生牛乳中芽孢桿菌的分離鑒定及其耐熱性

侯霞霞，王云霞，劉麗君，李翠枝，呂志勇

（內蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010110）

芽孢桿菌是一類在高溫、干燥、輻射或營養(yǎng)物質缺乏等特定條件下能形成內生孢子的細菌[1-2]，形成的芽孢具有極強的耐受性，這類菌廣泛存在于土壤、牛舍、飼草等奶牛生活環(huán)境中，而生牛乳因其豐富的營養(yǎng)條件，成為芽孢桿菌天然的培養(yǎng)基[3-4]。因此，生牛乳中經常會檢出部分芽孢桿菌，生乳經巴氏殺菌和超高溫瞬時滅菌（ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT）殺菌后會有少量芽孢殘留，后期在適宜的條件下會大量繁殖為營養(yǎng)體細胞，生乳中芽孢桿菌的多少、種類直接影響牛乳后期的質量[5-8]。同時，芽孢桿菌還可以產生脂肪酶和蛋白酶，能分解牛乳中的脂肪和蛋白質，造成牛乳結塊、產生苦味、脂肪上浮，使牛乳變質，嚴重影響產品品質和貨架期[9-12]。芽孢桿菌形成的芽孢體對于極端環(huán)境有極強的耐受性，乳制品生產過程中，經UHT后生乳中的芽孢不能被完全殺滅，尤其是需氧芽孢和嗜熱需氧芽孢殺滅率最差[13]。目前，需氧芽孢桿菌和嗜熱需氧芽孢桿菌的分離主要采用熱處理法[14]，由于芽孢桿菌在較高溫度處理時可以形成耐熱的芽孢，后通過適宜的條件使芽孢重新萌發(fā)，而其他細菌因不耐受高溫死亡，因此可以分離到芽孢桿菌。對于芽孢桿菌的鑒定方法目前有很多，如傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定[15]、生理生化鑒定[16-17]及基于核酸序列測定的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）方法[18-19]等，本研究旨在對生牛乳中的需氧芽孢桿菌和嗜熱需氧芽孢桿菌進行分離，通過采集并選擇含有芽孢桿菌的生牛乳樣品，參考NY/T 1331—2007《乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測定》[20]進行需氧芽孢桿菌和嗜熱需氧芽孢桿菌的分離，對分離的菌株通過形態(tài)學、生理生化和分子生物學多種手段進行鑒定，最終確定其種屬，同時研究嗜熱需氧芽孢桿菌的耐熱性，為生牛乳中芽孢桿菌的控制以及減少因芽孢桿菌引起的乳制品質量問題提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳樣品采集于北方及東北地區(qū)A、B、C 3 個牧場，共30 份樣品，每個牧場10 份樣品，每份采樣量≥1 000 g。

葡萄糖胰蛋白胨瓊脂（DTA培養(yǎng)基）、乳平板計數(shù)瓊脂（MPC培養(yǎng)基）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA培養(yǎng)基） 北京陸橋技術股份有限公司；革蘭氏染色液青島海博生物技術有限公司；BCL芽孢桿菌鑒定卡法國生物梅里埃公司；細菌基因組DNA小量提取試劑盒上海萊楓生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1389生物安全柜、渦旋振蕩器 美國Thermo Fisher Scientific公司；SPX-250II生化培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；GI54DWS高壓滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；DK-2000-IIIL電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器公司；H22-X3電陶爐 杭州九陽生活電器有限公司；VITEK2 COMPACT全自動微生物鑒定系統(tǒng)法國生物梅里埃公司；Axio Lab.A1生物顯微鏡 卡爾蔡司光學（中國）有限公司；G1000 PCR儀 杭州博日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌的分離

1.3.1.1 需氧芽孢菌株的分離

取裝有5 mL生牛乳樣品的試管，放入80 ℃水浴中，使試管內液面至少低于水面4 cm，加熱處理10 min。取對照管，加入與樣液等量的水并測定溫度。試管內樣液的升溫時間不應超過5 min。將加熱處理后樣液試管取出立即放到20 ℃以下的流水中冷卻。用1 mL無菌吸管吸取1 mL經加熱處理的樣液，于含有9 mL無菌磷酸鹽緩沖液稀釋液的試管中，振搖試管，混合均勻，獲得其10 倍稀釋液，根據(jù)對樣品中芽孢含量的估計，選擇2～3 個稀釋度，分別取1 mL樣品懸液以3∶3∶4（V/V）各加入3 塊提前配制好的MPC培養(yǎng)基平板，用L型涂布棒均勻涂布至表面干燥，倒置在培養(yǎng)箱中，于36 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)[20]。

1.3.1.2 嗜熱需氧芽孢菌株的分離

取裝有5 mL生牛乳樣品的試管，放入100 ℃沸水浴中，使試管內液面至少低于水面4 cm，加熱處理30 min。在對照管中加入與樣液等量的水并放1 支溫度計測定溫度。試管內樣液的升溫時間不應超過5 min。將加熱處理后樣液試管取出立即放到20 ℃以下的流水中冷卻。分別取1 mL冷卻后的生牛乳樣液以3∶3∶4（V/V）分別加入3 塊提前配制好的DTA培養(yǎng)基平板，用L型涂布棒均勻涂布至表面干燥，倒置在培養(yǎng)箱中，于55 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)[20]。

1.3.2 芽孢桿菌的純化

挑取MPC培養(yǎng)基上不同形態(tài)特征的菌落分別劃線于TSA平板，于36 ℃培養(yǎng)24 h。挑取DTA培養(yǎng)基上不同形態(tài)特征的菌落分別劃線于TSA平板，于55 ℃培養(yǎng)24 h?？色@得芽孢桿菌純菌株。

1.3.3 芽孢桿菌的鑒定

1.3.3.1 形態(tài)學鑒定

將純化后的需氧芽孢桿菌于TSA培養(yǎng)基劃線，36 ℃培養(yǎng)24 h，將純化后的嗜熱需氧芽孢桿菌于TSA培養(yǎng)基劃線，55 ℃培養(yǎng)24 h，觀察記錄菌落形態(tài)，取典型菌落涂片，并進行革蘭氏染色后通過光學顯微鏡進行菌體形態(tài)和芽孢位置觀察。

1.3.3.2 生理生化鑒定

挑取革蘭氏陽性、具芽孢的單一純菌落于0.45 g/100 mL NaCl溶液中制備菌懸液，調節(jié)麥氏濁度至1.8～2.1，通過全自動微生物鑒定系統(tǒng)利用BCL卡進行鑒定，15～18 h儀器自動給出鑒定結果。

1.3.3.3 16S rDNA序列分析

通過細菌基因組DNA小量提取試劑盒提取芽孢桿菌純菌株DNA，利用細菌通用引物進行PCR擴增，反應程序為：94 ℃預變性2 min；30 個循環(huán)：94 ℃變性30 s，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸1.5 min；72 ℃終延伸10 min后4 ℃保存。將擴增產物外送上海生物工程股份有限公司測序，將測得的16S rDNA序列結果利用在線分析網站NCBI或EzBioCloud進行比對分析，獲得與已知序列微生物的相似性，選取與鑒定序列相似度≥99%且相似度最高的種結果來確定芽孢桿菌的種屬信息。同時，構建系統(tǒng)進化樹，進化距離采用Kimura 2-parameter法計算，進化樹構建由MEGA7軟件完成[21-22]。

1.3.4 嗜熱需氧芽孢菌株的耐熱性實驗

準備同批次UHT乳，檢測無菌后備用，實驗同時設置空白對照。以5%的接種量接種1.3.1.2節(jié)中分離的芽孢菌液于100 mL無菌UHT乳，置于36 ℃培養(yǎng)箱保溫增菌。3 d后分別取牛乳培養(yǎng)物測定芽孢菌數(shù)，將達到105CFU/mL且牛乳組織狀態(tài)良好的樣品作為耐熱性實驗初始待測樣品。研究芽孢菌在不同溫度條件（80 ℃/10 min、90 ℃/10 min、100 ℃/10 min、100 ℃/30 min、115 ℃/20 min、121 ℃/20 min）下的耐受性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離和純化結果

本研究參考NY/T 1331—2007進行需氧芽孢菌株和嗜熱需氧芽孢菌株的分離和計數(shù)，為方便后續(xù)純化時挑取單菌落，用平板涂布法代替傾注法，30 份生牛乳樣品分別進行計數(shù)，然后從不同生牛乳樣品DTA和MPC計數(shù)平板上挑取菌落形態(tài)不同的菌株并純化獲得10 株芽孢桿菌，需氧芽孢桿菌分別編號為yb-1、yb-2、yb-3、yb-4、yb-5、yb-6、yb-7，嗜熱需氧芽孢桿菌分別編號為sr-1、sr-2、sr-3。

2.2 芽孢桿菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定結果

芽孢桿菌的形態(tài)特征包括菌體形態(tài)和菌落形態(tài)特征。在TSA平板上，分離菌株菌落較大，白色至淺棕色、多數(shù)不透明且表面有褶皺，部分邊緣不規(guī)則。挑取TSA平板上生長的單個純菌落進行革蘭氏染色鏡檢，分離菌株革蘭氏染色均為陽性、桿菌、單個或鏈狀，具中生或端生芽孢，大部分菌株孢囊不膨大，各菌株革蘭氏染色結果見圖1。從生物學特性來看，需氧芽孢桿菌和嗜熱需氧芽孢桿菌的菌落特征相似，菌落較普通細菌稍大，但生長溫度不同，需氧芽孢桿菌可在36 ℃生長，而嗜熱需氧芽孢桿菌在55 ℃才能較好生長。在不同細菌中，芽孢所處的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在頂端。芽孢一般呈圓形、橢圓形、圓柱形。在有些細菌中，芽孢的直徑小于菌體直徑。能否形成芽孢及芽孢的形狀、芽孢在孢囊的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鑒定細菌中芽孢桿菌的重要依據(jù)之一。分離菌株的具體形態(tài)特征見表1。

圖1 10 株芽孢桿菌革蘭氏染色照片（×1 000）Fig.1 Observation of 10 Bacillus strains based on Gram staining (× 1 000)

表1 芽孢桿菌菌體形態(tài)和菌落特征Table 1 Morphological characteristics of cells and colonies of Bacillus

2.2.2 生理生化和16S rDNA鑒定結果

由表2可知，生牛乳中的芽孢桿菌主要有蠟樣芽胞桿菌、地衣芽孢桿菌、明膠芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌和克勞氏芽孢桿菌，其相似度均達到90%以上。由于細菌的生理生化特征受培養(yǎng)物活性、傳代次數(shù)、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的影響常常具有可變性，因此，還需結合細菌的菌落形態(tài)和菌體形態(tài)以及分子生物學特性來綜合判斷其分類地位。16S rRNA在細菌的進化過程中高度保守，被稱為細菌的“分子化石”[23-24]。為更科學、精準地確定分離菌株的種屬地位，利用16S rDNA測序方法對分離到的10 株芽孢桿菌進行鑒定，將測序結果在GenBank進行比對，選取與待測菌株相似度較高的序列，采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，由圖2可知，16S rDNA鑒定結果與VITEK2鑒定結果一致。結合形態(tài)學、生理生化和分子生物學鑒定結果綜合得出，生牛乳樣品中分離到的10 株菌分別為蠟樣芽胞桿菌、地衣芽孢桿菌、明膠芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌和克勞氏芽孢桿菌，其中2 株地衣芽孢桿菌聚為一支，但稍有差異，后續(xù)可以通過全基因組測序對其進一步研究。

表2 10 株芽孢桿菌生理生化和16S rDNA鑒定結果Table 2 Results of identification of 10 strains of Bacillus based on physiological characteristics, biochemical characteristics and 16S rDNA gene sequence

圖2 分離菌株基于16S rDNA序列的進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of isolated strains based on 16S rDNA gene sequences

2.3 不同牧場生牛乳樣品芽孢桿菌檢出數(shù)量及種類

生牛乳樣品經80 ℃/10 min處理后，檢出的為需氧芽孢桿菌，經100 ℃/30 min處理后，檢出的為嗜熱需氧芽孢桿菌。由表3可知，A、B、C 3 個不同牧場均有需氧芽孢桿菌檢出，需氧芽孢桿菌檢出率較高，達到57%，嗜熱需氧芽孢桿菌僅有樣品5和樣品21有檢出，檢出率較低，僅6.7%。從檢出數(shù)量來看，需氧芽孢桿菌均未超過103CFU/mL，嗜熱需氧芽孢桿菌大部分＜10 CFU/mL；從檢出種類來看，3 個牧場需氧芽孢桿菌檢出次數(shù)排在前3 位的是枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌；從不同牧場來看，芽孢桿菌檢出率最高的是牧場C，其次為牧場A，檢出率最低的是牧場B，檢出芽孢桿菌種類最多的是牧場C，其次是牧場B，最少的是牧場A。

表3 不同牧場生牛乳芽孢桿菌檢出數(shù)量及種類Table 3 Quantity and species of Bacillus identified in raw milk from different pastures

2.4 嗜熱需氧芽孢桿菌耐熱性實驗結果

由表4可知，3 株嗜熱需氧芽孢桿菌在6 種不同的熱處理后，芽孢存活率有一定的差異。不同菌株在經過3 d增菌后，芽孢菌數(shù)均達到105CFU/mL。80 ℃/10 min處理后，殺死了營養(yǎng)細胞，剩余存活的均為芽孢，芽孢存活率為100%，由此可以推測，芽孢桿菌含量較高的生牛乳經巴氏殺菌后會殘留芽孢，從而影響牛乳貨架期。逐漸提高殺菌溫度后，芽孢存活率明顯下降，殺菌效率顯著提升。經過115 ℃/20 min處理后，芽孢存活率均小于1%，大部分芽孢被殺滅，僅凝結芽孢桿菌和克勞氏芽孢桿菌還有芽孢殘留。直到121 ℃/20 min處理后，芽孢被全部殺死，殺菌效率接近4 個數(shù)量級。

表4 嗜熱需氧芽孢桿菌耐熱性實驗結果Table 4 Heat tolerance of thermophilic aerobic Bacillus

3 討 論

絕大多數(shù)需氧芽孢桿菌和嗜熱需氧芽孢桿菌在普通的巴氏殺菌條件下不能被殺滅，而且生乳中耐熱芽孢數(shù)越多，成品中的芽孢殘留量也就越多，產品越容易變質[25-26]。高輝等[27]對石家莊市89 份乳品安全指標檢測結果進行分析表明，生牛乳的需氧芽孢桿菌和嗜熱需氧芽孢桿菌陽性率分別為83.33%、16.67%。想要控制生乳中耐熱芽孢，首先要對生乳中芽孢桿菌進行分離，進一步了解這些芽孢桿菌的生物學特性，如耐熱性、耐酸堿性、產酶特性等，本研究采集并選擇含有芽孢菌的生牛乳樣品開展研究，對生牛乳中耐熱芽孢桿菌進行分離，通過形態(tài)學、生理生化和分子生物學3 種方法進行鑒定，共分離出10 株芽孢桿菌，其中3 株為嗜熱需氧芽孢桿菌，分別為地衣芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌和克勞氏芽孢桿菌；另外7 株為需氧芽孢桿菌，分別為蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、明膠芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌，分離出的需氧芽孢桿菌較嗜熱需氧芽孢桿菌多，其中在分離需氧芽孢桿菌和嗜熱需氧芽孢桿菌時均分離到地衣芽孢桿菌，這些菌株多數(shù)為來源于土壤的微生物，經飼草或擠奶等環(huán)節(jié)進入生乳，而且據(jù)資料報道[28-29]，乳中最易污染的芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌及環(huán)狀芽孢桿菌等，在污染生牛乳的芽孢桿菌中，檢出率最高的是枯草芽孢桿菌，占30%，其余依次為蠟樣芽孢桿菌19%、短小芽孢桿菌11%、環(huán)狀芽孢桿菌8%、緩慢芽孢桿菌8%、栗褐芽孢桿菌3%。本研究分離到的菌株與文獻報道乳中易污染菌株總體來說是一致的，也分離到了嗜熱的凝結芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌和嗜中溫的明膠芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌，與文獻報道有一定差異，可能是奶牛養(yǎng)殖環(huán)境差異等原因造成。

從生牛乳中分離到的10 株芽孢桿菌中，選取嗜熱需氧芽孢桿菌進行耐熱性實驗，發(fā)現(xiàn)3 株嗜熱需氧芽孢桿菌在不同的熱處理條件下，芽孢存活率呈現(xiàn)隨溫度升高而逐漸遞減的趨勢，其中凝結芽孢桿菌和克勞氏芽孢桿菌較地衣芽孢桿菌耐熱性更強，經115 ℃/20 min處理后，仍有少量存活，而地衣芽孢桿菌已經被全部殺滅。經121 ℃/20 min處理后，所有芽孢均被殺滅，芽孢數(shù)量從初始的104CFU/mL下降到0，由此可以發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌對于濕熱滅菌具有較強的耐受性，乳品生產企業(yè)需要特別關注生乳中嗜熱需氧芽孢桿菌的污染情況，并關注可能造成污染的環(huán)節(jié)[30-31]，如飼草質量、奶牛飼喂環(huán)境、擠奶環(huán)節(jié)衛(wèi)生清潔狀況、生乳保存條件等，這些環(huán)節(jié)均會引入芽孢桿菌，嚴重影響生乳質量。國家也應當盡快推動乳品中需氧芽孢桿菌和嗜熱需氧芽孢桿菌相關限量標準的設立，以進一步保證食品安全。

4 結 論

本研究以生牛乳為研究對象，分析30 份生牛乳樣品中的芽孢桿菌種類，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢菌為枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、明膠芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌和克勞氏芽孢桿菌；耐熱性實驗表明，生牛乳中耐熱性較強的芽孢桿菌有凝結芽孢桿菌和克勞氏芽孢桿菌，最高能耐受115 ℃/15 min熱處理。本研究結果可為生牛乳中芽孢桿菌的控制以及減少因芽孢桿菌引起的乳制品質量問題提供重要的參考依據(jù)。