超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法快速篩查睫毛用化妝品中前列腺素F2α類(lèi)化合物

王欣然，尹偉成，王海燕，路 勇*

（1．中國(guó)食品藥品檢定研究院∕國(guó)家藥品監(jiān)督管理局化妝品研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；2．湖南省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410001）

前列腺素（PGs）是一類(lèi)由花生四烯酸衍生而來(lái)的20碳不飽和脂肪酸。其中前列腺素F2α（PGF2α）是目前最具潛力和最有效的用于治療青光眼的藥物［1］，包括比馬前列素、拉坦前列素、曲伏前列素等物質(zhì)，能夠通過(guò)增加眼內(nèi)液體的流出來(lái)降低眼壓。研究發(fā)現(xiàn)，PGF2α類(lèi)化合物除對(duì)青光眼有治療作用外，還有引起睫毛增長(zhǎng)的功效［2］。針對(duì)這一特點(diǎn)，Allergan公司研發(fā)了全球首個(gè)獲得FDA批準(zhǔn)的處方藥Latisse（含有0．03%比馬前列素）用于治療睫毛稀少癥。雖然PGF2α可使睫毛增長(zhǎng)，但同時(shí)會(huì)刺激眼部，出現(xiàn)虹膜顏色加深、眼部不適、虹膜炎等不良反應(yīng)，長(zhǎng)時(shí)間使用可能會(huì)導(dǎo)致失明［3-4］。目前，我國(guó)現(xiàn)行的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）［5］未對(duì)此類(lèi)化合物作出明確規(guī)定，《已使用化妝品原料目錄（2021年版）》［6］未包含該類(lèi)物質(zhì)，使得一些不良化妝品企業(yè)為快速增強(qiáng)自身“競(jìng)爭(zhēng)力”，鉆取法規(guī)漏洞，利用監(jiān)管薄弱的現(xiàn)狀，在睫毛用化妝品中添加PGF2α類(lèi)化合物，對(duì)消費(fèi)者的健康造成不良影響。

目前PGF2α類(lèi)化合物的檢測(cè)方法主要集中于藥品領(lǐng)域，包括熒光分光光度法［7］、高效液相色譜法［8-11］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［12-13］等。化妝品中PGF2α的測(cè)定方法主要為高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿低分辨質(zhì)譜法［14］。低分辨質(zhì)譜定量準(zhǔn)確，但只能對(duì)靶向化合物進(jìn)行分析；高分辨質(zhì)譜定性準(zhǔn)確，具有質(zhì)量范圍寬、質(zhì)量精度及分辨率高、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索等特點(diǎn)，尤其是可對(duì)無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的化合物進(jìn)行高通量快速定性篩查，目前廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥、抗生素、激素等物質(zhì)的快速篩查分析［15-18］。

針對(duì)化妝品行業(yè)的非法添加現(xiàn)狀，本課題組采用四極桿飛行時(shí)間（Q-TOF）高分辨質(zhì)譜技術(shù)建立了化妝品中激素、抗生素、抗組胺類(lèi)藥物、致敏性化合物、農(nóng)藥、麻醉類(lèi)藥物等風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的篩查平臺(tái)，用于化妝品中已知或未知風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的識(shí)別和發(fā)現(xiàn)［19］。本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF MS∕MS）對(duì)9種PGF2α類(lèi)化合物（結(jié)構(gòu)信息見(jiàn)圖1）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，獲得其色譜及質(zhì)譜響應(yīng)值，構(gòu)建了9種PGF2α類(lèi)化合物的高分辨篩查數(shù)據(jù)庫(kù)，采用空白基質(zhì)加標(biāo)對(duì)所建數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行修正，并用于市售化妝品的定性篩查，為監(jiān)管部門(mén)對(duì)化妝品中違禁組分的高通量快速篩查提供了技術(shù)支撐。

圖1 9種化合物的分子結(jié)構(gòu)Fig．1 Structures of 9 compounds

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters Xevo G2 XS四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC I Class超高效液相色譜儀、MassLynx V 4．2數(shù)據(jù)處理操作平臺(tái)、UNIFI科學(xué)信息學(xué)系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；BTV-100渦旋振蕩器（上海一恒科技有限公司）；AL 204型電子天平（美國(guó)Sartorius公司）；G10型離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

比馬前列素（純度99．9%）、曲伏前列素（純度99．4%）、他氟前列素（純度97．2%）、他氟乙酰胺（純度98．2%）、拉坦前列素（純度99．0%）、比馬前列素酸甲基酯（純度99．9%）、氯前列醇異丙基酯（純度99．9%）、15-酮-曲伏前列素（純度94．6%）、比馬酰胺（純度99．9%）（以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司）；乙腈、甲酸銨（質(zhì)譜純，F(xiàn)isher公司）；甲酸（質(zhì)譜純，Honeywell公司）；屈臣氏飲用水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制準(zhǔn)確稱(chēng)取各PGF2α標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用乙腈溶解并定容至100 mL，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為100 μg∕mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密吸取上述各PGF2α標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，用乙腈稀釋定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 μg∕mL的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)中間溶液適量，用50%乙腈溶液稀釋得到比馬前列素、他氟乙酰胺、拉坦前列素、比馬前列素酸甲基酯、氯前列醇異丙基酯、15-酮-曲伏前列素、比馬酰胺質(zhì)量濃度為5 ～ 100 ng∕mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，曲伏前列素、他氟前列素質(zhì)量濃度為50 ～ 1 000 ng∕mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品前處理準(zhǔn)確稱(chēng)取0．2 g樣品（精確至0．001 g），置于15 mL離心管中，加入乙腈約8 mL，渦旋1 min充分混勻后，超聲提取20 min，放置至室溫后定容至10 mL，搖勻。以8 000 r∕min離心10 min，上清液經(jīng)0．22 μm濾膜過(guò)濾（可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行稀釋?zhuān)?，待測(cè)。

1.2.3 液相色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2．1 mm × 100 mm，1．7 μm）；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：2 mmol∕L甲酸銨水溶液（含0．05%甲酸）（A）-乙腈（B）；流速：0．35 mL∕min；進(jìn)樣量：3．0 μL；梯度洗脫程序：0 ～ 0．5 min，2% B；0．5 ～ 2．0 min，2% ～ 30% B；2．0 ～ 6．0 min，30% ～ 40%B；6．0 ～ 13．0 min，40% ～ 70% B；13．0 ～ 16．0 min，70% ～ 98% B；16．0 ～ 18．0 min，98% B；18．0 ～18．5 min，98% ～ 2% B；18．5 ～ 20．0 min，2% B。

1.2.4 質(zhì)譜條件電噴霧正離子模式；毛細(xì)管電壓為1 kV；離子源溫度為120 ℃；采樣錐電壓為20 V；脫溶劑溫度為550 ℃；錐孔氣流速為50 L∕h；脫溶劑氣流速為1 000 L∕h；MS1碰撞能量為4 eV；MS2碰撞能量為15 ～ 50 eV；MS1、MS2質(zhì)量掃描范圍均為m∕z50．0 ～ 1 200．0；實(shí)時(shí)校正液為亮氨酸腦啡肽（200 pg∕μL）。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇根據(jù)市面常見(jiàn)促進(jìn)睫毛增長(zhǎng)的產(chǎn)品基質(zhì)類(lèi)型，選用液體類(lèi)基質(zhì)樣品對(duì)前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化。考察了甲醇、50%甲醇、乙腈、50%乙腈對(duì)9種PGF2α類(lèi)化合物的提取效率，結(jié)果顯示，上述溶劑對(duì)樣品的提取結(jié)果無(wú)顯著差異。考慮到乙腈與流動(dòng)相體系一致，故選擇乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 超聲提取時(shí)間的選擇以乙腈作為提取溶劑，采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方式考察超聲提取時(shí)間對(duì)回收率的影響。結(jié)果表明，超聲提取時(shí)間為10 ～ 20 min時(shí)，9種目標(biāo)物的回收率逐步增加；超聲提取20 min后，9種目標(biāo)物的回收率無(wú)明顯差異。故選擇超聲提取時(shí)間為20 min。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較了水-乙腈、甲酸銨水溶液-乙腈、甲酸∕甲酸銨水溶液-乙腈3種流動(dòng)相對(duì)9種PGF2α類(lèi)化合物分離測(cè)定結(jié)果的影響。由于在流動(dòng)相中加入質(zhì)子和緩沖鹽能夠調(diào)節(jié)化合物的離子強(qiáng)度，得到較好的峰形及響應(yīng)，為保證所有化合物均可出峰，選擇甲酸∕甲酸銨水溶液-乙腈作為流動(dòng)相以提高化合物的離子化效率與響應(yīng)強(qiáng)度。考察了水相中加入不同濃度（1、2、5 mmol∕L）甲酸銨水溶液以及不同體積分?jǐn)?shù)（0．01%、0．05%、0．1%）甲酸對(duì)分離結(jié)果的影響，經(jīng)比較，最終確定選用2 mmol∕L甲酸銨水溶液（含0．05%甲酸）-乙腈作為流動(dòng)相。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用電噴霧正負(fù)離子模式掃描，對(duì)9種PGF2α類(lèi)化合物進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。結(jié)果顯示，正離子模式下各化合物的響應(yīng)強(qiáng)度高于負(fù)離子模式，因此選用正離子模式建立PGF2α類(lèi)化合物的高通量篩查數(shù)據(jù)庫(kù)。當(dāng)MS1碰撞能量為4 eV時(shí)，各化合物均能獲得響應(yīng)值良好的母離子，多數(shù)化合物均能得到［M + H］+，其中部分化合物（比馬前列素、比馬前列素酸甲基酯、氯前列醇異丙基酯以及比馬酰胺）的［M + H］+信號(hào)響應(yīng)值較弱，產(chǎn)生信號(hào)響應(yīng)值較好的［M + H-H2O］+。以比馬前列素為例，響應(yīng)值較好的［M + H-H2O］+是由于比馬前列素分子結(jié)構(gòu)中含有羥基，因而易脫水得到［M + H-H2O］+離子（見(jiàn)圖2）。根據(jù)各化合物的一級(jí)質(zhì)譜離子響應(yīng)，選擇相應(yīng)的母離子。

圖2 比馬前列素［M + H］+、［M + Na］+、［M + H-H2O］+的提取離子流圖Fig．2 ［M + H］+，［M + Na］+ and ［M + H-H2O］+extracted ion chromatogram of bimatoprost

在確定MS1碰撞能量的條件下，對(duì)二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置MS2碰撞能量為15 ～ 50 eV，采集數(shù)據(jù)信息。以拉坦前列素為例，母離子脫去羥基產(chǎn)生m∕z379．263 1碎片離子，酯鍵斷裂進(jìn)而產(chǎn)生m∕z319．206 1碎片離子，進(jìn)一步在不同位置斷裂烴鍵產(chǎn)生m∕z209．132 5、131．085 1、189．127 3等碎片離子，而后逐級(jí)脫去1個(gè)碳產(chǎn)生m∕z105．069 8、91．054 2碎片離子。其中某些碎片離子在其他PGF2α類(lèi)化合物的二級(jí)碎片圖譜中均可發(fā)現(xiàn)，表明化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似含有相同基本母核的PGF2α類(lèi)化合物的裂解規(guī)律類(lèi)似，從而產(chǎn)生相同的特征碎片。以拉坦前列素為例，推導(dǎo)質(zhì)譜中化學(xué)鍵可能的斷裂位置與裂解途徑如圖3所示。

圖3 拉坦前列素的可能裂解途徑Fig．3 Possible mass spectrometric cleavage pathways of latanoprost

2.4 PGF2α篩查數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

在優(yōu)化條件下，采用UPLC-Q-TOF MS∕MS對(duì)9種PGF2α類(lèi)化合物進(jìn)行MSE數(shù)據(jù)采集。收集并整理化合物的名稱(chēng)、分子式、結(jié)構(gòu)式、CAS號(hào)、保留時(shí)間、加合方式、精確分子量、碎片離子信息等參數(shù)，建立9種化合物的高通量篩查數(shù)據(jù)庫(kù)（表1），用于化妝品中PGF2α類(lèi)化合物的快速篩查。考慮到促進(jìn)睫毛增長(zhǎng)的化妝品多為液態(tài)水基類(lèi)型，采用液態(tài)水基類(lèi)化妝品樣品進(jìn)行空白加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，對(duì)高通量篩查數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)歐盟96∕23∕EC指令［20］要求采用質(zhì)譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行確認(rèn)最少需要4個(gè)識(shí)別點(diǎn)，結(jié)果顯示本文9種化合物均滿(mǎn)足要求，所建立的數(shù)據(jù)庫(kù)滿(mǎn)足化妝品高通量篩查分析要求。

表1 9種PGF2α類(lèi)化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)信息Table 1 Database informations of 9 PGF2α compounds

2.5 線(xiàn)性范圍、檢出限與定量下限

取“1．2．1”制備的9種PGF2α類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液適量，按上述色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，ng∕mL），對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。以信噪比S/N= 3時(shí)計(jì)算9種化合物的方法檢出限（LOD），以S/N= 10時(shí)計(jì)算方法定量下限（LOQ）。表2結(jié)果顯示，本方法9種化合物的檢出限為0．075 ～ 0．75 μg∕g，定量下限為0．25 ～ 2．5 μg∕g，滿(mǎn)足對(duì)化妝品進(jìn)行快速定性篩查的日常檢測(cè)需求。9種PGF2α類(lèi)化合物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0．99。

表2 PGF2α類(lèi)化合物的線(xiàn)性關(guān)系、檢出限與定量下限Table 2 Linear relations，LODs and LOQs of PGF2α compounds

2.6 實(shí)際樣品篩查

采用所建立的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)48批睫毛用化妝品進(jìn)行篩查分析，結(jié)果顯示1批樣品檢出拉坦前列素，含量為4．89 μg∕g；4批樣品檢出比馬前列素，含量分別為122．40、157．43、142．78、92．01 μg∕g。所測(cè)陽(yáng)性樣品中目標(biāo)化合物與譜庫(kù)中PGF2α數(shù)據(jù)信息比對(duì)，保留時(shí)間偏差小于0．1 min，質(zhì)量偏差小于0．6 mDa，母離子和5個(gè)碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)以及結(jié)構(gòu)比對(duì)一致，二級(jí)質(zhì)譜圖對(duì)比如圖4所示。結(jié)果表明，所建立的篩查數(shù)據(jù)庫(kù)能夠快速識(shí)別可疑風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)。

圖4 比馬前列素與拉坦前列素在溶劑（A、B）和化妝品樣品（C、D）中的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig．4 Secondary MS spectra of bimatoprost and latanoprost in solvent（A，B） and cosmetics sample（C，D）

3 結(jié) 論

本研究建立了超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜高通量快速篩查睫毛用化妝品中PGF2α的方法，并結(jié)合各類(lèi)化合物的色譜質(zhì)譜采集信息，構(gòu)建了9種PGF2α的高分辨篩查數(shù)據(jù)庫(kù)。所建立的數(shù)據(jù)庫(kù)能夠用于化妝品中PGF2α的定性篩查分析，靈敏度高，分析速度快，完善補(bǔ)充了化妝品風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的篩查數(shù)據(jù)庫(kù)，可為監(jiān)管部門(mén)對(duì)化妝品中違禁組分的高通量快速篩查提供技術(shù)支撐。