基于羧基化聚吡咯-氯化血紅素和點(diǎn)觸發(fā)鏈置換反應(yīng)信號(hào)放大的電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物中CaMV35S序列

翟應(yīng)惠，夏子豪，張鴻雁，葉永康，2*，操小棟，鄭海松，李云飛*

（1．合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2．北方民族大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021；3．合肥海關(guān)技術(shù)中心，安徽 合肥 230022）

在過去20年，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了極大的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積也逐年增加［1］，我國轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化駛?cè)搿翱燔嚨馈?，轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化布局已覆蓋全國。同時(shí)，為確保生物安全、生態(tài)安全及滿足人們對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的關(guān)切，不僅需要制訂一系列轉(zhuǎn)基因作物∕產(chǎn)品的安全評(píng)價(jià)程序、方法和管理措施［2］，也對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求［3］。

目前，針對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)主要有兩大類，即針對(duì)轉(zhuǎn)基因作物∕產(chǎn)品中特定蛋白質(zhì)成分［3］和DNA特定序列進(jìn)行檢測(cè)［4］。當(dāng)前針對(duì)轉(zhuǎn)基因作物∕食品中常見的外源基因花椰菜病毒35S（CaMV35S）啟動(dòng)子［4］和根癌農(nóng)桿菌終止子（TNOS）［5］檢測(cè)的DNA生物傳感器已成為篩查轉(zhuǎn)基因作物的重要途經(jīng)。其中，DNA電化學(xué)生物傳感器因具有快速、簡便和成本低廉等特點(diǎn)，成為轉(zhuǎn)基因作物∕產(chǎn)品檢測(cè)方法研究的熱點(diǎn)之一［6-7］。

納米聚合物聚吡咯（PPy）因具有良好的導(dǎo)電性、熱穩(wěn)定性、納米模擬酶活性且易于合成等特性，在電化學(xué)傳感器中得到了較為廣泛的應(yīng)用［8］。氯化血紅素（Hemin）是血紅蛋白家族的“活躍分子”，其性質(zhì)穩(wěn)定，催化活性與過氧化物酶類似［9-10］。因此，基于Hemin的模擬過氧化物酶活性而設(shè)計(jì)的電化學(xué)DNA傳感器亦越來越受到關(guān)注［11-12］。

點(diǎn)觸發(fā)鏈置換反應(yīng)（TSDR）是通過核酸輔助擴(kuò)增來改善生物傳感器性能的技術(shù)，具有靈敏度高、操作便捷和穩(wěn)定性高的特點(diǎn)［13］。通過觸發(fā)反應(yīng)的單鏈DNA觸發(fā)鏈置換反應(yīng)，進(jìn)而暴露出另一段可與其它模板互補(bǔ)的單鏈區(qū)域，并通過引入具有更多的堿基互補(bǔ)配對(duì)數(shù)的模板鏈，置換目標(biāo)DNA，進(jìn)一步引發(fā)新的點(diǎn)觸發(fā)鏈置換反應(yīng)，從而起到信號(hào)放大的作用［13］。基于該技術(shù)開發(fā)的電化學(xué)生物傳感方法可用于靈敏檢測(cè)艾滋病毒（HIV）相關(guān)的DNA［14］及microRNA-21［15］。

本研究制備了Hemin復(fù)合的羧基化聚吡咯納米復(fù)合物（cPPy-hemin），并以其為標(biāo)記物標(biāo)記由信號(hào)DNA鏈（Ps）、模板鏈（Ts）和輔助鏈（As）結(jié)合所形成的DNA雙鏈體結(jié)構(gòu)，利用cPPy-hemin對(duì)底物H2O2的模擬酶催化特性和TSDR信號(hào)放大作用，建立了一種靈敏檢測(cè)CaMV35S的電化學(xué)生物傳感器。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

吡咯（Py，純度＞ 99．7%），巰基乙醇（MCH，99%），三（2-羧乙基）膦（TCEP）氯，三（羥甲基）氨基甲烷（Tris，99%），氯化血紅素（Hemin，95%），聚乙烯醇（72．5% ～ 74．5%，4．2 ～ 5．0 mPa∕s）和氯金酸（三水合物，99%）購自上海阿拉丁生物科技股份有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，90%）及乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA，99%）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；dNTP mixture、DNA聚合酶（Taq DNApolymerase）購自生工生物工程（上海）有限公司。實(shí)驗(yàn)所用緩沖溶液為：DNA儲(chǔ)存緩沖溶液（10 mmol∕L Tris-HCl，1．0 mmol∕L EDTA，pH 7．4），DNA固定緩沖液（10 mmol∕L Tris-HCl，1．0 mmol∕L EDTA，1．0 mmol∕L TCEP，0．1 mol∕L NaCl，1．0 mmol∕L MgCl2），DNA雜交緩沖液（10 mmol∕L Tris-HCl，1．0 mmol∕L EDTA，0．1 mol∕L NaCl，1．0 mmol∕L MgCl2），電化學(xué)測(cè)試緩沖溶液（0．1 mol∕L磷酸鹽緩沖溶液，pH 8．0），CTAB緩沖液（0．1 mol∕L Tris-HCl，20 mmol∕L EDTA，1．4 mol∕L NaCl，2% CTAB）。實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。實(shí)驗(yàn)所用的DNA序列由生工生物工程（上海）有限公司合成并純化，序列如下：

捕獲探針（Cs）：SH-TTTT AGG AGC GAC TAA。

CaMV35S序列（tDNA）：ATT GTG CGT CAT CCC TTA CGT C。

模板鏈序列（Ts）：GAC GTAA GGG ATG ACG CAC AAT CAGGC AGG AGC GAC TAA。

輔助鏈序列（As）：TTTT TTTT TTTT TTTT A GCCTG ATT GTG CGT CAT CCC T。

信標(biāo)鏈序列（Ps）：NH2-TTT TTT TTT TTT TTA GTC GCT CCT。

綜上所述，循證護(hù)理系列培訓(xùn)能夠在臨床護(hù)理實(shí)踐工作中發(fā)揮重要作用，對(duì)護(hù)理人員的護(hù)理工作提高有促進(jìn)作用，對(duì)促進(jìn)我院護(hù)患關(guān)系的發(fā)展有著重要作用。

燃料鏈序列（Fs）：TTA GTC GCT CCT GCC TGA TTG TGC GTC ATC CCT。

單堿基錯(cuò)配序列（Mis1）：ATT GTG CGT CAT CCC TTA CTT C。

非互補(bǔ)DNA序列（NOs）：GCA TGA CGT TAT TTA TGA GAG A。

非互補(bǔ)DNA序列（FMV）：A TCT TTG CAA TAA AGG CAA AGA。

正向引物：CTT CCT TTC TCG CCA CGT T。

反向引物：CTT AAT AAC ACA TTG CGG ACG TT。

1.2 儀器與方法

材料的形貌表征在SU8020場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立公司）上進(jìn)行。材料的成分及元素分析在ESCALAB250Xi（美國賽默飛世爾科技公司）和X射線光電子能譜儀（XPS）上進(jìn)行。電化學(xué)表征及測(cè)試在配有三電極體系的CHI832D電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）上進(jìn)行，以直徑為3 mm的修飾玻碳電極（GCE）為工作電極，Ag∕AgCl（飽和KCl）電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。采用電化學(xué)阻抗譜（EIS）表征修飾的GCE。EIS實(shí)驗(yàn)在含5．0 mmol∕L ［Fe（CN）6］3-∕4-的0．1 mol∕L KCl溶液中進(jìn)行，頻率范圍為1 ～ 10 000 kHz。采用計(jì)時(shí)電流法（i-t）測(cè)定不同濃度的目標(biāo)CaMV35S基因，測(cè)定電位為-0．4 V，緩沖溶液為0．1 mol∕L pH 7．0的PBS，H2O2濃度為2 mmol∕L。

1.3 cPPy-hemin的制備

1.4 Ts/As/Ps-cPPy-hemin納米信標(biāo)的制備

利用信標(biāo)鏈序列Ps上的—NH2與cPPy-hemin中—COOH之間的共價(jià)鍵合反應(yīng)，制備基于cPPyhemin的Ts∕As∕Ps DNA雙鏈結(jié)構(gòu)納米信標(biāo)。具體方法如下：將含Ts、As、Ps的核苷酸鏈混合溶液（濃度均為30 μmol∕L，各100 μL）加熱至95 ℃，保持2 min后自然冷卻至室溫，形成Ts∕As∕Ps三鏈DNA雙鏈體結(jié)構(gòu)；將含有10 μmol∕L Ts∕As∕Ps DNA雙鏈體結(jié)構(gòu)、10 mg∕mL EDC、5 mg∕mL NHS和2 mg∕mL cPPy-hemin的混合溶液在輕微振蕩下反應(yīng)2 h，離心去除未結(jié)合的DNA，將所制備的Ts∕As∕Ps-cPPy-hemin分散于雜交緩沖液中。

1.5 DNA生物傳感器的制備

GCE依次用1．0、0．3、0．05 μm氧化鋁漿拋光，先后用硝酸（1∶1）、乙醇和水進(jìn)行超聲清洗，并在室溫下氮?dú)獯蹈蓚溆谩NA生物傳感器的構(gòu)建步驟為：將預(yù)處理的GCE浸入5．0 mL含3．0 mmol∕L HAuCl4的KNO3（0．1 mol∕L）溶液中，在-0．2 V恒定電位下電化學(xué)沉積70 s以獲得電沉積AuNPs修飾的GCE（AuNPs∕GCE）。然后，將5 μL 1 μmol∕L的捕獲探針Cs滴加至AuNPs∕GCE，頂部罩上離心管密封，并在4 ℃冰箱中放置12 h后，用0．1% SDS溶液和10 mmol∕L Tris-HCl（pH 7．4）溶液沖洗電極以除去未結(jié)合的捕獲探針，所得修飾電極記為Cs∕AuNP∕GCE。接著，該修飾電極用5 μL MCH（1 mmol∕L）封閉30 min（頂部罩上離心管密封），以消除非特異性吸附。最后，用10 mmol∕L Tris-HCl（pH 7．4）溶液和水沖洗電極，得到MCH∕Cs∕AuNPs∕GCE。

1.6 電化學(xué)測(cè)量

將不同濃度的目標(biāo)CaMV35S與10 μL Fs（10 μmol∕L）和10 μL上述制備的Ts∕As∕Ps-cPPy-hemin懸浮液混合，用雜交緩沖液稀釋至50 μL；將MCH∕Cs∕AuNPs∕GCE插入上述混合液中，在37 ℃條件下溫育90 min，充分淋洗后采用計(jì)時(shí)電流法進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。

1.7 樣品的制備與檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因大豆中的CaMV35S片段用CTAB法提?。簩?．1 g轉(zhuǎn)基因大豆置于研缽中用液氮研磨后放入5 mL離心管中，加入600 μL CTAB裂解緩沖液，混勻后65 ℃水浴1 h，期間不斷晃動(dòng)。待材料冷卻至室溫后在10 000 r∕min下離心10 min，上清液加入600 μL氯仿-異戊醇混合液（24∶1，體積比）進(jìn)行抽提，清液中再加入400 μL異丙醇，-20 ℃條件下預(yù)冷后，10 000 r∕min離心10 min，吸取上清液，用75%乙醇清洗沉淀3次，室溫下晾干后加入40 μL TE溶解，加入RNase酶37 ℃溫育30 min后，所得溶液即為大豆DNA溶液。

PCR反應(yīng)總體積為50 μL，包括25 μL PCR Mix，5 μL提取的DNA，1 μL正反向引物（10 μmol∕L），18 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min（DNA變形，雙鏈解開），采用以下三步進(jìn)行30個(gè)循環(huán)：94 ℃45 s（DNA變性，雙鏈解開），64 ℃ 45 s（引物退火），72 ℃ 1 min（DNA鏈延伸），然后在72 ℃下延伸10 min。最后，將5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，通過凝膠成像鑒定PCR產(chǎn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米材料與傳感器組裝的表征

采用TEM表征cPPy-hemin的形貌，結(jié)果如圖1A所示。可以看出，cPPy-hemin納米顆粒呈球狀均勻分布，粒徑約為50 nm。對(duì)其進(jìn)行XPS分析（圖1B）發(fā)現(xiàn)，譜圖中位于723．44、532．22、399．80、284．78 eV處的光電子峰，分別對(duì)應(yīng)于Fe2p、O1s、N1s及C1s的結(jié)合能［18］。其中，材料中的Fe2p光電子峰來自復(fù)合物中Hemin的鐵活性中心。XPS的表征結(jié)果表明cPPy-hemin納米復(fù)合物已成功合成。

圖1 cPPy-hemin的TEM圖（A）及XPS表征（B）Fig．1 TEM image（A） and XPS characterization（B） of cPPy-hemin

電化學(xué)DNA生物傳感器的修飾過程通過EIS進(jìn)行表征，其半圓直徑可用于表示電荷傳遞阻抗的大小。圖2分別為裸GCE、AuNPs∕GCE、Cs∕AuNPs∕GCE、MCH∕Cs∕AuNPs∕GCE和Ps-cPPy-heminMCH∕Cs∕AuNPs∕GCE在含0．1 mol∕L KCl的5 mmol∕L［Fe（CN）6］3-∕4-溶液中的EIS曲線。由圖可知，電沉積AuNPs后，AuNPs∕GCE（曲線b）的阻抗較裸GCE（曲線a）小，主要是由于AuNPs有較大的比表面積和優(yōu)良的導(dǎo)電性，極大地改善了電極的電子傳輸性能；當(dāng)Cs通過Au-S鍵組裝到AuNPs∕GCE后，Cs∕AuNPs∕GCE的阻抗（曲線c）較AuNPs∕GCE大幅增大，且當(dāng)用MCH對(duì)Cs∕AuNPs∕GCE上未結(jié)合的活性位點(diǎn)進(jìn)行封閉后，所組裝的MCH∕Cs∕AuNPs∕GCE的阻抗進(jìn)一步增大（曲線d）。這主要是由于組裝在電極表面的Cs和MCH阻止了［Fe（CN）6］3-∕4-向電極表面擴(kuò)散，降低了電子傳輸 速 率。最 后，當(dāng)MCH∕Cs∕AuNPs∕GCE在 目 標(biāo)CaMV35S（100 pmol∕L）和Ts∕As∕Ps-cPPy-hemin混合溶液中溫育90 min后，修飾電極的阻抗再次降低（曲線e），表明電子在該修飾電極上傳輸速率較快。這是由于此時(shí)電極表面形成了DNA雙鏈-cPPyhemin納米結(jié)構(gòu)，即Cs-Ps-cPPy-hemin納米結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中的雙鏈DNA的電子傳遞速率比單鏈DNA高［19］，同時(shí)納米結(jié)構(gòu)中的cPPy-hemin也可提高電子傳遞速率。

圖2 不同修飾電極的電化學(xué)阻抗譜Fig．2 Electrochemical impedance curves of different modified GCEs

2.2 CaMV35S基因傳感器的原理及可行性分析

CaMV35S基因傳感器對(duì)目標(biāo)的靈敏檢測(cè)主要基于cPPy-hemin對(duì)H2O2的模擬過氧化物酶活性及TSDR目標(biāo)放大策略。該傳感器對(duì)目標(biāo)CaMV35S的檢測(cè)是通過傳感界面結(jié)合Ps-cPPy-hemin后，所形成的納米結(jié)構(gòu)中cPPy-hemin對(duì)H2O2的催化還原產(chǎn)生的電信號(hào)實(shí)現(xiàn)，其電信號(hào)大小和電極表面所結(jié)合的cPPy-hemin的量有關(guān)。如圖3A所示，當(dāng)目標(biāo)CaMV35S觸發(fā)TSDR后，所釋放的信標(biāo)Ps-cPPyhemin隨著CaMV35S濃度的增加，通過Cs-Ps雜交結(jié)合在電極表面的cPPy-hemin亦越多（圖3B），因而其催化H2O2還原的電信號(hào)越大。圖4A為傳感器在不同條件下對(duì)檢測(cè)體系中H2O2的計(jì)時(shí)電流法安培響應(yīng)曲線。當(dāng)不存在Fs（圖4A曲線a）或目標(biāo)DNA（圖4A曲線b）時(shí)，TSDR過程無法進(jìn)行，因而無法釋放出信號(hào)標(biāo)簽Ps-cPPy-hemin，導(dǎo)致H2O2在電極表面的還原信號(hào)低。然而，當(dāng)使用100 pmol∕L CaMV35S觸發(fā)TSDR后，釋放的Ps-cPPy-hemin與電極表面的Cs通過雜交反應(yīng)相結(jié)合，導(dǎo)致H2O2的催化還原電流信號(hào)提高（圖4A曲線d）。同時(shí)，通過比較采用TSDR策略及夾心策略（圖4A曲線c）所記錄的H2O2催化還原電流信號(hào)的大小，評(píng)估了TSDR過程對(duì)傳感系統(tǒng)信號(hào)的放大作用。從圖中可明顯看出，在100 pmol∕L CaMV35S存在下，TSDR過程極大地放大了傳感界面上H2O2的電催化還原信號(hào)，起到了很好的信號(hào)放大作用。

圖3 電化學(xué)生物傳感器的組裝過程與策略Fig．3 Stepwise process of the fabrication and strategy of the proposed electrochemical biosensor

圖4 CaMV35S基因傳感器的原理及可行性驗(yàn)證Fig．4 The principle and the feasibility of the fabricated CaMV35S genosensor

TSDR的過程也通過凝膠電泳圖像進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖4B所示。圖中泳道1、2、3分別為Ts、As和Ps三條單鏈的電泳圖，泳道4為由Ts、As和Ps三條單鏈雜交形成的Ts∕As∕Ps雙鏈結(jié)構(gòu)。由圖可看出，該雙鏈結(jié)構(gòu)的遷移速率明顯低于其它單鏈，表明Ts、As和Ps鏈雜交形成了DNA雙鏈體。圖中泳道5和6分別為目標(biāo)CaMV35S序列和Fs的電泳條帶，當(dāng)在Ts∕As∕Ps雙鏈結(jié)構(gòu)加入目標(biāo)CaMV35S和Fs充分混合90 min后，其電泳條帶（泳道7）中出現(xiàn)兩條明顯的條帶，其中一條對(duì)應(yīng)于Ts∕As∕Ps雙鏈結(jié)構(gòu)，而另一條新獲的亮帶則對(duì)應(yīng)于Ts∕Fs雙鏈DNA條帶。這表明，目標(biāo)CaMV35S的存在觸發(fā)了TSDR過程，導(dǎo)致模板鏈Ts與燃料鏈Fs結(jié)合形成了雙鏈。該結(jié)果表明在目標(biāo)CaMV35S存在下可成功進(jìn)行TSDR過程。

2.3 CaMV35S基因傳感器的分析性能

為使CaMV35S電化學(xué)傳感器具有最優(yōu)的分析性能，分別對(duì)Ts∕As∕Ps雙鏈結(jié)構(gòu)的濃度、檢測(cè)緩沖液的pH值、TSDR反應(yīng)時(shí)間及雜交溫度等影響因素進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖5A ～ D所示。由圖可知，CaMV35S傳感器的最優(yōu)檢測(cè)條件為：Ts∕As∕Ps雙鏈結(jié)構(gòu)的濃度為10 μmol∕L，緩沖溶液pH值為7．0，TSDR反應(yīng)時(shí)間及雜交溫度分別為90 min和37 ℃。

圖5 CaMV35S基因傳感器檢測(cè)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化Fig．5 Optimization of experimental parameters

在上述最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，采用制備的傳感器對(duì)不同濃度的CaMV35S序列進(jìn)行檢測(cè)。如圖6A所示，傳感器上H2O2的還原電流隨著目標(biāo)物濃度的增大而增大，且電流變化值與CaMV35S濃度（1．0 × 10-14～1．0 × 10-9mol∕L）的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系（圖6B），回歸方程為ΔI（μA） = 0．042 4 + 0．686 lgc（mol∕L），相關(guān)系數(shù)（r2）為0．998。傳感器對(duì)目標(biāo)CaMV35S的檢出限（S∕N= 3）為3．2 × 10-15mol∕L。表1列出了該傳感器與其它CaMV35S傳感器的性能數(shù)據(jù)。本文制備的傳感器表現(xiàn)出較寬的線性范圍和較低的檢出限，這可歸因于cPPy-hemin的優(yōu)良模擬酶活性及TSDR的信號(hào)放大作用。

表1 不同CaMV35S生物傳感器性能的比較Table 1 Comparison of analytical performance of CaMV35S biosensors

圖6 CaMV35S基因傳感器對(duì)不同濃度CaMV35S的檢測(cè)Fig．6 Detection of CaMV35S using the fabricated genosensor

2.4 CaMV35S傳感器的選擇性、重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

通過比較CaMV35S傳感器對(duì)其它DNA序列（FMV基因序列、NOs基因序列和單堿基錯(cuò)配Mis1）與對(duì)目標(biāo)CaMV35S的電化學(xué)響應(yīng)電流的大小，對(duì)其選擇性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果如圖7A所示。由圖可知，傳感器對(duì)目標(biāo)CaMV35S（100 pmol∕L）的響應(yīng)電流明顯高于對(duì)其它序列（分別為1 nmol∕L）的響應(yīng)電流。此外，傳感器對(duì)濃度分別為1 nmol∕L的其它DNA序列與100 pmol∕L CaMV35S混合液進(jìn)行檢測(cè)后，所得的響應(yīng)信號(hào)為100 pmol∕L CaMV35S的110%。上述結(jié)果表明該傳感器具有良好的選擇性。

采用相同方法分別制備6個(gè)傳感器，并將其用于檢測(cè)100 pmol∕L目標(biāo)CaMV35S，測(cè)得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2．4%（圖7B）。將傳感器放置冰箱4 ℃保存3、7、14 d后，在相同條件下測(cè)定，發(fā)現(xiàn)傳感器對(duì)100 pmol∕L目標(biāo)CaMV35S的響應(yīng)信號(hào)分別為最初信號(hào)（0 d）的96．9%、91．8%和88．2%（圖7C）。以上結(jié)果表明傳感器具有較好的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性。

圖7 傳感器的選擇性（A）、重現(xiàn)性（B）及穩(wěn)定性（C）Fig．7 Selectivity（A），reproducibility（B） and stability（C） of the fabricated biosensor

2.5 實(shí)際樣品中CaMV35S序列的檢測(cè)

為評(píng)估該CaMV35S基因傳感器實(shí)際應(yīng)用的可行性，采用計(jì)時(shí)電流法對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆中的CaMV35S基因片段進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆中總DNA進(jìn)行提取后，以其為模板，PCR擴(kuò)增后得到轉(zhuǎn)基因大豆中CaMV35S基因片段的PCR產(chǎn)物，其PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳如圖8A所示。由該圖可看出，當(dāng)以轉(zhuǎn)基因大豆DNA提取物為模板，但未使用引物（泳道2）及非轉(zhuǎn)基因DNA提取物為模板（泳道3）時(shí)，電泳圖像中并未觀察到明顯的條帶。而以轉(zhuǎn)基因組DNA為模板，且在引物存在條件下（泳道4），圖中可觀察到250 ～ 500 bp處存在明顯的條帶（442 bp）。電泳結(jié)果表明，以轉(zhuǎn)基因大豆中的DNA提取物為模板成功擴(kuò)增了CaMV35S基因片段長度為442 bp的PCR產(chǎn)物。隨后，以制備的CaMV35S基因傳感器對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆DNA提取物、轉(zhuǎn)基因大豆DNA提取物（有∕無引物條件）的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖8B所示。由插圖可明顯看出，傳感器對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆的PCR產(chǎn)物無明顯的響應(yīng)信號(hào)，而對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆DNA提取物（有∕無引物）的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均有響應(yīng)，且對(duì)有引物存在條件下的PCR產(chǎn)物響應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)，計(jì)算得到該P(yáng)CR產(chǎn)物的濃度為2．83 × 10-10mol∕L。結(jié)果證明，該傳感器能區(qū)分轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因作物，可用于實(shí)際樣品中CaMV35S的檢測(cè)。

圖8 傳感器對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆中CaMV35S基因片段的檢測(cè)Fig．8 Detection of CaMV35S in genetically modified soybean

3 結(jié) 論

本研究利用具有優(yōu)良過氧化物模擬酶活性的cPPy-hemin作為納米信標(biāo)，結(jié)合TSDR循環(huán)擴(kuò)增的信號(hào)放大策略，建立了一種靈敏檢測(cè)特定轉(zhuǎn)基因序列的電化學(xué)生物傳感方法。在優(yōu)化條件下，通過記錄該基因傳感器上cPPy-hemin對(duì)H2O2的催化所產(chǎn)生的電流信號(hào)變化，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)CaMV35S序列的靈敏檢測(cè)。該傳感器具有良好的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，可直接區(qū)分未經(jīng)PCR擴(kuò)增的非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因大豆。