植物多酚共價修飾在降低蜂花粉致敏性中的潛在應用研究進展

周恩寧 李強強 吳黎明

（中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093）

1 蜂花粉營養(yǎng)成分及其生物活性

蜂花粉是指蜜蜂從植物花藥中收集花粉，將其與少量唾腺分泌物或花蜜混合而成的不規(guī)則團狀物[1]。研究表明，蜂花粉中含有約200 多種營養(yǎng)物質(zhì)與活性成分，具有延緩衰老、增強機體免疫力、抑制前列腺疾病等功效，是理想的功能性食品。其組分主要包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)、植物多酚類化合物等（如圖1 所示）。其中，蜂花粉中的碳水化合物由單糖、雙糖及多糖組分構成，約占總干重的2/3[2]。它們在生物功能的調(diào)節(jié)中具有重要作用，具有防止肥胖、改善腸道環(huán)境、抗癌、抗腫瘤的功效。例如，堿提紅花蜂花粉多糖組分（APBPC-3）及云南產(chǎn)紅花蜂花粉多糖組分（APBPC-2）對前列腺癌細胞DU145、人乳腺癌細胞MDA-MB231 和人肝癌細胞HepG-2 的增殖具有抑制作用[3]；蕎麥蜂花粉水溶性多糖（WFPP）對抗生素誘導的微生物菌群失調(diào)具有緩解作用等[4]。蜂花粉中蛋白質(zhì)的含量（一般為7.5%～35%）僅次于碳水化合物，其中包含20 多種游離氨基酸，且其必需氨基酸的含量比雞蛋、牛肉等高3～5 倍，具有很高的膳食利用價值。脂類是蜂花粉中的第三大營養(yǎng)成分，它包含脂肪、磷脂等，其中多不飽和脂肪酸種類豐富，對于促進大腦發(fā)育、提高記憶力以及預防動脈粥樣硬化具有良好功效。植物多酚類化合物在蜂花粉中的平均含量在1.6%左右，主要包括酚酸和黃酮類化合物等[5]，它們可通過調(diào)節(jié)酶活性和信號轉導、清除自由基、螯合金屬離子以及激活轉錄因子和基因表達等發(fā)揮抗腫瘤、抗衰老、抗炎、抗糖尿病、抗癌等多種生物活性功能[6]。蜂花粉提取物中含有的酚酸類和黃酮類化合物具有清除自由基和降低血糖的潛力，并通過研究證明蜂花粉水乙醇提取物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有較強的抑制作用，可減緩雙糖的分解，減少血液中的糖累積[7,8]。

圖1 蜂花粉中各成分占比及蜂花粉過敏原引發(fā)的食物過敏

2 蜂花粉致敏及脫敏研究現(xiàn)狀

盡管蜂花粉中一些過敏原會因蜜蜂加工而部分降解或減少，但這仍不能避免因食用蜂花粉或蜂花粉制劑而引發(fā)的食物過敏。而且隨著蜂花粉在食品、化妝品和保健品中的推廣，蜂花粉致敏問題不容小覷，因此與蜂花粉過敏原相關的潛在問題亟待解決。

蜂花粉引起的食物源性過敏反應大多屬于IgE 介導的速發(fā)型過敏反應。總的來說，當機體初次受到過敏原刺激時會產(chǎn)生特異性抗體IgE，IgE 與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的高親和力受體（Fc?RI）結合而使機體處于致敏狀態(tài)。當機體再次暴露于相同的過敏原時，過敏原將與致敏肥大細胞/嗜堿性粒細胞表面的IgE 抗體特異性結合，使之脫顆粒，釋放出組胺、5-羥色胺、白三烯及嗜酸性粒細胞趨化因子等大量致敏介質(zhì)，作用于效應組織和器官而引起局部或全身過敏反應，導致機體出現(xiàn)腹瀉、蕁麻疹、喉水腫、呼吸急促等異?，F(xiàn)象[9-11]。在前期研究中，分別通過發(fā)酵及酶解的方式對油菜蜂花粉蛋白進行處理，并通過基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學鑒定出其中幾種潛在的致敏原。而且兩種處理方式的代謝組學分析顯示，經(jīng)過發(fā)酵和酶解處理后，其中潛在的致敏原含量均明顯降低，而且經(jīng)過體外免疫評估也發(fā)現(xiàn)，油菜蜂花粉蛋白與特異性IgE 的結合能力顯著下降[12,13]，這為脫敏蜂花粉產(chǎn)品開發(fā)提供了啟示。

3 植物膳食多酚的功效

膳食多酚是指植物中存在的具有多個羥基取代基或基團的天然芳香環(huán)化合物，是具有多酚結構的非能量次級代謝物[14]。根據(jù)化學結構，膳食多酚可以分為黃酮類化合物，如黃酮、黃酮醇、查耳酮、花色素和原花色素等，以及非黃酮類化合物，如酚酸、芪類化合物和酚酰胺等[15]。目前，植物多酚已被證明具有減輕炎癥、預防糖尿病、下調(diào)促炎細胞因子等免疫調(diào)節(jié)作用[16]。如綠茶多酚可以降低高脂飲食誘導的肥胖犬的體重增加，改善其腸道微生物群的變化并減輕腸道炎癥[17]；芒果多酚、石榴多酚可以下調(diào)促炎細胞因子，改善炎癥性腸病[18]；槲皮素能夠抑制胰腺鐵沉積，改善II 型糖尿病[19]；以及丁烯酸、小構樹多酚能夠預防細胞因子誘導的胰島B 細胞損傷和減少/延遲I 型糖尿病中胰島B 細胞損傷的程度等[20,21]。

膳食多酚在抗過敏方面也具有良好功效。有研究表明，多酚可以通過抑制過敏小鼠外周B 細胞的粘附和遷移、抑制IgE 和IgG1 水平以及消除Th2 型細胞因子來減輕過敏反應[22]。黃酮類化合物可以通過抑制MHC-II 和共刺激分子（CD80、CD86）的細胞表面表達，導致抗原呈遞無效或抑制細胞因子的產(chǎn)生，直接影響樹突狀細胞的抗原呈遞[23]。酚類化合物，如咖啡酸和阿魏酸，已被證明可降低花生提取物和液體花生醬的過敏性，與過敏蛋白形成不溶性復合物[24]。因此，膳食多酚在脫敏/降敏方面的應用值得進一步研究。

4 植物多酚共價修飾致敏蛋白的研究進展

蛋白質(zhì)與膳食多酚可通過非共價鍵如范德華力、氫鍵以及疏水相互作用等實現(xiàn)兩者的非共價結合，但這樣形成的復合物容易受外界因素的影響發(fā)生解離[25]；而蛋白質(zhì)與植物多酚的共價結合可以形成強而穩(wěn)定的共價復合物，據(jù)研究報道，酶法、堿處理法與自由基誘導法均可以制備出穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-多酚共價復合物。其中，酶法是指在條件溫和的環(huán)境下使用漆酶和辣根氧化酶等酶催化誘導蛋白質(zhì)與多酚間的共價反應，具有安全性、廣適性的優(yōu)點；自由基誘導法是指過氧化氫（H2O2）與抗壞血酸發(fā)生氧化還原反應生成羥基自由基，羥基自由基再氧化蛋白質(zhì)側鏈上的氨基酸，最終多酚與氧化的蛋白共價結合[26,27]；堿處理法是指多酚可以在堿性（pH=9）有氧條件下氧化為醌，而醌是一種反應性親電中間體，通過與蛋白質(zhì)側鏈的巰基或氨基親核加成形成強而穩(wěn)定的C-S 或C-N 鍵形成共價鍵[27]。

研究表明，膳食多酚與蛋白質(zhì)共價結合可以改變蛋白質(zhì)起泡性、凝膠性、乳化性、溶解度等功能性質(zhì)[28]；而且，蛋白質(zhì)-多酚相互作用能使蛋白具有較強的抗氧化能力和多種生物活性，例如抗?jié)?、抗癌及預防心血管疾病等。除此之外，膳食多酚與致敏蛋白共價結合還可以降低食物致敏蛋白的致敏性，改善食物過敏反應。而且近年來有許多學者研究了膳食多酚和致敏蛋白共價結合，以減少/消除食物過敏原的致敏性。據(jù)報道，綠原酸（CA）和木犀草素共價修飾小麥過敏原Gliadin，使其IgE 結合能力下降，并顯著提升其熱穩(wěn)定性、抗氧化活性及體外消化率[29]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和CA 共價修飾β-乳球蛋白（β-LG），可以改變β-LG 的空間結構，有效降低β-LG 與IgE 的結合能力[30]。同樣，EGCG 和CA 共價修飾花生變應原Ara h1 降低了其變性溫度和IgE 結合能力，并使嗜堿性細胞的組胺釋放顯著減少。而且，經(jīng)體外消化實驗證明，與膳食多酚共價結合后Ara h 1 的消化率明顯提高[31]。此外，EGCG 對卵清蛋白（OVA）的共價結合提高了OVA 的消化率和抗氧化能力，并降低了OVA 的IgE 結合能力。除了EGCG 和CA，槲皮素也被用于與致敏蛋白共價結合。而且，槲皮素對OVA 的共價修飾可以改變OVA 的二、三級結構，破壞或掩蓋OVA 的抗原表位，降低其IgE 結合能力，并顯著降低小鼠脾臟中Th2 型細胞因子IL-13、IL-4和IL-5 以及略微升高Th1 型細胞因子IFN-γ，調(diào)節(jié)Th1/Th2 免疫反應的不平衡，緩解小鼠由OVA 引起的過敏反應[32]。

因此，植物多酚共價結合致敏蛋白的潛在降敏機制可以由圖2、圖3 解釋，即：結合致敏蛋白過敏原與膳食多酚結合可以增強蛋白聚集，改變致敏蛋白的結構性質(zhì)，從而改變其變應原性，使致敏蛋白的IgE結合能力降低，并抑制Th 細胞分泌致敏細胞因子，抑制肥大細胞釋放過敏介質(zhì)[25,33]。說明膳食多酚共價修飾食物致敏蛋白是一種有效的食物降敏或脫敏方式，具有廣泛的應用前景。

圖2 植物多酚共價修飾過敏原導致過敏原構象改變

圖3 植物多酚共價修飾降低過敏原變應原性的潛在機理

5 食物致敏蛋白的免疫原性評價

5.1 體外檢測

5.1.1 免疫學方法

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）能夠利用連接到抗體上的酶來檢測抗原-抗體復合物，并通過顏色變化來指示抗原-抗體復合物的存在，通常用于血清中的抗體和食品中的致敏原的定性或定量檢測。但它不能檢測受損或未折疊的致敏蛋白，因此，ELISA可以用于評估經(jīng)過某種加工手段處理后的食品中致敏原構象表位是被暴露還是掩蓋或破壞，從而檢驗食品加工技術對食品中致敏原破壞的有效性[34]。蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot 可以將電泳分離后的致敏蛋白從凝膠轉移到固相載體上，然后用特異性抗體對致敏蛋白進行檢測，現(xiàn)已廣泛應用于抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面[35]。斑點印跡試驗（Dot Blot）是一種利用固相載體，進行抗原、抗體反應的免疫學檢測方法，相比于Western Blot 可以快速、微量的對食物中的致敏原進行評估[36]。

5.1.2 聚合鏈式反應（PCR）

當致敏原含量很低無法通過免疫學方法進行分析時，可以通過PCR 來檢測致敏原的基因含量從而對致敏原進行評估，因為基于PCR 的方法對致敏原進行評估是對致敏原的DNA 進行檢測而不是致敏蛋白[37]。而且食品加工可能會導致蛋白質(zhì)聚集而使抗原表位被掩蓋或破壞蛋白質(zhì)的空間構象使致敏蛋白不能夠被常規(guī)檢測方法指示，但DNA 卻能夠在加工過程中更穩(wěn)定[38]。因此，PCR 比基于抗體的檢測方法更有效、靈敏度更高。

5.1.3 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用可以對致敏蛋白進行鑒定和表征，它具有高靈敏性、高分辨率、高自動化等優(yōu)點，并且可以評估經(jīng)過加工處理后的食品致敏蛋白、亞型、特異性肽段等，并且在檢測復雜樣品中的多個過敏原蛋白時具有優(yōu)越性，不依賴于免疫學方法中抗原與抗體的相互作用[39]。

5.1.4 基于生物傳感器對食物過敏原檢測的方法

生物傳感器可以將固定化的生物活性材料作為識別元件，通過換能器將生化反應轉變成可定量的物理或化學信號，在食品工業(yè)中可以用于食品病原體、食品添加劑及食品致敏原等的檢測[40,41]。生物傳感器具有靈敏度高、微型化等優(yōu)點，近年已有多種用于檢測食品中致敏原的生物傳感器被開發(fā)并成為食品過敏原檢測的高新技術。

5.2 體內(nèi)檢測

5.2.1 臨床人體試驗

目前臨床常用的過敏原檢測方法有：皮膚點刺試驗（SPT）、特應性斑貼試驗（APT）、皮內(nèi)試驗、血液試驗等。SPT 指的是將過敏原引入皮下，檢測與皮下肥大細胞結合的特異性IgE 抗體的產(chǎn)生。SPT 敏感性高，假陽性低，重現(xiàn)性好，對患者的不適最小，結果在15min 內(nèi)得出。APT 是指將帶過敏原的貼片貼在試驗部位，48～72h 后檢查反應。皮內(nèi)試驗是指皮內(nèi)注射過敏原，它比SPT 更敏感，但假陽性率較高，對患者的風險較高[42]。血檢通過檢測血液中的抗體來檢測過敏原，主要用于懷疑食物過敏，血液測試比皮膚測試更安全、更準確，但比皮膚測試更昂貴、更耗時[43]。

5.2.2 基于動物模型評估食物過敏原的免疫原性

食物過敏的動物模型是對過敏原研究更安全高效的方法。目前已知的動物模型有嚙齒類動物模型：小鼠、大鼠及豚鼠模型；非嚙齒類動物模型：豬、狗模型。與人類相比，豬、狗模型具有與人類相似的免疫系統(tǒng)，但是它們操作難度大，需要大量的蛋白質(zhì)給藥，敏化需要較長的給藥時間，維護成本高，而且缺乏相應的免疫試劑，因此限制性比較大[44]。而嚙齒類動物由于體積較小，繁殖周期短，因此對食物過敏進行評估時應用比較廣泛。目前，用于評估食物過敏原的嚙齒動物中，以小鼠品系應用最多，如BALB/c、C3H/HeJ、A/J、C57BL/6 及KM 小鼠等，大鼠品系有BN、SD、Wistar 等以及Hartly 豚鼠模型。它們主要作為食物過敏、皮膚過敏、過敏性哮喘等模型應用于食物過敏原的評估。

一般來說，食物過敏會使體內(nèi)Th1/Th2 免疫反應失衡，使免疫反應向Th2 方向發(fā)展，此時，Th1 型細胞因子低于正常水平，而Th2 型細胞因子高于正常值。IL-2 和干擾素γ（IFN-γ）是Th1 型細胞產(chǎn)生的主要細胞因子，IL-2 可以刺激Th1 細胞產(chǎn)生IFN-γ，IFN-γ 可以阻止抗體種類向IgE 的轉化并抑制Th2免疫應答。IL-4、IL-5、IL-13 是Th 2 型細胞產(chǎn)生的主要細胞因子，它們可以促進IgE 的轉化，誘導IgG同種型轉變?yōu)镮gG1 并刺激肥大細胞增殖，從而誘發(fā)機體全身過敏反應[45]。Th17 細胞可以促進IgE 產(chǎn)生，并且IL-17A 能夠直接在B 細胞水平上發(fā)揮其促過敏作用[46]。調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）是影響過敏反應的另一關鍵因素，它可以分泌抑制性細胞因子IL-10 和/或轉化生長因子-β（TGF-β），從而抑制效應Th1、Th2 和Th17 細胞，抑制肥大細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞，并消除過敏原特異性IgE 的產(chǎn)生[47]。肥大細胞蛋白酶-1（mMCP-1）是檢測肥大細胞脫顆粒的關鍵指標，而且血清中的IgG、IgG1 水平與Th2 免疫水平呈正相關，故在對過敏原評估時對血清中IgG、IgG1、mMCP-1 的檢測同樣重要。

例如，Zhang 等人以卵清蛋白、卵清蛋白-槲皮素共價復合物分別配合霍亂毒素為佐劑口飼BALB/c 小鼠，他們發(fā)現(xiàn)復合物能夠降低小鼠血清中IgE、IgG1、IgG、血漿組胺和mMCP-1 的水平，并顯著降低小鼠脾臟中Th2 型細胞因子IL-13、IL-4 和IL-5以及略微升高Th1 型細胞因子IFN-γ，這表明復合物可以調(diào)節(jié)Th1/Th2 免疫反應的不平衡，緩解小鼠由卵清蛋白引起的過敏反應[32]。Yang 等人對BALB/c 小鼠管飼乳酸菌處理的大豆蛋白，他們發(fā)現(xiàn)與管飼未經(jīng)過處理的大豆蛋白的小鼠相比，IFN-γ 和IL-2 和IL-10 細胞因子的分泌增加，IL-4 和IL-6 和IL-17A細胞因子的分泌減少，證明乳酸菌可以調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，維持小鼠免疫相關細胞和細胞因子的正常水平[45]。

6 總結與展望

綜上所述，蜂花粉營養(yǎng)豐富，具有極高的保健價值及開發(fā)潛力。然而，蜂花粉中過敏原的存在為蜂花粉的食用安全帶來威脅，制約行業(yè)發(fā)展。有效改善蜂花粉的致敏問題對進一步開發(fā)相關蜂花粉產(chǎn)品及提高其食用安全性至關重要。到目前為止，關于蜂花粉的致敏及脫敏/降敏機制的研究報道較少。運用合適的食品加工方式及免疫評估手段對蜂花粉致敏及脫敏/降敏機理進行深入研究對于促進行業(yè)發(fā)展是十分必要的。通過本綜述，可進一步明確植物多酚共價修飾技術在改善蜂花粉致敏性中的應用前景，為后續(xù)蜂花粉脫敏/低敏產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。