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    重組酵母乙肝疫苗體外效力測定方法

    2013-11-21 06:23:48康曉冬馬小明
    中國畜牧獸醫(yī)文摘 2013年4期
    關(guān)鍵詞:包被稀釋液效力

    康曉冬 馬小明

    (寧夏農(nóng)林科學(xué)院草畜工程技術(shù)研究中心,寧夏銀川 750002)

    1 材料和方法

    1.1 試劑

    1.1.1 2 mol/L磷酸鹽緩沖液 (含0.15 mol/L氯化鈉,pH7.2)稱取氯化鈉8.850 g,二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)0.226 g和十二水磷酸氫二鈉(NaH2PO4·12H2O)1.698 g溶于適量水中,調(diào)pH至7.2,加水至1 000 ml。

    1.1.2 供試品處理液 量取20%二乙醇胺0.25 ml和10% Triton X-100 0.20ml,加pH7.2PBS至10 ml。

    1.1.3 20%二乙醇胺儲備液 量取二乙醇胺DEA(在室溫下該品可能會邊厚或者結(jié)晶使用前可加熱到30℃以液化)2 ml。加pH7.2PBS至10 ml。置于棕色瓶中室溫保存,室溫暗處可保存4個月。供試品稀釋液取牛血清白蛋白10.0 g,加磷酸鹽緩沖液使溶解成1 000 ml,即得。

    1.1.4 10% Triton X-100儲備液 量取1ml10% Triton X-100加PH7.2PBS至10 ml。室溫可保存4個月。如果該溶混濁請勿使用。

    1.1.5 1%硫柳汞溶液 稱取硫柳汞1g,加pH7.2PBS至100ml,溶解即。

    1.1.6 樣品稀釋液 1%BSA,0.01%硫柳汞溶液,用PBS溶解。

    1L的配制方法:取BSA10.0 g置于燒杯中,加pH7.2PBS溶液,約800 ml。磁力攪拌溶解。加1%硫柳汞溶液10.0 ml,再用pH7.2PBS溶解定容至1 000 ml。分裝成合適的體積于2℃~8℃暗處保存,有效期1個月。

    1.1.7 參考品溶液及供試品溶液的配制 分別精密量取參考品及供試品0.1 ml,加入0.1 ml 供試品處理液,加蓋混勻,在20℃~28℃靜置30~35 min。將處理后的參考品和供試品以供試品稀釋液進行適當稀釋,稀釋后取1:2 000、1:4 000、1:8 000、1:16 000、1:32 000倍及其他適宜稀釋度的參考品和供試品,每個稀釋度作雙份測定。陰性對照為供試品稀釋液(雙份),陰性和陽性對照不需稀釋。

    1.2 實驗方法

    采用單克隆抗─HBS包被反應(yīng)板,加入待測標本,同時,加入多克隆抗-HBS-HRP,當標記中存在HBSAg時,該HBSAg與包被抗-HBS結(jié)合并與抗-HBS-HRP結(jié)合形成抗-HBS-HBSAg-HRP復(fù)合物,加入TMB產(chǎn)生顯色底物,反之,則無顯色底物生成。該檢測與標準品做對比,定量檢測HBSAg 鋁佐劑疫苗的量,在進行檢測前將疫苗樣品和標準品與二乙醇胺和Triton X―100溶液孵育,目的以減少抗原聚集和提高“AUSIY ME”ELISA法檢測樣品的可行性。通過對樣品和標準品的吸光值的分析,可檢測樣品的相對效力值。

    1.3 實驗儀器

    酶標儀(SUNRISE 雙波長)

    2 檢測程序

    2.1 樣品處理試劑盒要放培養(yǎng)箱(37℃)前0.5h(三批樣品)。

    2.2 所有樣品均應(yīng)在2℃~8℃保存。處理前將參考品溶液和樣品溶液在旋渦混合器混合10s左右。

    2.3 用前搖動處理液的瓶子以混合均勻。

    2.4 分別吸取0.1 ml參考品和樣品加到EP管中,然后每管加0.1 ml處理液。加蓋,旋渦混合10s,20℃~28℃靜置30~35min。

    2.5 樣品稀釋

    將處理過后的參考品和供試品分別以樣品稀釋液進行稀釋,如下表1:

    表1

    2.6 測定順序

    (1)每孔加待測標本50微升,設(shè)印行對照,陽性對照各2孔,每孔加入陰性對照(或陽性對照)各2滴,設(shè)空白對照2孔。

    (2)每孔加入酶結(jié)合物1滴(空白對照除外),充分混勻,封板,置37℃孵育30 min。

    (3)手工洗板:棄去孔內(nèi)液體,洗滌液注滿各孔。靜置58s,甩干,重復(fù)5次拍干。

    (4)每孔加入顯色劑A液、B液各一滴,充分混勻,封板,置37℃孵育15 min。

    (5)每孔加入終止液各1滴,混勻。

    (6)用酶標儀讀數(shù),取波長450 nm,630 nm,先用空白孔較零,然后讀取各孔OD值。

    2.7 結(jié)果計算

    (1)計算陰性對照的平均吸光值(NCX),必須落在-0.06~0.1范圍內(nèi)。如果某個數(shù)值落在這個范圍之外,則將這個數(shù)值重新計算平均值;如果兩個數(shù)值落在此范圍之外,則應(yīng)作檢測;如果更多的數(shù)值落在范圍之外,則應(yīng)對其中的技術(shù)問題進行修正。

    (2)計算陽性對照平均吸光值排除PCX。

    (3)計算陽性對照-陰性對照(PCX -NCX),PCX -NCX應(yīng)≥0.400值。否則應(yīng)檢查技術(shù)問題或試劑是否變質(zhì),重新進行試驗。

    (4)每個稀釋液對照稀釋度應(yīng)當在0~0.02范圍內(nèi)。

    2.8 相對效力計算

    2.8.1 列出每次測得的參考品和待檢樣品的每個稀釋度比例的所有吸光值。

    2.8.2 從3個檢測數(shù)據(jù)中,用平行線性回歸分析法計算每次的相對效力。

    2.8.3 三次相對效力的幾何平均值即為其體外效力。

    2.9 檢測結(jié)果

    以凍干品為標準品,三次相對效力幾何平均值應(yīng)≥0.5。結(jié)果判為合格。

    3 討論

    由于疫苗制品的檢定一般多采用生物學(xué)方法測定,因此在檢定中就難免出現(xiàn)檢定結(jié)果準確性不佳,究其原因不外乎有實驗動物的個體差異性,所用試劑和原材料的純度或敏感性不一致等。因此必須對現(xiàn)有檢定方法進行標準化和可信性研究。同時必須采用新技術(shù),建立新的準確簡便的檢定方法,提高疫苗制品的檢定工作質(zhì)量。而質(zhì)量檢定人員也應(yīng)本著對人民極端負責(zé)的精神,嚴格按照《生物制品規(guī)程》要求,對制品進行科學(xué)檢定。此外還應(yīng)意識到,疫苗制品的質(zhì)量是生產(chǎn)出來的,檢定只是客觀反映制品的質(zhì)量問題,從而促進質(zhì)量的提高,而只有對生產(chǎn)過程實施全面的質(zhì)量管理才能全面有效地保證疫苗的質(zhì)量水品,生產(chǎn)好的疫苗制品,造福人類。因此在重組(酵母)乙肝疫苗體外效力的檢測中一定要認真負責(zé),同時也應(yīng)該注意以下幾點問題:

    (1)待檢測樣品溶液中不應(yīng)存在與標記酶相同的酶、底物、酶抑制劑和其他干擾因素,以防止干擾作用。

    (2)吸附的效果與包被緩沖液的濃度、pH、溫育時間有關(guān),還與載體表面積性質(zhì)有關(guān)。包被蛋白質(zhì)時緩沖液宜偏堿性,離子強度較低,這有利于蛋白質(zhì)的吸附,包被緩沖液(pH<6=時非特異性吸附增加,實驗中包被時常采用50mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液,聚苯乙烯塑料表面能吸附轉(zhuǎn)移多的蛋白質(zhì),常用濃度1~10μg/ml的免疫球蛋白。濃度過高,蛋白質(zhì)間的相互作用防礙了蛋白質(zhì)與聚苯乙烯載體的吸附,不僅浪費試劑,還會降低檢測的靈敏度。包被物質(zhì)必須是可容的,最適濃度可通過棋盤滴定法加以確定。

    (3)聚苯乙烯酶標記板測定時,溶液宜垂直滴入凹孔中間,相繼加入的溶液都覆蓋相同的載體表面積。在吸附溫育和洗滌等操作中應(yīng)避免劇烈振蕩,攪拌等,以保證恒定的吸附容量。在洗滌操作中,由于聚苯乙烯反應(yīng)板凹孔容量小,孔間距離近,故洗滌時要注意每次加入的洗滌液量既要達到洗滌充分又要避免相鄰孔內(nèi)液體互相污染。

    (4)在ELISA中血清陰性對照的顯色反應(yīng)常常是酶結(jié)合物與固相之間的非特異性吸附所致。在酶結(jié)合物稀釋時加去污劑(TWEEN)或BSA。

    重組(酵母)乙肝疫苗體外效力的測定對評價疫苗的價值具有十分重要的意義。

    [1]郝福英.生命科學(xué)實驗技術(shù)[M].北京:北京大學(xué)出版社,2004.

    [2]張龍翔,張庭芳,李令媛.生化實驗方法和技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,1982.

    [3]焦奎,張書圣.酶聯(lián)免疫分析技術(shù)及應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004.

    [4]林清華.免疫學(xué)實驗[M].武漢:武漢大學(xué)出版社,1999.

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