指紋圖譜技術(shù)在重樓質(zhì)量控制中的應(yīng)用

柯昌虎，馮協(xié)和，潘長(zhǎng)江，李志浩

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院，湖北 十堰 442008； 2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖北 十堰 442000)

0 引 言

重樓(Paridis Rhizoma)為百合科植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖[1]，是我國(guó)重要的藥用資源，是云南白藥系列藥等200余種中成藥的主要成分之一[2]，含有甾體皂苷、三萜、黃酮等成分[3-6]，具有抗腫瘤[4]、抗氧化[7]、抗菌[8]、抗炎[9]、抗衰老[10]等多重藥理作用，對(duì)多種疾病均有療效。重樓為多年生草本植物，資源再生緩慢，人工種植尚不能滿足市場(chǎng)需求。大量非藥典規(guī)定的重樓植物基源品種的產(chǎn)品充斥商品市場(chǎng)，不同產(chǎn)地、不同采收期的重樓品質(zhì)差異大[11]，質(zhì)量參差不齊，常規(guī)的鑒別手段難以將其區(qū)分出來。

指紋圖譜是一種可以鑒別中藥材真?zhèn)?、評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量?jī)?yōu)劣、區(qū)分物種屬性和確保其一致性和穩(wěn)定性的綜合性分析技術(shù)[12]，具備專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性高等指紋特性，可以描述出中藥復(fù)雜體系的整體特征，反映出復(fù)雜組分之間的相互作用，體現(xiàn)出不同產(chǎn)地、不同采收時(shí)期、不同批次中藥的共同特點(diǎn)和特異性，量化分析出中藥多層次的宏觀質(zhì)量信息，在多組分定量、質(zhì)量控制、活性成分篩選、指紋功效關(guān)系研究等方面的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)明顯[13-14]，可為中藥材、中成藥、中藥制劑等提供一種綜合性和可量化的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，并收錄于2020版《中國(guó)藥典》一部中。本研究就指紋圖譜在重樓中的研究成果進(jìn)行綜述。

1 色譜指紋圖譜

1.1 高效液相色譜

高效液相色譜(HPLC)兼有定性和定量作用，廣泛應(yīng)用于中藥材質(zhì)量分析及控制中，選擇性好，重現(xiàn)性和靈敏度高，應(yīng)用覆蓋廣，且色譜柱能夠反復(fù)多次利用，已成為指紋圖譜中使用較多的方法之一[15]。中藥HPLC可根據(jù)不同藥物成分的特點(diǎn)選擇色譜條件，搭配不同的色譜柱和檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)藥材產(chǎn)地、優(yōu)劣、真?zhèn)蔚膮^(qū)分與鑒別。

羅廷順等[16]采用Thermo BDS Hypersil C18色譜柱，以乙腈-水為流動(dòng)相，對(duì)10個(gè)來自云南各州市縣重樓藥材進(jìn)行HPLC法分析。指紋圖譜中標(biāo)定出13個(gè)共有峰，指認(rèn)出8、9、10和S號(hào)峰分別為重樓皂苷VII、VI、II、I，圖譜相似度為0.851～0.970，表明產(chǎn)地不同的重樓主成分具有良好的一致性。吳鈺穎等[17]采用HPLC法對(duì)產(chǎn)自大理的重樓進(jìn)行分析，色譜柱為Thermore C18，流動(dòng)相為乙腈-水，建立了10個(gè)產(chǎn)區(qū)的多葉重樓和11個(gè)不同產(chǎn)地云南重樓根莖HPLC指紋圖譜，共有峰分別為14個(gè)、13個(gè)，圖譜相似度分別大于0.900、0.922。多葉重樓和云南重樓的根莖圖譜有11個(gè)共有峰，但相似度僅為0.057～0.225，7種主要甾體皂苷成分存在較大差異，多葉重樓中重樓皂苷I、II、VI和VII的含量低于云南重樓。袁會(huì)瓊等[18]采用Agilent Zorbax-SB C18色譜柱，以乙腈-水為流動(dòng)相，對(duì)10批云南重樓和10批長(zhǎng)柱重樓進(jìn)行HPLC分析，共發(fā)現(xiàn)15個(gè)共有峰，指認(rèn)出6、7、8、9號(hào)峰分別為重樓皂苷VI、VII、II、I，且長(zhǎng)柱重樓中上述4種有效成分的含量明顯高于云南重樓，圖譜相似度分別為0.905～0.998和0.905～0.986，聚類分析(CA)結(jié)合主成分分析(PCA)顯示20批樣品被顯著地分成2類，可為其品種鑒定及質(zhì)量監(jiān)控提供參考。錢正明等[19]采用Welch Ultimate AQ-C18色譜柱，以水-乙腈為流動(dòng)相，對(duì)10批重樓樣品HPLC分析，圖譜中標(biāo)記出16個(gè)共有峰，相似度多小于0.900，CA和PCA結(jié)果顯示10批重樓聚為3類，表明重樓藥材化學(xué)成分存在差異。

1.2 超高效液相色譜

與HPLC相比，超高效液相色譜(UPLC)柱效更高，具有更強(qiáng)的分析效率、靈敏度及分離能力，與不同檢測(cè)器聯(lián)用，適合于不同類型藥物復(fù)雜體系的分析鑒定，結(jié)合指紋圖譜技術(shù)在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，目前對(duì)于中藥重樓的研究主要集中于甾體皂苷類成分[20-21]。

趙飛亞等[22]采用UPLC法對(duì)10種不同產(chǎn)地重樓進(jìn)行分析，色譜柱為L(zhǎng)una Omega Polar C18，流動(dòng)相為乙腈-水，測(cè)定了55批藥材中重樓皂苷I、II、VI、VII、H和薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷的含量，并采用TOPSIS模型分析，發(fā)現(xiàn)重樓化學(xué)綜合質(zhì)量差異較大。高妍等[23]采用UPLC法對(duì)云南重樓、華重樓、偽品三者進(jìn)行分析，色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3，流動(dòng)相為乙腈-水，在10批云南重樓圖譜中標(biāo)定出偽原纖細(xì)薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、薯蕷皂苷及重樓皂苷VII、H、II、I、V共8個(gè)特征峰，10批云南重樓、3批華重樓的相似度分別為0.70～0.83、0.26～0.37，7批偽品圖譜相似度小于0.22，CA和PCA均能使三者得以區(qū)分。張紹山等[24]對(duì)23份云南重樓及多芽品系進(jìn)行UPLC分析，色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18，流動(dòng)相為乙腈-水，建立了10批樣品的UPLC指紋圖譜，標(biāo)定出8個(gè)共有峰，指認(rèn)出重樓皂苷VII、H、II、I 4個(gè)特征峰，重樓(多芽品系)樣品間相似度小于0.9，CA和PCA分析從整體上表明樣品成分及含量具有明顯差異。楊遠(yuǎn)貴[25]采用UPLC法對(duì)38批不同種重樓進(jìn)行分析，色譜柱為Shim-pack XR-ODS III column，流動(dòng)相為乙腈-0.05%甲酸水，定量分析出重樓皂苷I、II的含量差異，并結(jié)合PCA、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，結(jié)果顯示，大部分重樓樣品的含量比(重樓皂苷II/重樓皂苷I)小于100%，6種不同重樓很好聚為兩類，其中滇重樓和五指蓮UPLC指紋圖譜中共有峰個(gè)數(shù)分別為32個(gè)、25個(gè)，相似度分別大于0.80、0.82，對(duì)重樓進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)可為尋找滇重樓種源替代產(chǎn)品提供參考。

1.3 薄層色譜

薄層色譜(TLC)常用于鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測(cè)定，在中藥的質(zhì)量控制中起著重要的作用，展開速率快，分辨能力強(qiáng)，展開劑和展開方向可隨用隨換，操作簡(jiǎn)便易行。隨著高效薄層色譜(HPTLC)的出現(xiàn)，將常量薄層色譜的靈敏度和分辨力大大提高，方法更加高效、快速、可靠，可提供色譜指紋圖譜的電子圖像和密度圖來檢測(cè)植物樣品中是否存在標(biāo)記化合物[26]。

洪淑華[27]采用預(yù)制硅膠G薄層板，展開劑為氯仿-甲醇-水(15∶5∶1)的下層溶液，點(diǎn)樣量2 μL，顯色劑為10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱，365 nm紫外燈和日光下檢視，對(duì)9個(gè)重樓商品藥材和10個(gè)自然保護(hù)區(qū)來源重樓樣品進(jìn)行分析并建立TLC指紋圖譜，以重樓皂苷I、II為指標(biāo)成分，發(fā)現(xiàn)來源不同的重樓樣品的品質(zhì)參差不齊；CA顯示，9個(gè)商品藥材劃分為5個(gè)類群，品質(zhì)與來源不相一致，品種較為混亂，10個(gè)自然保護(hù)區(qū)樣品劃分為4個(gè)類群，與實(shí)際情況一致。于新蘭等[28]采用G薄層板，展開劑選用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(17∶40∶21∶10)10℃以下放置的下層溶液，檢視后可見23個(gè)熒光條斑，經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜鑒別出其中8個(gè)，分別為重樓皂苷I、II、III、V、VI、VII、D和纖細(xì)薯蕷皂苷，該方法可快速鑒別重樓藥材，從整體上對(duì)藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2 光譜指紋圖譜

2.1 紅外光譜

紅外光譜(IR)中吸收峰的位置與強(qiáng)度反映出化學(xué)分子結(jié)構(gòu)上的差異，以此來鑒別結(jié)構(gòu)，適用于固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)樣品的分析，具有測(cè)定快、特征性強(qiáng)、分辨率高、檢測(cè)無損等特點(diǎn)，對(duì)于中藥復(fù)雜化學(xué)成分可進(jìn)行多個(gè)組分定性定量分析，成為中藥質(zhì)量控制方面的一種有效手段[29-30]。

吳喆[31]采用FT-IR法分別采集滇重樓、白花重樓、毛重樓、南重樓、五指蓮共50份樣品的紅外光譜信息，發(fā)現(xiàn)1 653、1 156、1 082、1 021、925、851、759、572、524 cm-1等為重樓屬植物的共有峰，1 535 cm-1和1 369 cm-1是毛重樓和五指蓮的特征吸收峰，PLS-DA和PCA分析將5種重樓準(zhǔn)確區(qū)分。同時(shí)對(duì)9種滇重樓不同炮制品整體化學(xué)成分變化進(jìn)行對(duì)比研究，特征峰分布為3 387、2 923、1 745、1 463、1 338、1 240、1 207、1 158、1 180、1 080、1 048、1 020、988、921、895、859、833、765、708、572、529 cm-1，且圖譜峰形大體相似，少數(shù)特征吸收峰數(shù)目、位置和吸收強(qiáng)度存在差異，表明不同炮制方法造成重樓化學(xué)成分和含量的變化。余孟杰等[32]采用FT-IR對(duì)10份七葉一枝花樣品進(jìn)行研究，建立IR指紋圖譜，并對(duì)3 400、2 940、1 640、1 411、1 250、1 200～950、1 150、1 020、920、860、760、700 cm-1附近的吸收峰進(jìn)行了歸屬，采用相關(guān)系數(shù)法計(jì)算相似度，以此對(duì)重樓類藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。鄭江萍等[33]建立了19份重樓藥材的IR指紋圖譜，共有特征峰有3 470 cm-1、2 990 cm-1、1 670 cm-1、1 420 cm-1、1 080 cm-1、960 cm-1，根據(jù)七葉一枝花、寬葉重樓、球藥隔重樓、華重樓的IR圖譜的差異，可對(duì)準(zhǔn)確區(qū)分重樓藥材，實(shí)現(xiàn)快速鑒別的目的。裴藝霏[34]以云南省和貴州省采集的野生及栽培滇重樓的根莖、莖及葉作為研究材料，用FT-MIR、ATR-FTMIR、NIR等多種光譜技術(shù)采集指紋圖譜，結(jié)合多種變量篩選方法及多來源信息融合策略，建立了單一或融合PLS-DA、SVM及RF滇重樓產(chǎn)地鑒別及年限鑒別模型，輔以HCA及PCA方法，系統(tǒng)分析不同部位、年限和產(chǎn)地的滇重樓品質(zhì)差異，建立滇重樓光譜評(píng)價(jià)體系，為滇重樓質(zhì)量評(píng)價(jià)與資源合理利用提供了理論基礎(chǔ)。

2.2 紫外光譜

有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中含有發(fā)色團(tuán)、助色團(tuán)等官能團(tuán)，能夠產(chǎn)生特征性吸收光譜，可以利用紫外光譜(UV)對(duì)其進(jìn)行定性鑒別。紫外指紋圖譜可獲取稀溶液中190～400 nm的化學(xué)成分的疊加信息，利用紫外光譜分析法可以檢測(cè)或測(cè)定中藥中總成分的不飽和化學(xué)鍵和共軛體系的信息[35]，特別適用于不飽和共軛體系化合物的鑒定，從而對(duì)中藥實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地鑒別分析。

張金渝等[36]采用氯仿、無水乙醇和重蒸水3種不同極性溶劑分別對(duì)重樓樣品進(jìn)行紫外吸收光譜檢測(cè)，建立了46份滇重樓及其他重樓居群的紫外光譜指紋圖譜，結(jié)果顯示，滇重樓的共有峰率在36.00%～77.78%，平均共有峰率為53.25%，滇中、滇南及滇西南、滇東南、滇西北、滇東及黔西5個(gè)相同地區(qū)內(nèi)滇重樓居群平均共有峰率分別為51.69%、55.23%、52.8%、54.24%、54.63%，表明地理距離近、環(huán)境相似的居群具有較高的共有峰率，居群間化學(xué)成分相似程度高。該方法能夠?qū)⒉煌乩韥碓吹牡嶂貥蔷尤簠^(qū)分開來，也可以將滇重樓與其他重樓區(qū)分開來。

2.3 熒光光譜

熒光光譜能夠形象地反映出含有共軛雙鍵熒光組分的各種分子信息，適用于含有熒光組分的藥物成分分析，具有靈敏度高、選擇性好、測(cè)試速度快等優(yōu)點(diǎn)，可以進(jìn)行中藥藥性識(shí)別[37]，在藥物成分分析與鑒定、藥動(dòng)學(xué)研究、藥理與藥效評(píng)價(jià)等方面廣泛應(yīng)用。

洪淑華[27]采用熒光光譜法對(duì)9個(gè)重樓商品藥材和10個(gè)自然保護(hù)區(qū)來源重樓樣品進(jìn)行分析并建立了熒光光譜指紋圖譜，在Ex280 nm/Em330 nm和Ex280 nm/Em640 nm附近均具有熒光峰，且重樓皂苷I、II的熒光峰出現(xiàn)在Ex220 nm/Em340 nm和Ex270 nm/Em400 nm附近，而不同產(chǎn)地的樣品熒光峰等高線密集程度均不一樣。商品藥材均在Ex280 nm/Em330 nm、Ex280 nm/Em640 nm、Ex230 nm/Em340 nm和Ex230 nm/Em640 nm處有熒光峰，自然保護(hù)區(qū)來源的樣品在Ex400 nm/Em680 nm等處有熒光峰，按其三維熒光圖譜可將重樓樣品分為2大類。對(duì)比熒光峰峰高發(fā)現(xiàn)，同一產(chǎn)地的樣品重樓皂苷含量不盡相同，相同部位不同來源的重樓樣品品質(zhì)不一致，同株不同部位重樓樣品，根中重樓皂苷含量高于莖葉，該方法簡(jiǎn)便可靠、簡(jiǎn)便易行、特征性強(qiáng)，可作為重樓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、品質(zhì)鑒定的手段。

3 生物指紋圖譜

分子標(biāo)記技術(shù)是以生物個(gè)體間遺傳物質(zhì)的差異進(jìn)行標(biāo)記，具備靈敏度高、重現(xiàn)性好、分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)?；诜肿訕?biāo)記技術(shù)建立的生物指紋圖譜已被廣泛應(yīng)用于藥用植物鑒定鑒別研究中，并成為中藥材鑒定質(zhì)量控制的重要技術(shù)[38]。

辛本華等[39]對(duì)來自四川和云南的重樓屬種的遺傳多態(tài)性進(jìn)行RSAP標(biāo)記分析，構(gòu)建出8個(gè)種的DNA指紋圖譜，借助系統(tǒng)進(jìn)化樹可以明確不同種的進(jìn)化關(guān)系，從而為重樓的種類鑒定和種間的分類地位提供分子生物學(xué)依據(jù)。劉勝坤等[40]對(duì)13份重樓進(jìn)行ISSR標(biāo)記分析，12條引物擴(kuò)增出條帶181條，其中多態(tài)性帶174條，占比96.13%，Nei’s基因多樣性指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)及遺傳相似系數(shù)的范圍分別為0.214～0.327、0.351～0.500、0.293～0.624，并通過聚類分析將重樓種質(zhì)分為3類。周武先等[41]對(duì)13份重樓樣品進(jìn)行CDDP標(biāo)記分析，并進(jìn)行條形碼編碼，多態(tài)性條帶73個(gè)，占比91.25%，該方法檢測(cè)靈敏，可以快速鑒定重樓。Duan等[42]采用DNA條形碼結(jié)合高分辨熔融分析技術(shù)，對(duì)重樓及其偽品進(jìn)行了鑒別，結(jié)果表明，內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)分子區(qū)域與HRM分析相結(jié)合，可以有效鑒別9種中草藥，其中包括2種重樓的正宗產(chǎn)地和7種常見的摻假品，DNA條形碼與HRM分析相結(jié)合是一種準(zhǔn)確、可靠、快速、經(jīng)濟(jì)、可靠的分析工具，有助于重樓的質(zhì)量控制。

4 結(jié)語

重樓是我國(guó)常用的中藥材，市場(chǎng)需求量大，同屬植物較多，存在混淆、混用或替用現(xiàn)象。種質(zhì)來源、生產(chǎn)產(chǎn)地及方式等諸多因素都對(duì)重樓藥材的質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響，并最終影響著藥物的療效及產(chǎn)品的穩(wěn)定與可控，以單一指標(biāo)成分難以控制重樓的真實(shí)品質(zhì)，建立其科學(xué)可靠的質(zhì)控體系十分必要。

基于光譜、色譜、生物等方法的指紋圖譜技術(shù)，可以解開重樓成分“密碼”，較為全面的反映重樓內(nèi)部整體特征，對(duì)藥材實(shí)現(xiàn)真?zhèn)舞b別、優(yōu)劣考察，區(qū)分藥材各個(gè)部位及檢測(cè)原料與成品之間的一致性和穩(wěn)定性，進(jìn)而對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)描述和評(píng)價(jià)。目前，關(guān)于重樓指紋圖譜技術(shù)的研究主要集中于高效液相色譜，適用于各類藥材的快速高效質(zhì)量分析。近年來，生物指紋圖譜的研究逐漸深入，借助分子遺傳標(biāo)記并應(yīng)用于中藥材的質(zhì)量控制。但是，重樓指紋圖譜與生物活性或臨床療效等相關(guān)的化學(xué)成分的關(guān)聯(lián)性研究報(bào)道較少，有待于確定其完整的譜效關(guān)系，揭示藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，綜合運(yùn)用各種現(xiàn)代技術(shù)對(duì)重樓進(jìn)行深度挖掘研究，進(jìn)一步完善其質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)體系，可以更好地實(shí)現(xiàn)重樓藥材的合理開發(fā)和科學(xué)應(yīng)用。