦攝取圖像（Image Pro 6.0 system），包括完整的植入物視野。利用圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)新生骨在各植入物區(qū)域所占的面積百分比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs在CPC表面生長的超微形態(tài)觀察 掃描電鏡下觀察可見BMSCs在CPC支架上生長良好，復(fù)合培養(yǎng)l d后，BMSCs細(xì)胞黏附于CPC表面，有的細(xì)胞突觸開始伸展；3 d后，可見細(xì)胞數(shù)量明顯增多，在CPC表面連接成片，相互融合。見圖1。

圖1 掃描電鏡觀察BMSCs在CPC材料上生長情況（×500）

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大體觀察 植入手術(shù)后所有實(shí)驗(yàn)裸鼠蘇醒順利，且精神、活動(dòng)、飲食正常。傷口愈合良好，未觀察到有紅腫、感染、開裂及竇道形成，未觀察到植入物排出[2]。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，未出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡（見圖2）。

圖2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大體觀察

2.3 植入物大體觀察 植入后至取出的各時(shí)間點(diǎn)，植入物周圍有薄層纖維膜樣物質(zhì)覆蓋，外觀保持圓柱形，植入體周圍無積液，無化膿感染現(xiàn)象（見圖3）。

圖3 植入物大體觀察

2.4 植入4周后組織學(xué)觀察 復(fù)合物植入后4周，光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，空白對照組和NC組均未見新骨形成，而antagomir-30d組則有少量新骨形成，新生骨緊貼CPC支架材料，主要分布在支架材料的四周，呈花邊狀。見圖4。

圖4 植入4周組織形態(tài)圖

2.5 植入8周后組織學(xué)觀察 植入8周后，光學(xué)顯微鏡下觀察顯示（見圖5），空白對照組和NC組均有明顯新骨形成，而antagomir-30d組新骨形成大大增加，新生骨滲透整個(gè)CPC支架材料。

圖5 植入8周組織形態(tài)圖

2.6 組織形態(tài)學(xué)分析 支架材料復(fù)合物植入4周后，空白對照組和NC組均未見新骨形成，而antagomir-30d組新骨面積百分比為1.28%±0.19%。支架材料復(fù)合物植入8周后，空白對照組新骨面積百分比為2.33%±0.52%，NC組新骨面積百分比為1.82%±0.53%，而antagomir-30d組新骨面積百分比明顯高于空白對照組與NC組（P＜0.05），達(dá)到17.79%±1.15%。

2.7 植入2周后RT-PCR結(jié)果 體內(nèi)植入2周后，取出各組植入物，抽提總RNA進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，各成骨基因ALP、OC、RUNX2的mRNA水平表達(dá)量antagomir-30d組最高，明顯高于NC組及空白對照組（P＜0.05），見圖6。

圖6 植入2周后RT-PCR檢測各成骨基因的表達(dá)量

3 討論

目前，骨移植材料根據(jù)來源大致可分為四類：自體骨、異體骨、異種骨和人工骨。其中，自體骨移植會(huì)增加患者創(chuàng)傷，而且取骨量有限，移植手術(shù)所引起的不良反應(yīng)如疼痛、感染、出血等限制了它的應(yīng)用[4]；異體骨和異種骨均存在排異反應(yīng)，其中異種骨排異反應(yīng)更為劇烈，而異體骨還存在交叉感染問題。利用骨組織工程構(gòu)建形成的人工骨，可以按需塑形、批量生產(chǎn)，提供了修復(fù)大面積骨缺損的可能，目前已經(jīng)成為理想的創(chuàng)傷修復(fù)和功能重建的材料[5]。

近年來，利用骨組織工程技術(shù)治療種植體骨量不足、骨結(jié)合不良、骨缺損等已顯示出卓越的治療前景。具有再生能力的種子細(xì)胞、骨生長因子，以及人工合成的生物支架材料是骨組織工程的三大組成要素[6]。這三大要素可相互組合從而構(gòu)建組織工程骨：種子細(xì)胞/支架材料/生長因子；種子細(xì)胞/支架材料；生長因子/支架材料。

本研究所選用的CPC是一種新型人工骨支架材料，由于材料本身具備良好的生物活性與生物相容性，自1986年開始就受到了較多的關(guān)注[7-9]。細(xì)胞的黏附、增殖等過程與材料的物理結(jié)構(gòu)以及化學(xué)成分相關(guān)[10-11]。本研究中將細(xì)胞材料復(fù)合體于體外培養(yǎng)分別至1、3 d后，掃描電鏡觀察超微形態(tài)，結(jié)果顯示，BMSCs在CPC表面伸展良好，融合度高，CPC支架材料顯示了良好的細(xì)胞生物相容性，對細(xì)胞的黏附伸展無明顯不良反應(yīng)，可作為良好的細(xì)胞載體。

本研究將BMSCs制成細(xì)胞懸液（轉(zhuǎn)染有miRNA相關(guān)產(chǎn)品的細(xì)胞/未做轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞），并逐滴滴加到CPC支架材料的內(nèi)在孔隙中，直至CPC支架材料飽和而沒有含細(xì)胞的培養(yǎng)液溢出。待BMSCs在CPC支架材料上發(fā)生黏附之后，可以正常地進(jìn)行細(xì)胞遷移、增殖以及成骨活性的表達(dá)。將細(xì)胞/支架材料復(fù)合物盡快植入到動(dòng)物體內(nèi)，以保證充分的營養(yǎng)供應(yīng)，同時(shí)細(xì)胞代謝產(chǎn)物可以快速排出，最終誘導(dǎo)新骨形成并建立周圍細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)[12]。

異位成骨是指發(fā)生在皮下和肌肉內(nèi)等非骨組織內(nèi)的成骨現(xiàn)象。骨組織工程中運(yùn)用最早、最多的異位成骨動(dòng)物模型是裸鼠模型。裸鼠是一種免疫缺陷型動(dòng)物，因其不含胸腺，可以忽略細(xì)胞來源以及載體材料與宿主之間的免疫排斥反應(yīng)，常用于構(gòu)建組織工程化骨模型[13]。

復(fù)合物植入裸鼠體內(nèi)2周后，RT-PCR結(jié)果顯示antagomir-30d組ALP、OC及RUNX2成骨基因mRNA水平的相對表達(dá)量均顯著高于空白對照組及NC組，而空白對照組及NC組兩者之間并無明顯差異。這表明對BMSCs轉(zhuǎn)染無意義鏈不會(huì)造成在體內(nèi)細(xì)胞成骨分化活性及骨形成能力的改變；而當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-30d的拮抗劑antagomir-30d后，各成骨基因表達(dá)量的顯著上調(diào)意味著antagomir-30d在體內(nèi)可以促進(jìn)BMSCs的成骨分化，進(jìn)而促進(jìn)裸鼠皮下異位成骨，間接證明miR-30d的骨抑制作用。這與前期研究結(jié)果[14]以及本課題組體外實(shí)驗(yàn)[1]結(jié)果一致。

植入4周后取出植入體行硬組織切片及組織形態(tài)學(xué)觀察，組織學(xué)苦味酸品紅染色結(jié)果顯示空白對照組與NC組未見新骨形成，antagomir-30d組可見微量新骨形成，組織形態(tài)學(xué)計(jì)量新骨形成面積為1.28%±0.19%。之前有研究[15]顯示CPC與BMSCs（接種密度為2×107個(gè)/mL）聯(lián)合培養(yǎng)植入裸鼠皮下4周后，其組織學(xué)染色結(jié)果表明可有少量新骨形成，新骨面積百分比為9.10%±5.75%。本次空白對照組（未做轉(zhuǎn)染處理的BMSCs+CPC）未見新骨形成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道有些許差異，這可能與種子細(xì)胞的使用代數(shù)、生長狀態(tài)、初始接種密度、與CPC支架材料的黏附情況等有關(guān)。

8周植入體硬組織切片及組織形態(tài)學(xué)計(jì)量結(jié)果顯示空白對照組和NC組已有明顯新骨形成，而antagomir-30d組新骨形成與4周時(shí)相比大大增加，新生骨滲透整個(gè)CPC支架材料。空白對照組新骨面積百分比為2.33%±0.52%，NC組新骨面積百分比為1.82%±0.53%，二者無顯著性差異，而antagomir-30d組新骨面積百分比明顯高于空白對照組與NC組，達(dá)到17.79%±1.15%。有文獻(xiàn)報(bào)道相似的體內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn)[16]表明種子細(xì)胞初始接種濃度為5× 107個(gè)/mL時(shí)，8周組織學(xué)檢測BMSCs+CPC的實(shí)驗(yàn)組新骨形成明顯，新骨面積百分比較高，可達(dá)約17%。

綜上所述，本研究構(gòu)建的骨生長調(diào)控因子miRNA+種子細(xì)胞BMSCs+生物支架材料CPC的組織工程骨，應(yīng)用于裸鼠體內(nèi)異位成骨模型取得了較為理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在體內(nèi)初步驗(yàn)證了miR-30d對骨形成的負(fù)性調(diào)控作用。該動(dòng)物模型的建立將有利于增加對miRNA成骨調(diào)控機(jī)制的理解，并為miRNA的體內(nèi)應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。