毛霉病現(xiàn)狀分析及PCR技術在其診斷中的應用

閻香言 王志賢 張傲 白雪秋

[天津市侵襲性真菌病精準診斷技術企業(yè)重點實驗室 丹娜(天津)生物科技股份有限公司，天津 300467]

1 毛霉病的現(xiàn)狀分析

1.1 毛霉病介紹

毛霉曾歸屬于接合菌亞門，毛霉目真菌引起的毛霉病(mucormycosis)以及蟲霉目真菌引起的蟲霉病(entomophthoramycosis)合稱為接合菌病[1]。Hibbett等[2-3]基于基因序列分析研究對真菌界進行了重新分類，接合菌綱包括多種真菌類別，毛霉和蟲霉是進化距離遠、各自獨立的兩類真菌。毛霉和蟲霉均被獨立劃分為毛霉亞門和蟲霉亞門，由毛霉引起的疾病也被稱為毛霉病[3]。毛霉目下毛霉科中的根霉屬、毛霉屬、根毛霉屬及橫梗霉屬以及毛霉目下小克銀漢霉科中的小克銀漢霉屬等較為常見[4]。

近些年，隨著廣譜抗生素、皮質類固醇激素、抗腫瘤藥物及免疫抑制劑的普遍應用和糖尿病、艾滋病患者的增多，實體器官及骨髓移植、燒傷搶救和其他延長生命技術的廣泛使用，都為條件致病真菌的繁殖和致病提供了良好的條件，該病的發(fā)病率有明顯增加趨勢[1]。毛霉病的五種主要感染部位中以肺部最為常見，肺毛霉病的特征性病理改變?yōu)榻?、血栓形成和壞死。最易侵犯肺上葉，死亡率高達56%，近期臨床觀察呈慢性經(jīng)過的肺毛霉病[5]，主要見于糖尿病患者，及時確診并積極控制血糖及抗真菌治療可顯著提高患者生存率[1]。由于毛霉病具有進展迅速、易誤診漏診、病死率高等特點，其早期診斷與治療一直是困擾臨床的一大難題，因此發(fā)展有效的毛霉病檢測方法對該病的早期診斷與治療尤為重要。

1.2 毛霉病流行病學

發(fā)病率逐年升高 毛霉病是一種進展迅速的侵襲性真菌病，近年來發(fā)病率不斷增加，在人群中每年可達到1.2/100萬人。在真菌感染中，毛霉病發(fā)病率占8.3%～13%，僅次于念珠菌和曲霉感染，居于第3位；2005—2014年，美國毛霉病的發(fā)病率每年增長7%，死亡率每年增長9.3%；2010—2014年，印度毛霉病的發(fā)病率每年增長0.014%；2000—2010年，法國毛霉病的發(fā)病率每年增長7%；2008—2014年，伊朗毛霉病的發(fā)病率為9.7%～23.7%[6-7]，在新冠疫情之前，毛霉病已經(jīng)是印度的一大問題，印度毛霉病的發(fā)病率是發(fā)達國家平均水平的80倍，高達14/10萬人，隨著新冠疫情的爆發(fā)，合并毛霉感染的病例急劇增加，毛霉病已經(jīng)成為印度“流行病中的流行病”。在國外，毛霉病發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[8-9]；同樣，近年來，我國關于毛霉病的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢。王思卜等[10]對接合菌病流行現(xiàn)狀進行回顧性分析，中國大陸地區(qū)接合菌病感染率有上升趨勢，其中感染類型以毛霉病為主。Lin等[11]對中國大陸毛霉病病例進行系統(tǒng)回顧，包括390例病例。大多數(shù)患者為男性(61.3%)，糖尿病是最常見的易感因素(37.2%)。肺毛霉病(42.1%)最常見，其次是皮膚感染(21.0%)。

發(fā)病地域性差異 根霉屬在各個地域均發(fā)病率最高，橫梗霉屬感染在歐洲更為頻繁(法國29%，西班牙42%)；鱗質霉屬感染主要在熱帶或溫暖氣候地區(qū)，澳洲鱗質霉屬感染僅次于根霉屬[6]，此次在印度爆發(fā)的新冠疫情，合并毛霉感染的主要是鱗質霉屬；非洲橫梗霉屬感染僅次于根霉屬；亞洲毛霉屬、橫梗霉屬及鱗質霉屬感染率相差不大，次于根霉屬；美國毛霉屬感染較高，僅次于根霉屬，鱗質霉屬也有多發(fā)。

不同種屬發(fā)病率差異 在447/851例毛霉病病例中鑒定出8屬28種，其中根霉屬(48%)最常見，其次是毛霉屬(14%)、橫梗霉屬(13%)、小克銀漢霉屬(7%)和根毛霉屬(6%)[6]。免疫缺陷患者多由呼吸道吸入感染，粒細胞缺乏癥患者多表現(xiàn)為肺部毛霉病，糖尿病患者表現(xiàn)為鼻腦毛霉病；免疫功能正?；颊咧形改c道毛霉病最常見，死亡率高[6-7]。小克銀漢霉屬在患有肺部或播散性疾病患者中更為常見；而根霉在鼻-眼眶-腦毛霉病患者中更為常見；橫梗霉屬感染在皮膚組織毛霉病患者中更為常見[6]。最近，印度新冠肺炎患者中合并毛霉感染的病例急劇增加，其中鱗質霉屬最常見。

死亡率高LancetInfectionDisease于2019年發(fā)布的《毛霉病診療全球指南》中提到，毛霉病的全死亡率40%～80%[12]，取決于宿主基礎狀況、感染菌種和感染部位。小克銀漢霉屬感染患者的死亡率(77%)常高于橫梗霉屬(35%)、根霉屬(39%)、毛霉屬(41%)和根毛霉屬(47%)[6-7]。血液系統(tǒng)惡性腫瘤、HSCT(造血干細胞移植)、重度燒傷患者預后非常差。如果發(fā)生播散感染尤其累及CNS(中樞神經(jīng)系統(tǒng))，病死率高達80%。肺毛霉病最易侵犯肺上葉，死亡率高達56%。20世紀中葉以來，糖尿病、惡性腫瘤、SOT(實體器官移植)及HSCT(造血干細胞移植)成為毛霉病的主要危險因素。毛霉病病死率高，預后差，應引起臨床重視。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療尤為重要，尋找快速診斷的技術顯得非常必要。

1.3 毛霉病的傳統(tǒng)診斷方法

目前用于毛霉病診斷的方法有真菌直接鏡檢、真菌培養(yǎng)、組織病理、血清學檢測等。

直接鏡檢 能夠快速地對毛霉病做出疑似診斷。鏡下特征表現(xiàn)為寬窄不一、無隔或少隔、呈直角分枝、不規(guī)則的絲帶狀菌絲體。由于毛霉是實驗室或皮膚黏膜表面常見污染菌，因此直接刮取鱗屑獲得的鏡檢結果不能作為組織浸潤的可靠證據(jù)，直接鏡檢不能對感染菌株進行種屬鑒定[13]。

真菌培養(yǎng) 菌種鑒定的關鍵就是真菌培養(yǎng)?？梢詫Ψ蛛x出來的菌株進行菌種鑒定和體外藥敏試驗。毛霉在大多數(shù)培養(yǎng)基中均可迅速生長，培養(yǎng)溫度通常為37℃。需要注意的是培養(yǎng)前應避免樣本的過度研磨，否則易出現(xiàn)假陰性結果[13]。

組織病理 毛霉病的組織病理學特點包括明顯的梗死、血管浸潤和外周神經(jīng)浸潤等[9]。肺毛霉病的組織病理學特點包括血管受累(100%)、出血性梗死(90%)、凝固性壞死(85%)、肺泡內出血(85%)[13]。

血清學檢測 目前還沒有標準化的方法檢測毛霉特異性抗原。G試驗是針對真菌細胞壁1，3-β-D葡聚糖的抗原檢測，但毛霉亞門的細胞壁少有1，3-β-D葡聚糖的表達[6]；同時半乳甘露聚糖抗原(galactomannoglycan，GM)試驗是煙曲霉較為特異的血清學檢測方法，因此G試驗和GM試驗均不適用于毛霉病的診斷。當CT檢查高度提示侵襲性真菌病，而血清及肺泡灌洗液中GM試驗結果陰性時，應高度警惕可能是毛霉病。GM試驗在毛霉病診斷中僅可作為排他性方法而非特異性診斷方法[13]。

2 PCR技術在毛霉病診斷中的研究及應用

應用于毛霉病診斷中的PCR技術為實時熒光定量PCR技術，即在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。PCR技術是近年來發(fā)展迅速的臨床檢測分析技術。采用PCR技術進行毛霉病檢測較常規(guī)方法更快速、具有更高的靈敏度和特異性，重復性好，該方法檢測毛霉病為臨床診斷和治療提供了重要依據(jù)。

2.1 高分辨率熔解曲線方法的應用

高分辨率熔解曲線方法(PCR/HRM)適合檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)樣本中的根霉屬、根毛霉屬、橫梗霉屬和毛霉屬。2010年，Hrncirova等[14]收集31株真菌，包括10株毛霉和21株其他絲狀真菌。采用Bialek等[15]推薦的方法，針對毛霉屬序列中的18S核糖體DNA (rDNA)設計特異性引物探針，進行實時熒光定量PCR，用高分辨率熔解曲線方法(PCR/HRM)進行物種區(qū)分，所有毛霉分離株均得到正確鑒定。同時Hrncirova等[14]對12例組織樣本進行回顧性分析，結果發(fā)現(xiàn)，從經(jīng)過組織病理學或培養(yǎng)證實的7個毛霉病患者中，PCR均呈陽性，且在所有病例中，均能直接檢測毛霉菌種：根霉(n=4)、傘枝犁頭霉(n=2)和根毛霉(n=1)；來自無真菌病患者5個的組織標本(來自無真菌病患者)均為陰性。應用高分辨率熔解曲線方法(PCR/HRM)進行物種區(qū)分，可直接檢測毛霉菌種。使用高分辨率熔解曲線方法(PCR/HRM)非常簡單，能夠快速準確地檢測和鑒定組織樣本和培養(yǎng)分離物中的毛霉。它能區(qū)分臨床主要毛霉，且與非毛霉菌絲狀真菌無交叉反應。該方法具有較高的敏感性和特異性，適用于臨床常規(guī)診斷。

2014年，Lengerova等[16]對99份支氣管肺泡灌洗液(BALF)樣本進行回顧性分析，在ITS2區(qū)域設計特異性引物探針，使用高分辨率熔解曲線方法(PCR/HRM)檢測，其中90份(91%)的BALF樣本為陰性，而9份(9%)的樣本為陽性，敏感性和特異性分別為100%和93%。同時將高分辨率熔解曲線方法(PCR/HRM)的陽性結果與種間特異實時熒光定量PCR的陽性結果相結合，特異性提高到98%。

2.2 半巢式PCR和測序方法的應用

對于各種類型的樣本，PCR技術均有較高的特異性和敏感性。2011年，Hammond等[17]對29例FFPE(福爾馬林固定石蠟包埋的組織樣品)進行回顧性分析，針對毛霉屬序列中的18S核糖體DNA (rDNA)進行半巢式PCR和測序，在12例培養(yǎng)陽性的毛霉感染的病例中，有10例PCR陽性(83%)，9例測序結果與培養(yǎng)結果在屬水平一致；在16例培養(yǎng)陰性病例中，PCR檢測12例為陽性，根霉屬(n=4)、小克銀漢霉屬(n=4)、根毛霉屬(n=3)和橫梗霉屬(n=1)，測序結果與PCR結果在屬水平一致。由此可見，PCR法應用于臨床對于毛霉病的準確診斷具有重要意義。

對于毛霉而言，檢測靶點非常豐富，其中18S rDNA、ITS2區(qū)域、28s rDNA以及CotH基因等均能成功檢測。2019年，Millon等[6]使用3種方法檢測毛霉，第1種是在ITS區(qū)設計泛真菌引物，進行測序檢測；第2種是在毛霉的18s rDNA區(qū)設計毛霉菌目特異性引物，進行半巢式PCR檢測；第3種是在28s rDNA區(qū)設計毛霉菌目特異性引物，進行實時熒光定量PCR檢測。檢測的樣本類型有：新鮮/冷凍組織、福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)樣本、支氣管肺泡灌洗液(BALF)、尿液。結果表明：這3種方法都可以檢測，使用實時熒光定量PCR技術檢測，新鮮/冷凍樣本比福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)樣本效果更好。

2.3 多重實時熒光定量PCR方法的應用

2013年，Bernal Martínez等[18]應用多重實時熒光定量PCR(MRT-PCR)檢測22株培養(yǎng)菌株及12例毛霉病患者的臨床樣本。結果顯示，對臨床培養(yǎng)的菌株和臨床樣本的特異性為100%，敏感性為100%[19]。該研究證實，從培養(yǎng)物到臨床樣本，多重實時熒光定量PCR(MRT-PCR)均表現(xiàn)出良好的特異性和敏感性，該技術可用于臨床診斷和進一步的研究是必要的。

2.4 實時熒光定量PCR方法的應用

2016年，Springer等[20]對15份組織樣本進行回顧性分析，包括有典型毛霉病組織學特征的組織樣本(n=11)和4個對照樣本(無侵襲性真菌病的典型癥狀或特征)。在18S區(qū)域設計特異性引物探針，使用實時熒光定量PCR檢測。在11例毛霉病樣本中檢測到10例陽性，敏感性為91%，特異性100%。PCR方法更快速、更特異，可以快速區(qū)別毛霉和曲霉感染，有助于早期診斷，早期治療，對制定抗真菌方案及患者預后有重要作用。

2018年，Scherer等[21]對337例患者的405份支氣管肺泡灌洗液(BALF)樣本進行回顧性分析，在337例患者中，使用實時熒光定量PCR法檢測BALF樣本，陽性15例，陰性322例。在15例陽性患者中，確診或疑似的毛霉病5例，疑似的侵襲性曲霉病3例，可能的侵襲性真菌病6例，無侵襲性真菌病1例。在本組中，使用實時熒光定量PCR法診斷疑似或確診肺毛霉病的敏感性和特異性分別為100%和97%。在9例疑似和確診的毛霉病患者中，有6例檢測BALF樣本陽性，同時檢測血清樣本也為陽性，并與所鑒定的物種一致[20]。這一發(fā)現(xiàn)進一步提高了實時熒光定量PCR結果的價值，血清和BALF樣本的陽性結果結合更促進臨床醫(yī)生完成早期診斷，啟動精準治療。

歐洲臨床微生物學和傳染病學會(ESCMID)真菌感染研究組(EFISG)和歐洲醫(yī)學真菌學聯(lián)合會(ECMM)聯(lián)合臨床指南中強調，無論采用何種PCR技術(泛真菌引物的實時熒光定量PCR或毛霉特異性引物的實時熒光定量PCR)，對福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)樣本進行檢測時，分析靈敏度為56%～80%，對新鮮組織樣本進行檢測時，靈敏度為97%～100%[6]。近年來Clara等認為編碼CotH基因的孢子包衣蛋白同源物是毛霉中唯一且普遍存在的。因此，CotH基因是毛霉病快速診斷的潛在靶點。Clara等使用不同的毛霉感染小鼠，并驗證實時熒光定量PCR方法可否檢測到CotH基因；同時用未感染毛霉病小鼠和感染曲霉小鼠驗證該方法的特異性。在感染后24 h血漿、尿液和支氣管肺泡灌洗液(BALF)樣本中檢測到了CotH基因，這些樣本均來自于感染了根霉、米根霉、毛霉、傘枝犁頭霉或小克銀漢霉的小鼠，而不是從未感染的小鼠或感染了煙曲霉的小鼠身上采集的樣本。檢測尿液樣本中CotH基因比血漿或BALF樣本更可靠，檢測靈敏度為90%，特異性為100%[22]。

目前已有成品試劑盒可用于檢測毛霉，比如丹娜(天津)生物科技股份有限公司的MycoMDx Mucor PCR Assay試劑盒以及荷蘭PathoNostics的MucorGenius?PCR等。2020年，Guegan等[23]對319例肺組織樣本進行回顧性分析，同時采用直接檢查、真菌學培養(yǎng)和毛霉特異性引物PCR檢測以及MucorGenius?PCR等方法檢測侵襲性霉菌病感染情況，同時還收集了半乳甘露聚糖(GM)的檢測結果，顯示毛霉特異性引物PCR和MucorGenius?PCR檢測陽性結果分別為33例(10.3%)和27例(8.5%)，而培養(yǎng)陽性結果僅10例(3.1%)。毛霉特異性引物PCR和MucorGenius?PCR檢測靈敏度分別為100%(10/10)和90% (9/10)，特異性分別為95.7%和97.9%。兩種PCR檢測方法都可以檢測出10個可能病例和6個IA樣本中的毛霉DNA，但培養(yǎng)均未檢測到。與顯微鏡檢查和培養(yǎng)的傳統(tǒng)真菌學相比，毛霉特異性引物PCR和MucorGenius?PCR檢測顯著提高了毛霉的檢出率。兩種PCR檢測方法使陽性樣本的數(shù)量增加了近3倍。兩種PCR檢測方法對已證實和可能病例的敏感性高，分別達到100%(10/10)和90%(9/10)[23]，PCR技術的應用可以提高毛霉病的實驗室診斷水平。

毛霉病的發(fā)病率呈逐年上升，組織病理是毛霉病確診的金標準，但屬于侵入性檢查且耗時長、給患者帶來不適等。除了皮膚型毛霉病，臨床樣本尤其血液樣本的培養(yǎng)陽性率較低。在929例毛霉病的系統(tǒng)回顧研究中，培養(yǎng)陽性率僅為50%[9]。和侵襲性曲霉病、念珠菌病、隱球菌病不同，目前還沒有像GM試驗、G試驗、多糖莢膜抗原這樣的較為敏感的血清學抗原檢測技術用于毛霉病的快速診斷，毛霉病的早期快速診斷鑒定尤其步履維艱。

綜上所述，PCR技術在毛霉病的快速診斷中顯示出了良好的潛力。PCR技術適用于檢測多種樣本，包括但不限于真菌菌體、新鮮/冷凍組織、FFPE(福爾馬林固定石蠟包埋的組織樣品)、BALF(支氣管肺泡灌洗液)、血液、尿液等，且檢測靶點豐富，其中18S rDNA、ITS2區(qū)域、28s rDNA以及CotH基因等均能成功檢測，此外還可應用高分辨率熔解曲線方法(PCR/HRM)進行物種區(qū)分，可直接鑒定毛霉菌種。

3 小結與展望

毛霉病是除了常見的曲霉病和念珠菌病之外，位列第三的侵襲性真菌感染疾病[24]。近年來，隨著臨床上免疫系統(tǒng)受損患者的日漸增加，毛霉病發(fā)病率逐年升高。同時，毛霉病的傳統(tǒng)診斷方法伴隨有耗時長、易污染、敏感性低和假陽率高等特點。鑒于此，毛霉病的診斷迫切需要一種敏感、特異、快速的檢測技術以應用于早期診斷，早期治療。PCR技術是一項成熟可靠的技術，基于此的多重實時熒光定量PCR方法也經(jīng)歷了長時間的技術發(fā)展和進步，現(xiàn)在已經(jīng)處于成熟穩(wěn)定的階段，市面上已經(jīng)有大量應用該技術的成熟產(chǎn)品上市?？焖佟⒚舾?、精確的PCR技術是該類病原菌檢驗的發(fā)展大趨勢，結合現(xiàn)有的影像學檢查及組織病理，建立新型真菌聯(lián)合檢測方案，形成新型真菌診斷方案，為臨床醫(yī)生對毛霉病患者的診療提供快速而科學的依據(jù)。