基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討木防己湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

王寶娟，辛昊洋，李 月

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕科，天津 300150 2.天津市南開區(qū)廣開街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，天津 300191）

木防己湯源于《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治篇》，為寒熱并用、補(bǔ)泄兼施之劑，可通陽利水、清熱補(bǔ)虛、消散飲邪積聚[1]。葉天士在《臨癥指南醫(yī)案》中提出，“濕熱流著，四肢痹痛”建議用仲景木防己湯法。后吳鞠通擴(kuò)而充之，對木防己湯進(jìn)行加減化裁，用于治療暑濕痹證，稱“此治痹之祖方也”。臨床上類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）急性期多用此方治療。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概念是2007 年英國藥理學(xué)家Hopkins AL[2]提出，是在現(xiàn)代藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)之上提出的藥物設(shè)計與開發(fā)的新方法和新策略，其是以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，從整體水平觀察“藥物－靶點(diǎn)－疾病”復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[3]。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探究木防己湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，以期為臨床合理應(yīng)用提供證據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 木防己湯有效成分及其作用靶點(diǎn)的篩選 于TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）收集木防己湯（防己、桂枝、人參、石膏）的有效成分信息和藥理學(xué)信息，將有效成分匯總后與DrugBank（https：//go.drugbank.com）數(shù)據(jù)庫里所有已知藥物進(jìn)行相似度比較，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性指數(shù)（drug-likeness，DL）≥0.18 為條件篩選有效成分。利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選潛在蛋白靶點(diǎn)，并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）將已篩選出來的靶蛋白名稱標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)的獲取 利用GeneCards（http://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）等數(shù)據(jù)庫，以“Rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞，得到類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化

1.3.1 木防己湯-類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的共同靶標(biāo)基因的篩選 根據(jù)上述方法整理出相關(guān)靶點(diǎn)后，運(yùn)用Venny2.1 軟件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）篩選得出木防己湯中有效成分與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的共同靶點(diǎn)，并繪制Venny 圖。采用Cytoscape3.7.2 構(gòu)建木防己湯-有效成分-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎-交集靶點(diǎn)的生物網(wǎng)絡(luò)。

1.3.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）及核心靶點(diǎn)的確定 將共同靶標(biāo)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）,構(gòu)建蛋白互作信息網(wǎng)絡(luò)圖。運(yùn)用Cytoscape3.7.2軟件對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)涮卣鞣治?，最終篩選出核心靶點(diǎn)。

1.4 生物功能富集分析 運(yùn)用R 語言軟件（Rx64 4.0.4）對木防己湯與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎共同靶基因中的蛋白進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 信號通路分析，獲得顯著富集的信號通路（P＜0.05），導(dǎo)出柱狀圖，闡釋木防己湯治療RA 的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 核心處方的有效成分及靶點(diǎn)預(yù)測 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫收集整理得到木防己湯有效成分，設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18，共篩選得到32 個有效成分：防己3 個、桂枝7 個、人參22 個，去除重復(fù)項(xiàng)共得到30 個有效成分（見表1）。收集整理得到有效成分的潛在蛋白靶點(diǎn)377 個，其中防己47 個、桂枝74 個、人參256 個，去除重復(fù)值共得到125 個潛在蛋白靶點(diǎn)；利用UniProt 數(shù)據(jù)庫把靶蛋白名稱轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的基因名稱，去除重復(fù)值后得到56 個靶蛋白。石膏只有一個有效成分，無對應(yīng)靶點(diǎn)蛋白。

表1 木防己湯有效活性化合物的相關(guān)信息

2.2 核心處方化學(xué)成分與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的共同作用靶點(diǎn)篩選 通過Gene Cards 和HMIM 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，去除重復(fù)靶點(diǎn)后共搜集到與RA 相關(guān)的靶點(diǎn)5046 個。運(yùn)用Venny 軟件得到核心處方化學(xué)成分靶點(diǎn)（56 個）與RA 相關(guān)靶點(diǎn)（5046 個）的交集，包括PPARG、CASP3、ESR1、RELA、ICAM1 等37 個靶點(diǎn)。木防己湯治療RA 的作用靶點(diǎn)見圖1。

圖1 木防己湯預(yù)測靶點(diǎn)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心蛋白的確定 將篩選得到37 個木防己湯-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的共同靶點(diǎn)蛋白質(zhì)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)出蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2，該網(wǎng)絡(luò)包含37 個蛋白，163 條關(guān)系線條，平均節(jié)點(diǎn)數(shù)8.81 條，預(yù)期邊緣35 個，PPI 濃縮P＜1.0e-16。通過R 語言軟件查詢核心靶點(diǎn)，依據(jù)節(jié)點(diǎn)count 值，得到互作關(guān)系排名前20的靶點(diǎn)信息，導(dǎo)出barplot 條形圖，見圖3。對PPI 網(wǎng)絡(luò)的靶點(diǎn)運(yùn)用Cytoscape3.7.2 進(jìn)行拓?fù)涮卣鞣治觯浴岸戎行男浴保╠egree）、“中介中心性”（betweenness）“接近中心性”（closeness）三個參數(shù)均大于中位數(shù)的條件來進(jìn)行篩選，共篩選出15 個核心靶點(diǎn)，根據(jù)count 值 及PPI 拓 撲 特 征 分 析，PPARG、CASP3、RELA、ESR1、ICAM1 排名靠前，推測為核心基因。

圖2 蛋白質(zhì)互作PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 基因互作關(guān)系barplot 圖

2.4 藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病共同作用靶點(diǎn)及關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將獲得的木防己湯-有效成分-靶點(diǎn)-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎數(shù)據(jù)利用Cytoscape3.7.2 網(wǎng)絡(luò)繪圖軟件繪制并分析木防己湯干預(yù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。菱形表示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，長方形代表木防己湯中的中藥組成，三角形代表有效成分，六邊形表示基因靶點(diǎn)。使用network analyzer 功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，以自由度（degree）值為評判標(biāo)準(zhǔn)可得出較為重要的成分、靶點(diǎn)，結(jié)果見表2。

表2 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D分析表

圖4 藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 生物功能富集分析

2.5.1 GO 功能富集分析 GO 功能富集共包括83個GO 條目，根據(jù)P 值將82 個GO 條目進(jìn)行升序排列，篩選前20 個條目，導(dǎo)出柱狀圖，見圖6。柱狀圖Y 軸代表GO 名稱，X 軸表示富集的基因數(shù)目，生物過程主要涉及nuclear receptor activity、ligandactivated transcription factor activity、transcription coactivator binding、cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic signaling pathway、cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process 等。

圖6 GO 功能富集分析柱狀圖

2.5.2 KEGG 通路富集分析 KEGG 信號通路共確定90 條信號通路，篩選出富集基因數(shù)的前20 條通路（見圖7）。柱狀圖Y 軸代表KEGG 通路名稱，X 軸表示富集的基因數(shù)目，信號通路主要包括Lipid and atherosclerosis、TNF signaling pathway、Toxoplasmosis、Chemical carcinogenesis -receptor activation、Fluid shear stress and atherosclerosis、Prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Hepatitis B、Influenza A、Apoptosis。

圖7 KEGG 富集分析柱狀圖

3 討論

RA 在中醫(yī)上屬于“痹證”的范疇，急性期多為濕熱痹[4]，臨床使用木防己湯治療有效[5-7]。RA 發(fā)生發(fā)展過程由多種信號分子和多條生物通路調(diào)控。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過分析木防己湯的有效成分、作用靶點(diǎn)及調(diào)控的信號通路，建立該方治療RA 的“成分-靶點(diǎn)-信號通路”多層次網(wǎng)絡(luò)模型，探討了木防己湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)在木防己湯-有效成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)中β-谷甾醇、山柰酚關(guān)聯(lián)度最高。β-谷甾醇有抗炎作用，Liu R 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化減輕膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹癥狀，降低膠原特異性抗體并抑制促炎因子的產(chǎn)生。Guo Q等[9]研究表明，β-谷甾醇和歐前胡素能夠協(xié)同作用于CIA 大鼠，改善其關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，協(xié)同機(jī)制與調(diào)節(jié)LTA、CD83 和SREBF1 的水平密切相關(guān)。Zhang F等[10]研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇通過增加滑膜的氧化還原狀態(tài)水平并減少TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17，增加TGF-β、IL-10 等細(xì)胞因子，抑制NF-kB和激活HO-1/Nrf-2 通路顯示出對CFA 大鼠的抗關(guān)節(jié)炎作用。山柰酚有抗炎和免疫調(diào)節(jié)特性，山柰酚可雙向調(diào)節(jié)Treg 細(xì)胞的免疫抑制和Th 細(xì)胞的促炎作用，同時可抑制滑膜異常增厚，調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，抑制骨侵蝕和血管生成[11]。其可降低破骨細(xì)胞的分化，并通過靶向成纖維細(xì)胞生長因子受體3-核糖體S6 激酶2 信號軸防止類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[12]。β-谷甾醇和山柰酚有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，因此推斷木防己湯治療RA 發(fā)揮作用的主要成分可能為β-谷甾醇、山柰酚等。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測木防己湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有37 個潛在作用靶點(diǎn)。篩選出15 個核心靶點(diǎn)，其中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、RELA、雌激素受體R1（ESR1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM1）等靶點(diǎn)排名靠前，推測為核心靶點(diǎn)。PPARG 屬于核受體超家族，和其他核受體超家族一樣，可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、發(fā)育和代謝。此外，它還涉及脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)以及單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的成熟和炎癥反應(yīng)的控制[13]。Baroi S 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，骨細(xì)胞中的PPARG 能夠控制硬化蛋白表達(dá)、骨量、骨髓肥胖并介導(dǎo)羅格列酮誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失。Hu YH 等[15]發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)時可以導(dǎo)致AIA 大鼠脂肪合成不足，調(diào)節(jié)PPARG 恢復(fù)脂肪代謝的穩(wěn)態(tài)，可以阻止AIA 大鼠單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞糖酵解引起的炎癥極化。RELA 翻譯后修飾可精準(zhǔn)調(diào)控NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性，在調(diào)節(jié)炎癥、腫瘤、代謝以及免疫應(yīng)答等重要的生命活動及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。RelA 通過調(diào)控NLRP3 的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)巨噬細(xì)胞中NLRP3 炎癥小體的形成，進(jìn)而調(diào)控RA 關(guān)節(jié)滑膜的炎癥反應(yīng)[16]。ESR1 可表達(dá)于成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞以及骨細(xì)胞，與很多骨性疾病密切相關(guān)。ESR1 基因在RA患者中存在差異表達(dá)，預(yù)測其可作為治療RA 的新靶點(diǎn)[17]。ICAM1 又叫做CD54 是介導(dǎo)黏附反應(yīng)重要的一個黏附分子，它在炎癥反應(yīng)、控制腫瘤惡化和轉(zhuǎn)移以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)中起重要作用[18，19]。

在木防己湯治療RA 的GO 分析中，主要涉及核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)錄輔激活子結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號通路、半胱氨酸型內(nèi)肽酶與細(xì)胞凋亡過程等。通過KEGG 分析得出20 條通路，包括脂質(zhì)和動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、弓形蟲?。╰oxoplasmosis）、化學(xué)致癌-受體激活（chemical carcinogenesis-receptor activation）、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、前列腺癌（prostate cancer）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（hepatitis B）、甲型流感（Influenza A）、細(xì)胞凋亡（apoptosis）等信號通路，這些通路可能是木防己湯治療RA 的作用機(jī)制。

自身免疫性疾病與動脈粥樣硬化有著密切的聯(lián)系[20]，高脂血癥環(huán)境激活了致病性自身免疫性細(xì)胞反應(yīng)，從而促進(jìn)了自身免疫性疾病。推測木防己湯可能會通過調(diào)控脂質(zhì)和動脈粥樣硬化信號通路影響RA 患者體內(nèi)脂質(zhì)代謝，抑制炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞，減輕患者的炎性癥狀。

TNF 作為一種關(guān)鍵的細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)廣泛的細(xì)胞內(nèi)信號通路，包括細(xì)胞凋亡、炎癥和免疫。其在RA 患者的關(guān)節(jié)滑液和滑膜組織中的表達(dá)明顯上升，可影響滑膜巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞等，進(jìn)而改變關(guān)節(jié)微環(huán)境，進(jìn)一步加重關(guān)節(jié)破壞[21]。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[22]，木防己湯能夠降低血清TNF-α 含量，從而緩解RA 病情，減輕關(guān)節(jié)水腫，減少淋巴細(xì)胞浸潤，抑制滑膜增生。結(jié)合研究結(jié)果，考慮木防己湯可能通過抑制TNF 信號通路緩解疾病。

細(xì)胞凋亡指細(xì)胞為了抵抗外界刺激，維持內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)態(tài)而發(fā)生的非依賴性有序死亡，通常被稱為程序性死亡。與其他細(xì)胞死亡方式不同，細(xì)胞凋亡是一種自我保護(hù)機(jī)制[23]。誘導(dǎo)FLS 細(xì)胞凋亡是中藥治療RA 的重要機(jī)制，可能與死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路、線粒體依賴的凋亡通路、NF-κB 介導(dǎo)的凋亡通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）介導(dǎo)的凋亡通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）介導(dǎo)的凋亡通路及PI3K-Akt介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)[24]。研究發(fā)現(xiàn)[25]，復(fù)方木防己湯可能通過抑制C-myc 活化，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。推斷木防己湯可能通過每種途徑參與FLS 細(xì)胞凋亡的過程，需要深入的實(shí)驗(yàn)研究來加以驗(yàn)證。

RA 患者RAGE 表達(dá)增加，IL-17 和IL-1β 表達(dá)增加[26]。這表明抑制RAGE 可能是RA 治療的一個良好靶點(diǎn)。而木防己湯也有可能干預(yù)了糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路。RA 的病因不明確，可能與遺傳、感染、環(huán)境和內(nèi)分泌因素有關(guān)，病毒感染被認(rèn)為是自身免疫疾病的一個重要原因。甲型流感病毒（IAV）是其一，病毒感染可誘導(dǎo)或預(yù)防自身免疫性疾病[27]。慢性乙肝病毒感染可能有關(guān)節(jié)痛或與RA 相似的關(guān)節(jié)炎[28]。有研究報道稱[29]，HBV 感染和RA 患者病理改變具有一定聯(lián)系。弓形蟲可能引發(fā)個體的病理過程，最終導(dǎo)致RA[30]。弓形蟲增加了患者體內(nèi)IL-17 的表達(dá)，這種細(xì)胞因子參與了RA的發(fā)病。木防己湯是否可以通過抗病毒、抗寄生蟲途徑等治療RA，有待更深入的研究。

惡性腫瘤是RA 的共病疾病，相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，無腫瘤時淋巴瘤與RA 的相關(guān)性最高[31]，但與其他腫瘤相關(guān)性并不一致，NHANES 的人口數(shù)據(jù)分析支持RA 患者癌癥風(fēng)險增加，乳腺癌和前列腺癌是最常見的癌癥類型[32]，但具體原因不明，可能與炎癥反應(yīng)或者免疫藥物應(yīng)用有關(guān)。通路富集分析顯示木防己湯可能通過調(diào)控脂質(zhì)代謝和抗動脈硬化、TNF信號通路、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抗病毒、抗寄生蟲、腫瘤相關(guān)通路等方面治療RA。

綜上所述，木防己湯對RA 的治療呈現(xiàn)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，研究結(jié)果初步推測木防己湯有效活性成分治療RA 的作用機(jī)制，但本研究僅從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)層面分析，而對其臨床作用機(jī)制了解仍不足，因此有必要通過實(shí)驗(yàn)研究來進(jìn)一步深入探究，為木防己湯治療RA 提供理論依據(jù)。