尼古丁影響糖尿病心肌病進(jìn)展的機(jī)制研究

趙 靜，郭 蕊，孟芝君，劉彩紅，謝耀麗，劉 晶，曹濟(jì)民，王亞靜

（1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院/山西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山西 太原 030001；3.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，山西 太原 030001）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病患者的主要并發(fā)癥之一，是由糖代謝紊亂引起以心臟結(jié)構(gòu)和功能障礙為主要病理改變的一種特異性心肌病變[1]，早期表現(xiàn)為左心室僵硬，舒張功能和順應(yīng)性降低。隨著時(shí)間延長(zhǎng)及病變加重，患者逐漸出現(xiàn)心臟收縮功能受損，及其引起的呼吸困難等癥狀，最終發(fā)展為充血性心力衰竭。糖尿病患者數(shù)量的逐年增加導(dǎo)致DCM 的發(fā)病率和病死率持續(xù)攀升[2]。但是，目前DCM 誘發(fā)心臟重構(gòu)和功能障礙的機(jī)制尚不清楚。吸煙是心血管疾病和2 型糖尿病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。有研究指出[4]，吸煙者糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)增加26%。尼古丁是香煙煙霧的主要活性化合物之一[5]。長(zhǎng)期暴露于高水平尼古丁是誘發(fā)和促發(fā)包括心肌病和周圍血管疾病在內(nèi)的心血管疾病的致病因素[6]。目前尼古丁促進(jìn)DCM 的機(jī)制還有待明確。本研究通過(guò)3 大數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)、Drug bank 數(shù)據(jù)庫(kù)、STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)）和WGCNA 分析對(duì)DCM 和尼古丁的相關(guān)基因進(jìn)行篩選，旨在運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)分析探討尼古丁對(duì)DCM 的影響及其作用機(jī)制，為吸煙人群中DCM 患者的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 從GEO 公共數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載GSE4745 的Series Matrix File數(shù)據(jù)文件，注釋平臺(tái)為GPL85，共24 組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，正常組12 例，疾病組12 例；下載GSE99203 的Series Matrix File 數(shù)據(jù)文件，注釋平臺(tái)為GPL14745，共6 組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包含正常組3 例，疾病組3 例；用SVA 算法進(jìn)行芯片之間的數(shù)據(jù)矯正，探討疾病相關(guān)分子機(jī)制的差異。

1.2 方法

1.2.1 WGCNA 分析 根據(jù)患者的表達(dá)譜數(shù)據(jù)構(gòu)建WGCNA 網(wǎng)絡(luò)，探討DCM 中相關(guān)的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，尋找協(xié)同表達(dá)的基因模塊，并探索基因網(wǎng)絡(luò)與表型之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系以及網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。利用“WGCNA-R”包構(gòu)建數(shù)據(jù)集中基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，篩選方差前10 000 的基因用該算法進(jìn)行篩選，以便進(jìn)一步分析，其中軟閾值設(shè)置為9。將加權(quán)鄰接矩陣轉(zhuǎn)化為拓?fù)渲丿B度矩陣（TOM）來(lái)估計(jì)網(wǎng)絡(luò)連接度，運(yùn)用層次聚類的方法來(lái)構(gòu)建TOM 矩陣的聚類樹結(jié)構(gòu)。聚類樹的不同分支代表不同的基因模塊，不同顏色代表不同的模塊?；诨虻募訖?quán)相關(guān)系數(shù)，將基因按照表達(dá)模式進(jìn)行分類，模式相似的基因歸為一個(gè)模塊，最后，幾萬(wàn)個(gè)基因通過(guò)基因表達(dá)模式被分成了多個(gè)模塊。

1.2.2 尼古丁作用靶點(diǎn)分析 通過(guò)DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.drugbank.ca/）檢索尼古丁相關(guān)的靶基因。

1.2.3 hub 基因的確定 通過(guò)string 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）查找藥物相關(guān)的基因，并將置信度得分＞0.4 作為截點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)，得到113 個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)的基因。將113 個(gè)靶點(diǎn)基因與WGCNA 中turquoise 模塊的基因取交集，確定hub 基因。

1.2.4 免疫基因相關(guān)性 通過(guò)分析DCM 數(shù)據(jù)集中hub 基因與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系，進(jìn)一步探討hub 基因影響DCM 進(jìn)展的潛在分子機(jī)制。使用CIBERSORT算法對(duì)正常組和糖尿病組的患者RNA-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用來(lái)推斷樣本免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的相對(duì)比例。使用“corrplot”包分析免疫細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系，進(jìn)一步分析免疫細(xì)胞的作用關(guān)系的影響。采用“vioplot”包繪制免疫細(xì)胞的相對(duì)含量高低，評(píng)價(jià)基因?qū)γ庖呓?rùn)的影響，并對(duì)基因表達(dá)量以及免疫細(xì)胞含量進(jìn)行Spearman 相關(guān)性分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從TISIDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://cis.hku.hk/TISIDB/）獲得chemokine、Immunoinhibitor、Immunostimulator、MHC、receptor 的相關(guān)基因，將核心基因與免疫相關(guān)基因進(jìn)行pearson 相關(guān)性分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.5 GO 和KEGG 功能分析 利用R 包“clusterprofiler”對(duì)WGCNA 基因模塊分析中的特定基因和2 個(gè)hub 基因進(jìn)行GO 富集和KEGG 通路分析，使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（http://metascape.org/）進(jìn)行注釋和可視化，Minoverlap ≥3 &P≤0.01 為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

1.2.6 受試者工作特性曲線（ROC）評(píng)價(jià)核心靶點(diǎn) 通過(guò)使用R 語(yǔ)言（version 3.6）pROC 包繪制ROC 曲線，探討靶點(diǎn)與DCM 發(fā)生發(fā)展的診斷效能關(guān)系，評(píng)價(jià)hub 基因與DCM 的關(guān)聯(lián)程度。

1.2.7 hub 基因參與的miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析 通過(guò)Targetscan 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.targetscan.org/mamm_31/）分析hub 基因參與的miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)TRRUST 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.grnpedia.org/trrust/）將模塊基因映射到轉(zhuǎn)錄因子（TF）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，得到模塊基因-TF 調(diào)控關(guān)系，并用cytoscape 進(jìn)行可視化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用R 語(yǔ)言（version 3.6）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用limma 軟件包計(jì)算有關(guān)DCM 的兩個(gè)數(shù)據(jù)集間的差異基因，應(yīng)用WGCNA-R 軟件包構(gòu)建數(shù)據(jù)集中基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，利用clusterprofiler 軟件包對(duì)WGCNA 基因模塊分析中的特定基因和hub 基因進(jìn)行GO 富集和KEGG 通路分析，應(yīng)用pheatmap包分別分析和繪制免疫細(xì)胞表達(dá)熱圖，采用vioplot包繪制小提琴圖，使用corrplot 包繪制不同免疫細(xì)胞間的占比相關(guān)圖。免疫細(xì)胞含量差異分析采用Wilcoxon 檢驗(yàn)、關(guān)鍵基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性用的是Spearman 檢驗(yàn)，關(guān)鍵基因與免疫相關(guān)基因的相關(guān)性用的是Pearson 檢驗(yàn)。運(yùn)用pROC 軟件包繪制ROC 曲線，探討hub 基因與DCM 發(fā)生發(fā)展的診斷效能關(guān)系。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DCM 數(shù)據(jù)集差異基因的篩選 從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE4745 以及GSE99203 相關(guān)的數(shù)據(jù)集，共納入30 例患者的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，其中正常組15 例，疾病組15 例。使用SVA 算法對(duì)芯片進(jìn)行矯正，用PCA 圖展示矯正前后的差異情況。結(jié)果顯示，SVA 算法矯正后芯片間批次效應(yīng)消除（圖1、圖2）。進(jìn)一步使用“l(fā)imma”包計(jì)算兩組患者之間的差異基因，隨后提取出630 個(gè)差異基因繪制火山圖，并用于后續(xù)構(gòu)建WGCNA 網(wǎng)絡(luò)（圖3）。

圖1 基因表達(dá)數(shù)據(jù)矯正前的PCA 圖

圖2 基因表達(dá)數(shù)據(jù)矯正后的PCA 圖

圖3 差異基因火山圖

2.2 WGCNA 分析 首先，軟閾值β 由函數(shù)“sft$powerEstimate”確定（圖4A、4B），然后基于TOM 矩陣檢測(cè)基因模塊，在本次分析中共檢測(cè)到3 個(gè)基因模塊，分別為blue 模塊（202）、grey 模塊（31）、turquoise 模塊（397）。進(jìn)一步通過(guò)模塊與性狀之間的分析，發(fā)現(xiàn)turquoise 模塊與表型相關(guān)性最高（cor=0.87，P=3e-10）（圖4C）。對(duì)turquoise 模塊的基因進(jìn)行Metascape 通路分析，結(jié)果顯示，基因主要富集在一元羧酸的代謝過(guò)程（monocarboxylic acid metabolic process）、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)（response to extracellular stimulus）、硫化合物代謝過(guò)程（sulfur compound metabolic process）等通路（圖4D）。

圖4 WGCNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)中臨床特征相關(guān)的關(guān)鍵模塊及Metascape 通路分析

2.3 尼古丁相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和hub 基因篩選 Drug bank 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出尼古丁作用靶點(diǎn)13 個(gè)，分別是CHAT、CYP19A1、CHRNB4、CHRNB3、CHRNA10、CHRNA9、CHRNA6、CHRNA5、CHRNA3、CHRNA2、CHRNB2、CHRNA7、CHRNA4；然后再通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)查找靶點(diǎn)相關(guān)的基因，拓展不少于100 個(gè)數(shù)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，得到113 個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)（圖5）。將113 個(gè)靶點(diǎn)基因與WGCNA 中turquoise模塊的基因取交集，共得到2 個(gè)hub 基因Chrnb4、Cyp1a1（圖6）。

圖5 113 個(gè)尼古丁靶點(diǎn)相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖6 確定hub 基因

2.4 尼古丁影響DCM 的hub 基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 GO 富集結(jié)果顯示，2 個(gè)hub 基因主要涉及的通路為Fe3+反應(yīng)[response to iron（III）ion]、維甲酸生物合成過(guò)程（retinoic acid biosynthetic process）（圖7A）；KEGG富集結(jié)果顯示，2 個(gè)hub 基因主要涉及的通路為色氨酸代謝（Tryptophan metabolism）、卵巢類固醇發(fā)生（Ovarian steroidogenesis）（圖7B）。進(jìn)一步使用Cytoscape 軟件，生成了hub 基因影響DCM 的網(wǎng)絡(luò)以及核心靶點(diǎn)相關(guān)通路的交互圖，圖表清晰顯示2個(gè)hub 基因Chrnb4、Cyp1a1 的分子機(jī)制以及其對(duì)DCM的調(diào)控作用（圖7C）。

圖7 hub 基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.5 DCM 數(shù)據(jù)集及hub 基因的免疫浸潤(rùn)分析 通過(guò)分析在糖尿病心肌病數(shù)據(jù)集中核心基因與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系，進(jìn)一步探討核心基因影響糖尿病心肌病進(jìn)展的潛在分子機(jī)制。22 種免疫細(xì)胞熱圖顯示一些免疫細(xì)胞，如M1 型巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的細(xì)胞、B細(xì)胞、濾泡輔助性CD4+T 細(xì)胞、CD4+記憶性T 細(xì)胞、CD4+初始T 細(xì)胞、CD8+初始T 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞、未成熟的DC 細(xì)胞、活化的DC 細(xì)胞在正常組和疾病組中的細(xì)胞免疫浸潤(rùn)情況有較為明顯的差異（圖8A）。22 種免疫細(xì)胞相關(guān)性熱圖顯示記憶B 細(xì)胞和初始B 細(xì)胞、CD8+初始T 細(xì)胞和CD4+初始T 細(xì)胞、CD4+記憶性T 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞呈正相關(guān)，而調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和未成熟的DC 細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和肥大細(xì)胞、濾泡輔助性CD4+T 細(xì)胞和活化的DC 細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（圖8B）。小提琴圖結(jié)果顯示靜息的NK 細(xì)胞、CD8+初始T 細(xì)胞、初始B細(xì)胞參與免疫浸潤(rùn)過(guò)程多。與正常對(duì)照組相比漿細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、靜息的NK 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、未成熟的DC 細(xì)胞參與細(xì)胞免疫浸潤(rùn)過(guò)程較多，而嗜酸性細(xì)胞、肥大細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞、活化的DC 細(xì)胞參與細(xì)胞免疫浸潤(rùn)過(guò)程較少（圖8C）。2 個(gè)hub 基因均與免疫細(xì)胞含量有較強(qiáng)的相關(guān)性（圖8D），結(jié)果符合預(yù)期。

圖8 免疫浸潤(rùn)分析

2.6 hub 基因的免疫調(diào)控 hub 基因與免疫基因的相關(guān)性分析結(jié)果表明，Chrnb4 與Ccl20、Ccl11、Cxcl10、Il10、Cd28、Tap1、Cxcr5、Ccr3 呈正相關(guān)；Cyp1a1 與Ccl5、Cd48、Ccr5 呈負(fù)相關(guān)，見圖9。

圖9 hub 基因免疫調(diào)控結(jié)果

2.7 hub 基因的ROC 分析 2 個(gè)hub 基因的AUC 值分別是Chrnb4（AUC：0.707；95%CI：0.511～0.902）、Cyp1a1（AUC：0.769；95%CI：0.580～0.958），提示2個(gè)hub 基因均能較好的預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生發(fā)展（圖10A、10B）。

圖10 ROC 分析結(jié)果

2.8 hub 基因的miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)和TF 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)本研究共預(yù)測(cè)40 個(gè)miRNA-mRNA 作用關(guān)系對(duì)，其中35 個(gè)miRNA，2 個(gè)mRNA，見圖11；hub 基因Cyp1a1 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見圖12。

圖11 hub 基因miRNA-RNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖

圖12 Cyp1a1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

3 討論

DCM 是糖尿病嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥，是目前臨床實(shí)踐中導(dǎo)致心力衰竭的主要原因之一，發(fā)病率和死亡率較高[7]。吸煙是糖尿病心肌病的主要危險(xiǎn)因素，顯著增加心臟病患病風(fēng)險(xiǎn)[8]。尼古丁是香煙煙霧的主要活性化合物之一，已被證明對(duì)心血管系統(tǒng)有不利影響。本研究通過(guò)3 大數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)、Drug bank 數(shù)據(jù)庫(kù)、STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)）和WGCNA 分析對(duì)DCM 和尼古丁的相關(guān)基因進(jìn)行分析篩選，分析尼古丁加重DCM 的潛在診斷生物標(biāo)志物。

本研究從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)下載DCM 的表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，通過(guò)WGCNA 分析，構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，基于TOM 矩陣檢測(cè)基因模塊，在本次分析中共檢測(cè)到3 個(gè)基因模塊，分別為blue（202）、grey（31）、turquoise（397）。進(jìn)一步通過(guò)模塊與性狀之間的分析，發(fā)現(xiàn)turquoise 模塊與表型相關(guān)性最高。對(duì)turquoise 模塊的基因進(jìn)行Metascape 通路分析，結(jié)果顯示，基因主要富集在一元羧酸的代謝過(guò)程、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、硫化合物代謝過(guò)程等。表明這些生物學(xué)過(guò)程調(diào)控DCM 的發(fā)生與發(fā)展。

本研究根據(jù)WGCNA 分析、Drug bank 數(shù)據(jù)庫(kù)和STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到2 個(gè)hub 基因Chrnb4、Cyp1a1，提示其可能為尼古丁影響DCM 的潛在靶點(diǎn)。使用Cytoscape 軟件生成了hub 基因影響DCM的網(wǎng)絡(luò)以及核心靶點(diǎn)相關(guān)通路的交互圖，該圖表清晰顯示2 個(gè)hub 基因Chrnb4、Cyp1a1 的分子機(jī)制以及其對(duì)DCM 的調(diào)控作用。編碼nAChRβ4 亞基的Chrnb4 基因廣泛存在于氣道上皮細(xì)胞，并形成異質(zhì)nAchR 來(lái)調(diào)節(jié)尼古丁受體的親和力。有研究證明激動(dòng)劑1，1-二甲基-4-苯基哌嗪碘化（DMPP）選擇性靶向α3β4 nAChr，通過(guò)增加棕色脂肪、心臟和骨骼肌中的葡萄糖攝取，顯著改善了糖耐量[9]。此外，人類Chrnb4 基因中跨越MafA 結(jié)合區(qū)域的多態(tài)性與2型糖尿病相關(guān)[10]。Cyp1a1 參與了大量的外源性和內(nèi)源性底物代謝，在藥物和環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的代謝中起著關(guān)鍵作用。有研究表明在健康人心臟中，Cyp1a1 mRNA 的表達(dá)量極低，它對(duì)內(nèi)源性底物代謝具有重要作用[11]。這些底物參與了氨基酸（AA）和色胺的代謝。慢性克山病和DCM 患者血液中Cyp1a1 和Cyp2c19 的mRNA 水平均高于健康人，說(shuō)明心臟結(jié)構(gòu)和功能損傷與AA 依賴的CYP 代謝途徑之間可能存在因果關(guān)系[12]。有證據(jù)表明Cyp450 通過(guò)AA 的代謝調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的收縮性[13]。也有研究指出Cyp1a1的上調(diào)會(huì)加重心肌損傷[12]。

微環(huán)境主要由免疫細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、多種生長(zhǎng)因子、炎癥因子及特殊的理化特征等共同組成，顯著影響著疾病的診斷和臨床治療敏感性。越來(lái)越多的證據(jù)表明，多種免疫細(xì)胞與DCM 的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。因此，本研究在前面分析結(jié)果的基礎(chǔ)上采用CIBER-SORT 對(duì)DCM 及DCM 數(shù)據(jù)集中核心基因進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析，初步探討免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在DCM 中的作用并進(jìn)一步探討hub 基因影響DCM 進(jìn)展的潛在分子機(jī)制。結(jié)果顯示M1 型巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的細(xì)胞、B 細(xì)胞、濾泡輔助性CD4+T 細(xì)胞、CD4+記憶性T 細(xì)胞、CD4+初始T 細(xì)胞、CD8+初始T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞、未成熟的DC 細(xì)胞、活化的DC 細(xì)胞在正常組和疾病組中的細(xì)胞免疫浸潤(rùn)情況有差異。說(shuō)明這些免疫細(xì)胞在DCM 的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起到了重要作用。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，2 個(gè)hub 基因與免疫細(xì)胞含量有較強(qiáng)的相關(guān)性，說(shuō)明2 個(gè)hub 基因是影響DCM 免疫浸潤(rùn)的候選基因。而控制炎癥的始發(fā)因素，調(diào)控特定的細(xì)胞亞群或者相關(guān)的炎癥通路可能預(yù)防或改善DCM 的進(jìn)程和病理過(guò)程。有研究表明[14]，在胰島素抵抗或肥胖狀態(tài)下，M1 型巨噬細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子，降低心臟和全身胰島素信號(hào)，促進(jìn)DCM 的發(fā)展。此外，與健康人群相比，糖尿病患者中性粒細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子如IL-8、IL-1β、TNF-α 和IL-1ra表現(xiàn)出更高的反應(yīng)和分泌水平，進(jìn)一步促進(jìn)中性粒細(xì)胞向炎癥部位遷移、吞噬、溶解蛋白酶的釋放、ROS 的產(chǎn)生和凋亡[15]。大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，適應(yīng)性免疫，特別是T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，在糖尿病和DCM 的發(fā)病機(jī)制中可能起著重要的作用。有研究報(bào)道[16]，T 細(xì)胞浸潤(rùn)與DCM 的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，而在體外誘導(dǎo)DCM 實(shí)驗(yàn)中T 細(xì)胞的減少發(fā)揮心臟保護(hù)作用。在DCM 中T 細(xì)胞亞型異常改變，導(dǎo)致促炎和抗炎免疫失衡，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗。據(jù)報(bào)道Th1 和Th17 亞群的增加促進(jìn)DCM發(fā)展[17]。輔助性T 細(xì)胞分泌趨化因子、生長(zhǎng)因子和促炎細(xì)胞因子的增加導(dǎo)致心臟功能受損和心臟纖維化增加，而調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）通常會(huì)減弱心臟輔助性T 細(xì)胞的促炎作用[18]。另一項(xiàng)研究報(bào)道[19]，Treg 細(xì)胞可通過(guò)抑多種途徑抑制Th1 和Th17 反應(yīng)，從而改善糖尿病患者的胰島素抵抗。B 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫可以促進(jìn)自身免疫性糖尿病小鼠的心功能障礙[20]。本研究結(jié)果與上述研究相似，均表明DCM 發(fā)展過(guò)程中的免疫細(xì)胞活化的改變與心臟炎癥增強(qiáng)有關(guān)。

免疫檢查點(diǎn)是在免疫細(xì)胞上表達(dá)、能調(diào)節(jié)免疫激活程度的一系列分子，它們對(duì)防止自身免疫（免疫功能發(fā)生異常，對(duì)正常細(xì)胞發(fā)動(dòng)攻擊）作用的發(fā)生，起著重要作用。本研究免疫調(diào)控分析結(jié)果表明，Chrnb4 與Ccl20、Ccl11、Cxcl10、Il10、Cd28、Tap1、Cxcr5、Ccr3 呈 正 相 關(guān)；Cyp1a1 與Ccl5、Cd48、Ccr5呈負(fù)相關(guān)。表明這些免疫分子在DCM 病進(jìn)展的過(guò)程中對(duì)hub 基因起到重要調(diào)控作用，這些分子的表達(dá)和功能異常是DCM 發(fā)生的重要原因之一，如果能針對(duì)這些免疫檢查點(diǎn)分子進(jìn)行調(diào)節(jié)，比如用靶向檢查點(diǎn)分子的抑制劑就可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。ROC 分析顯示，2 個(gè)2 個(gè)hub 基因的AUC 值分別是Chrnb4（AUC：0.707；95%CI：0.511～0.902）、Cyp1a1（AUC：0.769；95%CI：0.580～0.958），提示2 個(gè)hub基因均能較好的預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生發(fā)展。由此推測(cè)Chrnb4 和Cyp1a1 可能參與DCM 的發(fā)生及進(jìn)展，有望成為DCM 的潛在新型診斷生物學(xué)標(biāo)志物。但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的證據(jù)表明，非編碼RNA 參與糖尿病心肌病的分子機(jī)制[21]?；虮磉_(dá)受多個(gè)調(diào)控因子在不同水平上的調(diào)控，其中包括染色體修飾、DNA 甲基化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、mRNA的可變剪接及降解、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及蛋白質(zhì)修飾等。TF 和miRNA 作為2 種關(guān)鍵的調(diào)控因子在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。以TF 和miRNA 為核心形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)被證實(shí)是一種有效的分析與研究生物調(diào)控復(fù)雜性的方法。研究TF與miRNA 組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)病機(jī)理在系統(tǒng)層次上提供重要的線索。因此，本研究在進(jìn)一步通過(guò)Targetscan 數(shù)據(jù)庫(kù)探討2 個(gè)hub 基因參與的miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果共預(yù)測(cè)40 個(gè)miRNA-mRNA 作用關(guān)系對(duì)，其中35 個(gè)miRNA，2 個(gè)mRNA，這可能為今后轉(zhuǎn)錄因子與miRNA 調(diào)控通路的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，尼古丁可加重DCM 心肌病的進(jìn)程，其與Chrnb4、Cyp1a1 相關(guān)并通過(guò)miRNA-RNA 互作調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞含量，從而可為治療吸煙人群中DCM患者心臟的損傷情況提供新的思路。