表達促凋亡蛋白Bid 的重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建及其對巨噬細胞凋亡的影響

逄亞寧，楊國平，孟 余，吳利先，李光華

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室，云南 大理 671000）

人類結(jié)核病是一種致病菌為結(jié)核分枝桿菌，且具有極高的感染率與致死率的傳染病。結(jié)核病素有“白色瘟疫”及“頭號殺手”之稱，已成為全球范圍內(nèi)備受關(guān)注的影響人類生活質(zhì)量的公共衛(wèi)生問題[1，2]。隨著耐藥株的廣泛流行及人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）雙感現(xiàn)狀使得結(jié)核病的疫情變得更加嚴(yán)峻[3，4]。特別地，隨著近年來新型冠狀病毒的爆發(fā)，使得原本嚴(yán)峻的疫情面臨著更大挑戰(zhàn)，面對日趨緊迫的結(jié)核病疫情現(xiàn)狀，接種疫苗是一種行之有效的控制方式[5]。卡介苗是目前臨床上唯一用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗，可有效降低兒童結(jié)核性腦膜炎及粟粒性結(jié)核病的感染，但對成人的保護效果并不理想也并不穩(wěn)定[6]。因此，研制一種免疫效果更加理想的結(jié)核病疫苗已成為當(dāng)務(wù)之急。巨噬細胞是結(jié)核分枝桿菌的主要宿主細胞，也是機體抵御該病原菌的重要免疫細胞。凋亡是巨噬細胞清除吞噬的結(jié)核分枝桿菌的關(guān)鍵免疫機制之一，因此可通過巨噬細胞凋亡入手，研制一種更加具有保護效力的疫苗用于結(jié)核病的防控[7，8]。線粒體凋亡是真核細胞主要的內(nèi)源性凋亡途徑，Bcl-2 蛋白家族是線粒體凋亡通路的主要調(diào)控因子，Bid 蛋白是Bcl-2蛋白家族中重要的一員，不僅可以結(jié)合抗凋亡蛋白抑制其抗凋亡作用，也可以與促凋亡蛋白結(jié)合激活其促凋亡作用[9]?；诖?，本實驗將結(jié)核分枝桿菌分泌型蛋白Ag85b 中行使分泌作用的ASP 信號肽基因與促凋亡蛋白Bid 基因相連接，克隆入穿梭質(zhì)粒pMV261 中。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入恥垢分枝桿菌，構(gòu)建一株可分泌促凋亡蛋白Bid 的重組恥垢分枝桿菌。由于恥垢分枝桿菌是一種較結(jié)核分枝桿菌生長快且無致病性的分枝桿菌，同時與結(jié)核分枝桿菌具有高度的基因同源性和相似結(jié)構(gòu)，可表達更多的外源蛋白，因此是一種極具前景意義的結(jié)核病疫苗載體。

1 材料與方法

1.1 資料來源 檢索美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），獲得小鼠Bid 蛋白的氨基酸序列。通過ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）和ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）在線軟件預(yù)測Bid 蛋白的理化性質(zhì)；運用TMHMM-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）與SignalP-4.1（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?Sig nalP-4.1）分析Bid 蛋白的分泌屬性；使用SOPMA（https://npsa -prabi.ibcp.fr/cgi -bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）生信工具分別預(yù)測Bid 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)；采用NCBI 的CD-Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）工具分析蛋白質(zhì)Bid 的保守結(jié)構(gòu)域；應(yīng)用STRING（https://www.string-db.org/）預(yù)測小鼠Bid 蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)；經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得人類蛋白Bid 的氨基酸序列，并利用NCBI 的Blastp（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）預(yù)測其與小鼠Bid 蛋白的同源性。

1.2 實驗質(zhì)粒、菌株、細胞與動物 大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pMV261-10His、結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv 基因組、恥垢分枝桿菌Mycolicibacterium Smegmatis mc2155 菌株、大腸桿菌DH5α 菌株、RAW264.7 小鼠巨噬細胞均由大理大學(xué)實驗室保存。BALB/c 6～8 周齡雌性小鼠，清潔級別為SPF 級，由大理大學(xué)實驗動物中心提供。

1.3 試劑盒與培養(yǎng)基 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自全式金生物技術(shù)有限公司，普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司，ECL 發(fā)光試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，Middlebrook 7H9 Broth 培養(yǎng)基、Middlebrook 7H10 Agar 培養(yǎng)基購自BD 公司。

1.4 小鼠cDNA 的獲取 頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下解剖小鼠分離獲得脾臟組織，經(jīng)淋巴細胞分離液做密度梯度離心，使不同比重的細胞按不同的密度梯度離心，得到淋巴細胞。后采用Trizol 法從淋巴細胞提取小鼠RNA，最后通過ONE-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix 試劑盒以RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.5 pMV261-ASP（BamHI）-10His、pMV261-ASP（BamHI）-Bid-10His、pMV261-ASP（EcoRI）-10His、pMV261-ASP（EcoRI）-Bid-10His 重組質(zhì)粒的構(gòu)建以表1 中所列各組基因的上下游引物及酶切位點擴增目的片段，采用無縫克隆技術(shù)及傳統(tǒng)酶切酶連技術(shù)，將目的基因片段克隆入pMV261-10His 質(zhì)粒。并將構(gòu)建的各組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，以pMV261 通用引物P11 與P12 做PCR 擴增及測序共驗證重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。

表1 引物序列

1.6 恥垢分枝桿菌感受態(tài)的制備 挑取新鮮的恥垢分枝桿菌mc2155 單菌落接種于5 ml 的7H9 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600 為0.5～1.0，1～2 d 左右），以1:100 的比例接種于100 ml 7H9 培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 過夜培養(yǎng)至OD600 為0.6 左右。取出菌液冰上放置30 min～1 h，后于4 ℃，5000 r/min 條件下離心10 min，吸除上清液，收集菌體。并將菌體用預(yù)先冰浴的10%無菌甘油洗滌3 次，最后加入10 ml 預(yù)冷的10%的甘油，吹打混勻菌體后，每管200 μl 分裝至高壓滅菌的1.5 ml 干凈離心管內(nèi)，-80 ℃保存。

1.7 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌 抽提經(jīng)測序正確構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒：pMV261-ASP（BamHI）-10His、pMV261-ASP（BamHI）-Bid-10His、pMV261-ASP（EcoRI）-10His、pMV261-ASP（EcoRI）-Bid-10His，使用2 mm 的電轉(zhuǎn)杯，以電壓2.5 kV、電阻1000 Ω、電容25 μF 設(shè)置電擊參數(shù)，分別電轉(zhuǎn)導(dǎo)入恥垢分枝桿菌mc2155 感受態(tài)中。將幾組電轉(zhuǎn)完的恥垢分枝桿菌分別均勻涂布于含有終濃度為20 μg/ml 卡那霉素的7H10 固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)3～5 d。

1.8 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)成功的恥垢分枝桿菌的篩選與鑒定 挑取培養(yǎng)基平板上長出的單菌落，接種于含20 μg/ml卡那霉素的7H9 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 震蕩培養(yǎng)2～3 d。收集菌體煮沸裂解，以裂解液為模板，使用pMV261 通用引物P11、P12，進行PCR 驗證每組質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌中，并以P11 與P13 為測序引物送測序進一步驗證。

1.9 細胞質(zhì)與培養(yǎng)基蛋白樣本的收集 將構(gòu)建成功的幾組重組恥垢分枝桿菌分別接種于含有20 μg/ml卡那霉素的50 ml7H9 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600 為0.6～0.8。各組取50 ml 菌液4000 r/min 離心15 min，使培養(yǎng)基與菌體分離。將培養(yǎng)基上清移入另一離心管，于冰上放置。加入30 ml無菌PBS 溶液重懸菌體，低溫超聲破碎方法破碎菌體，破5 s，停10 s，超聲30 min，10000 r/min 離心15 min，吸取上清即細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至另一無菌的離心管中，于冰上放置。將得到的培養(yǎng)基、細胞質(zhì)樣本分別加入蛋白酶抑制劑，使用0.22 μm 規(guī)格細菌濾器過濾，后經(jīng)10 kd 規(guī)格的超濾管進行濃縮。

1.10 BCA 蛋白定量法及免疫印跡實驗檢測蛋白表達情況 按照15%的分離膠與5%的濃縮膠制膠，BCA 蛋白定量使每個上樣孔確定5 μg 的上樣量，樣本先在濃縮膠中80 V 恒壓電泳30 min，后改為120 V 電泳至溴酚藍到達分離膠底部，停止電泳。恒流250 mA，30 min 轉(zhuǎn)膜。將PVDF 膜用TBST 配制的5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。5%脫脂奶粉1∶1500比例稀釋抗His 標(biāo)簽的一抗，4 ℃孵育過夜。次日將膜用TBST 洗滌4 次，10 min/次。加入以1∶5000 比例稀釋的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗滌4次，10 min/次。后放入發(fā)光成像儀顯影并分析。

1.11 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染法流式細胞術(shù)檢測Bid 重組恥垢分枝桿菌對RAW264.7 小鼠巨噬細胞凋亡的影響 將收集的RAW264.7 小鼠巨噬細胞吹打重懸，調(diào)節(jié)細胞密度至1.5×106個/ml，以1 μg/ml終濃度加入LPS 刺激細胞，將細胞懸液以每個板子2 ml 的量（即3×106個細胞）均勻分至六孔板中，吹打混勻放至37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h 后更換無抗生素的DMEM 完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS），37 ℃培養(yǎng)24 h。收集各組菌樣（Mycolicibacterium Smegmatis mc2155 菌株、含有pMV261-10His 質(zhì)粒的Mycolicibacterium Smegmatis mc2155 菌株、含有pMV261-ASP（BamHI）-Bid-10His 質(zhì)粒的Mycolicibacterium Smegmatis mc2155 菌株），以MOI=10 加入各組菌樣分別感染細胞2 h 后，PBS 清洗細胞3次，換上含濃度為50 μg/ml 慶大霉素的DMEM 完全培養(yǎng)基，37 ℃分別繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h。PBS涮洗一遍細胞，加入1 ml 胰酶，37 ℃消化1 min，再加入3 ml DMEM 完全培養(yǎng)基終止胰酶消化。將細胞吹起重懸至15 ml 離心管中，500 G 離心5 min，吸取1 ml預(yù)冷至4 ℃的PBS 重懸細胞沉淀并轉(zhuǎn)移至EP 管中，300 G 離心3 min，再用PBS 重懸，300 G 離心3 min。吸掉PBS 上清，用100 μl 1×binding buffer 重懸細胞轉(zhuǎn)移至流式細胞管中，并做25 倍稀釋。添加染料在室溫避光孵育10 min 后上機。

2 結(jié)果

2.1 小鼠Bid 蛋白質(zhì)理化性質(zhì) ProtParam 生信軟件在線預(yù)測小鼠 Bid 蛋白質(zhì)分子式為C948H1510N272O307S10，總原子數(shù)是3047，相對分子質(zhì)量是21 950.66，等電點是4.80。共含有20 種氨基酸，其中亮氨酸所占比例最高，為11.3%，色氨酸含量最低，為0.5%。帶正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)是18，帶負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）總數(shù)為31，不穩(wěn)定系數(shù)為57.34，屬于不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。在280 nm波長處，假如所有半胱氨酸殘基成對形成胱氨酸，則其消光系數(shù)為8605，吸光度為0.392；如若所有半胱氨酸消失，則其消光系數(shù)為8480，吸光度為0.386。Bid 半衰期是30 h，脂肪系數(shù)是86.05，總平均親水性是-0.419。通過ProtScale 進一步分析小鼠Bid 蛋白質(zhì)親水性，親水性氨基酸數(shù)量多于疏水性氨基酸，提示小鼠Bid 蛋白為親水性蛋白質(zhì)。

2.2 小鼠Bid 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域與信號肽 經(jīng)TMHMM -2.0 工具分析小鼠Bid 蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1）。運用SignalP-4.1 預(yù)測軟件分析小鼠Bid 蛋白不含有信號肽結(jié)構(gòu)（圖2），綜合分析小鼠Bid 蛋白不屬于分泌性蛋白質(zhì)。

圖1 小鼠Bid 蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域預(yù)測

圖2 小鼠Bid 蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測

2.3 小鼠Bid 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu) SOPMA預(yù)測小鼠Bid 蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋（Hh）、無規(guī)則卷曲（Cc）、β-折疊（Ee）、β-轉(zhuǎn)角（Tt）所占比例依次為65.13%、27.69%、4.10%、3.08%。SWISSMODEL 對小鼠Bid 蛋白進行同源建模并對其三級結(jié)構(gòu)加以預(yù)測，見圖3。

圖3 小鼠Bid 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4 小鼠Bid 蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域 利用NCBI 的CDSearch 工具預(yù)測到小鼠Bid 基因轉(zhuǎn)錄翻譯的第3～192 個氨基酸區(qū)域?qū)儆贐id 超家族，含有BH3 死亡結(jié)構(gòu)域，該蛋白家族是程序性細胞死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子。

2.5 小鼠Bid 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用STRING 軟件預(yù)測小鼠Bid 蛋白可與Caspase8、Bcl2l1、Bax、Mcl-1、Bak1、Bcl2a1a、Bcl-2、Granzyme B、Caspase2、Capn2 蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。

2.6 小鼠Bid 蛋白質(zhì)與人類Bid 蛋白質(zhì)同源性 采用美國國家生物信息中心的Blastp 工具預(yù)測得到小鼠Bid 蛋白質(zhì)與人類蛋白質(zhì)相似性為64%。

2.7 PCR 擴增ASP 與Bid 基因片段結(jié)果 以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv 基因組為模板擴增的pMV261-ASP（BamHI）-10His 質(zhì)粒中的ASP 片段應(yīng)為154bp，pMV261-ASP（EcoRI）-10His 質(zhì)粒中的ASP 片段為140 bp，pMV261-ASP（BamHI）-10His中間載體質(zhì)粒中ASP 片段為154 bp。以小鼠cDNA為模板擴增的pMV261-ASP（BamHI）-Bid-10His 質(zhì)粒中的Bid 片段為619 bp，pMV261-ASP（EcoRI）-Bid-10His 質(zhì)粒中的Bid 片段為619 bp。PCR 擴增后電泳結(jié)果見圖4，顯示各基因片段均擴增成功。

圖4 PCR 擴增ASP 與Bid 基因

2.8 重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果 從大腸桿菌抽提pMV261-ASP（BamHI）-10His 中間載體質(zhì)粒，大小為4632 bp，電泳結(jié)果見圖5。抽提的pMV261-ASP（BamHI）-10His 質(zhì)粒、pMV261-ASP（EcoRI）-10His 質(zhì)粒、pMV261-ASP（BamHI）-Bid-10His 質(zhì)粒、pMV261-ASP（EcoRI）-Bid-10His 質(zhì)粒大小依次為4626 bp、4641 bp、5217 bp、5232 bp，電泳結(jié)果見圖6。電泳結(jié)果顯示質(zhì)粒大小均在相應(yīng)條帶處且均為超螺旋結(jié)構(gòu)，各組質(zhì)粒經(jīng)進一步測序驗證結(jié)果均無誤，即重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖5 抽提pMV261-ASP（BamHI）-10His中間載體質(zhì)粒（4632bp）電泳

圖6 大腸桿菌抽提構(gòu)建成功質(zhì)粒的電泳

2.9 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)恥垢分枝桿菌PCR 驗證結(jié)果 以各組菌株裂解液為模板，以pMV261 質(zhì)粒上的通用引物P11 與P12，作相應(yīng)片段的PCR 擴增及電泳，初步驗證重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)結(jié)果。pMV261-ASP（EcoRI）-10His、pMV261-ASP（BamHI）-10His、pMV261-ASP（BamHI）-Bid-10His、pMV261-ASP（EcoRI）-Bid-10His 組擴增片段大小分別應(yīng)為607 bp、592 bp、1183 bp、1198 bp。電泳結(jié)果顯示各組質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)入Mycobacterium smegmatis mc2155 菌株中，后經(jīng)測序進一步驗證也均無誤，即各組質(zhì)粒均完整的導(dǎo)入了恥垢分枝桿菌，見圖7。

圖7 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)恥垢分枝桿菌PCR 驗證

2.10 目標(biāo)蛋白在培養(yǎng)基與細胞質(zhì)中表達情況 免疫印跡實驗結(jié)果見圖8 與圖9，只有在導(dǎo)入Bid 基因的重組恥垢分枝桿菌的細胞質(zhì)與培養(yǎng)基中有目標(biāo)蛋白的表達，且結(jié)果顯示信號肽ASP 成功將Bid 轉(zhuǎn)移至菌體外，即成功構(gòu)建可分泌促凋亡蛋白Bid 的重組恥垢分枝桿菌。

圖8 Bid 重組恥垢分枝桿菌細胞質(zhì)中目標(biāo)蛋白表達圖

圖9 Bid 重組恥垢分枝桿菌培養(yǎng)基中目標(biāo)蛋白表達圖

2.11 Annexin Ⅴ-FITC/PI 流式細胞術(shù)檢測Bid 重組恥垢分枝桿菌對小鼠巨噬細胞RAW264.7 凋亡的影響結(jié)果 在菌株刺激細胞后培養(yǎng)的12、24、48、72 h檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示導(dǎo)入Bid 的重組恥垢分枝桿菌組較親代恥垢分枝桿菌組及含有pMV261-10His 的恥垢分枝桿菌組誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生凋亡的比例均增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），即Bid 重組恥垢分枝桿菌可促進細胞凋亡發(fā)生，見表2、圖10。

圖10 菌株刺激RAW264.7 細胞培養(yǎng)凋亡結(jié)果圖

圖10 菌株刺激RAW264.7 細胞培養(yǎng)凋亡結(jié)果圖（續(xù)）

表2 菌株刺激RAW264.7 細胞凋亡率（%）

3 討論

生物信息技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，本研究擬利用生物信息相關(guān)軟件初步預(yù)估小鼠促凋亡蛋白質(zhì)Bid 是否可作為研究的目標(biāo)蛋白，結(jié)果提示小鼠Bid 蛋白質(zhì)不具有跨膜結(jié)構(gòu)域與信號肽結(jié)構(gòu)，屬于非分泌型蛋白質(zhì)，因此可以與信號肽ASP相連接，克隆入大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pMV261 中，構(gòu)建分泌型重組質(zhì)粒。另外，小鼠Bid 蛋白具有BH3 死亡結(jié)構(gòu)域，這一點與其它文獻報道相一致。BH3 結(jié)構(gòu)域可通過介導(dǎo)蛋白間的相互作用，誘導(dǎo)細胞凋亡[9]。同時本研究預(yù)測到小鼠Bid 蛋白質(zhì)可與 Caspase8、Bcl2l1、Bax、Mcl -1、Bak1、Bcl2a1a、Bcl-2、Granzyme B、Caspase2、Capn2 凋亡相關(guān)蛋白發(fā)生相互作用，形成相互作用網(wǎng)絡(luò)。Caspase8、Caspase2 屬于半胱氨酸蛋白酶，是一類在細胞凋亡信號傳導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)中起協(xié)同作用的蛋白[10]。Bcl2l1、Mcl-1、Bcl2a1a、Bcl-2 屬于Bcl-2 蛋白家族中抑制細胞凋亡的蛋白質(zhì)，Bax 屬于該家族里發(fā)揮促凋亡作用的一種蛋白質(zhì)[11-13]。有研究發(fā)現(xiàn)Granzyme B通過切割Bid 或半胱氨酸蛋白酶中執(zhí)行細胞凋亡的蛋白質(zhì)可調(diào)節(jié)細胞凋亡[14]。Capn2 與鈣離子有關(guān)，可通過調(diào)節(jié)線粒體所處的鈣離子環(huán)境或者誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等途徑對細胞凋亡產(chǎn)生影響[15，16]。Bid 蛋白可通過多種機制與以上凋亡調(diào)節(jié)蛋白發(fā)生相互作用，參與細胞凋亡的調(diào)控。本研究還發(fā)現(xiàn)，小鼠Bid 蛋白質(zhì)與人類Bid 蛋白質(zhì)具有高度相似性，故可通過小鼠Bid 蛋白的相關(guān)性質(zhì)分析人類Bid 蛋白質(zhì)性質(zhì)。

本研究顯示，在免疫印跡實驗中，只有導(dǎo)入外源基因Bid 的重組恥垢分枝桿菌的細胞質(zhì)與培養(yǎng)基中檢測到目標(biāo)蛋白的表達，且表達結(jié)果證實信號肽成功將Bid 蛋白分泌至菌體外，即成功構(gòu)建了可以分泌促凋亡蛋白Bid 的重組恥垢分枝桿菌。在流式細胞術(shù)檢測Bid 重組恥垢分枝桿菌對小鼠巨噬細胞的凋亡影響中，發(fā)現(xiàn)在檢測的4 個時間點（12、24、48、72 h），Bid 重組恥垢分枝桿菌較親代恥垢分枝桿菌及導(dǎo)入pMV261-10His 質(zhì)粒的恥垢分枝桿菌均促進了巨噬細胞的凋亡，因此構(gòu)建的Bid 重組恥垢分枝桿菌具有作為預(yù)防結(jié)核病疫苗的潛力。

下一步計劃將Bid 重組恥垢分枝桿菌注入小鼠體內(nèi)，檢測其對小鼠體內(nèi)巨噬細胞凋亡的影響。結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)感染菌,以細胞免疫為主。吞噬菌體的巨噬細胞凋亡，可促進周圍巨噬細胞等抗原提呈細胞的提呈抗原能力[17]。CD4+Th1 型細胞被認(rèn)為在機體抗結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，IFN-γ、IL-2 是其分泌的重要抗結(jié)核分枝桿菌的相關(guān)細胞因子[18，19]。CD8+T 細胞通過分泌穿孔素、顆粒酶、顆粒溶素等活性因子裂解靶細胞或者直接殺死病原菌，還能誘導(dǎo)吞噬菌體的靶細胞凋亡，也能分泌IFN-γ 增強巨噬細胞的抗菌能力等[20]。通過對以上相關(guān)免疫指標(biāo)的檢測可進一步評估其作為結(jié)核病疫苗的價值。

綜上所述，表達外源基因Bid 的重組恥垢分枝桿菌可以促進巨噬細胞凋亡發(fā)生，這可為新型結(jié)核病預(yù)防疫苗的研發(fā)提供新的思路與技術(shù)。