外泌體及其診斷治療應(yīng)用

周郁斌

（廣東醫(yī)科大學(xué)/廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，藥學(xué)院，廣東東莞 523808）

上個(gè)世紀(jì)80 年代，Johnstone 和Pan 首次在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)具有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡[于1987 年被命名為“外泌體”（“exosome”），后多以“exosomes”形式出現(xiàn)][1-2]。在隨后的30 多年，外泌體的研究經(jīng)歷了快速發(fā)展。本世紀(jì)初Théry 等[3]建立了較為通用的外泌體提取分離和鑒定標(biāo)準(zhǔn)，大大地推動(dòng)了外泌體的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。2013 年的“諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)”授予了Rothman、Schekman 和Südhof 3 位科學(xué)家，以表彰其關(guān)于細(xì)胞內(nèi)囊泡（包括外泌體）運(yùn)輸調(diào)節(jié)機(jī)制的研究，這把外泌體領(lǐng)域推上了新的高地，吸引著越來(lái)越多研究者的興趣，包括臨床醫(yī)生、藥劑學(xué)家、免疫學(xué)家和材料學(xué)家等。外泌體是一種納米級(jí)的膜性囊泡，包含多種重要生物分子，在診斷和治療方面具有重要的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景[4]。本文將簡(jiǎn)介外泌體的基本特征和相關(guān)研究方法，并探討其在診斷和治療方面的研究進(jìn)展，旨在使讀者對(duì)該領(lǐng)域具有總體上的認(rèn)識(shí)，為其提供研究策略參考和啟發(fā)新思路。在最后部分，本評(píng)述側(cè)重于討論外泌體研究當(dāng)前存在的問(wèn)題并對(duì)未來(lái)的研究方向進(jìn)行展望。

1 外泌體簡(jiǎn)介

外泌體是一種由細(xì)胞分泌的囊泡，廣泛存在于血液、尿液、唾液、乳汁等多種體液中，其粒徑為30～150 nm（密度為1.13～1.19 g·mL-1，不同文獻(xiàn)報(bào)道中定義的粒徑范圍會(huì)有所差異）。外泌體起初只被當(dāng)作是細(xì)胞活動(dòng)的“排泄物”，但后來(lái)越來(lái)越多的研究表明其可能是細(xì)胞間通訊和物質(zhì)交換的重要物質(zhì)[5]。外泌體包含多種生物分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、mRNA 和miRNA 等，這些物質(zhì)基礎(chǔ)使得其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中備受關(guān)注。近30年來(lái)，外泌體相關(guān)文章的發(fā)表數(shù)量呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)（根據(jù)Web of Science 檢索數(shù)據(jù)，從1991 年的3 篇急增到2021 年的6 014 篇）。目前，外泌體的研究正處于高速發(fā)展階段，是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外一些相關(guān)公司也相繼成立。本部分將對(duì)外泌體的基本概況進(jìn)行介紹。

1.1 外泌體的形成及組成

一般認(rèn)為，外泌體的形成經(jīng)歷早期內(nèi)體的膜內(nèi)陷、多囊泡體的形成、囊泡的釋放分泌等系列過(guò)程[6]。然而，其確切形成機(jī)制的闡明仍是當(dāng)前的研究難點(diǎn)。根據(jù)其形成過(guò)程不難理解，外泌體可包裹供體細(xì)胞的生物分子，以及含有一些外泌體共有的特征物質(zhì)。常見(jiàn)的外泌體裝載物包括脂類(lèi)、四跨膜蛋白家族（如CD9、CD63、CD81）、主要組織相容性復(fù)合體、生長(zhǎng)因子、黏附蛋白、熱休克蛋白、核酸等[7]。其中，四跨膜蛋白家族、熱休克蛋白等常作為外泌體的標(biāo)志物用于其提取分離和分析鑒定。此外，外泌體所攜帶的供體細(xì)胞源蛋白或核酸分子反映著供體細(xì)胞自身以及細(xì)胞間交流的重要信息，是目前備受關(guān)注的生物標(biāo)志物。

1.2 外泌體的分離與表征

外泌體研究首要步驟是對(duì)其進(jìn)行提取分離。目前常用的外泌體提取分離方法包括差速離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、免疫親和捕獲法、分子排阻色譜法、試劑沉淀法等[8]。差速離心法主要是通過(guò)不同的離心速度把特定密度的外泌體進(jìn)行分離提取。該方法是外泌體的經(jīng)典提取方法，但存在耗時(shí)較長(zhǎng)、工作量大、產(chǎn)率不高、不易將外泌體與微泡碎片分離等問(wèn)題。為了提高純度，可在此基礎(chǔ)上進(jìn)行密度梯度離心（如加入蔗糖或者碘克沙醇）。免疫親和捕獲法利用外泌體的特征蛋白進(jìn)行分離提取，具有較高的特異性，常用于純化操作。分子排阻色譜法和超濾離心法基于粒子的大小進(jìn)行分離。值得注意的是，對(duì)于分子排阻色譜法，色譜柱的孔徑、凝膠填充物的類(lèi)型、洗脫速度等因素可能會(huì)影響外泌體的分離效果。試劑沉淀法常用高分子將溶液中的粒子沉淀從而得到外泌體。在實(shí)際研究中，可根據(jù)不同的需要采用適當(dāng)?shù)耐饷隗w提取分離方法，也可以結(jié)合不同方法的特點(diǎn)聯(lián)合應(yīng)用。

外泌體的表征是驗(yàn)證其提取效果的重要手段，為其應(yīng)用提供物質(zhì)基礎(chǔ)依據(jù)。針對(duì)外泌體的物理學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)以及實(shí)際需要，可選用相應(yīng)的表征方法。如，通過(guò)透射電子顯微鏡可以直觀觀察到外泌體的形貌，有“所見(jiàn)即所得”的特點(diǎn)，但并不容易測(cè)定其濃度等信息。納米追蹤分析技術(shù)不僅可觀察外泌體的粒徑，還可以測(cè)定其濃度，是常用外泌體表征手段。此外，動(dòng)態(tài)光散射、蛋白印跡法等技術(shù)也常用于外泌體的表征。近年來(lái)，新型外泌體檢測(cè)技術(shù)有了較快的發(fā)展，這也促進(jìn)了其在診斷中的應(yīng)用。值得注意的是，外泌體在表征過(guò)程中也可能發(fā)生物理或生物學(xué)性質(zhì)上的變化?？偠灾瑢?duì)外泌體的全面表征有助于從多角度獲取其特性，為其后續(xù)的應(yīng)用提供有力支撐。

1.3 外泌體的主要應(yīng)用

由于外泌體常參與體內(nèi)的各種生理病理活動(dòng)，因此被認(rèn)為是疾病檢測(cè)中重要的標(biāo)志物，可為液體活檢提供豐富的信息[9]。此外，外泌體的天然來(lái)源及其裝載的重要生物分子使得其在治療應(yīng)用（如作為治療劑或遞送載體）中具有巨大潛力。目前來(lái)說(shuō)，外泌體相關(guān)產(chǎn)業(yè)中，與外泌體診斷和治療相關(guān)的企業(yè)占了絕大多數(shù)，這也側(cè)面暗示了其在診斷和治療方面的應(yīng)用前景。本文將從這兩方面進(jìn)行總結(jié)和展開(kāi)討論。

2 外泌體的檢測(cè)及診斷應(yīng)用

2.1 外泌體作為生物標(biāo)志物的潛力

外泌體作為細(xì)胞間通訊和物質(zhì)交換的重要載體，參與多種生理和病理活動(dòng)（如參與腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移及耐藥），攜帶著疾病的重要信息，被認(rèn)為是一種液體活檢中的重要生物標(biāo)志物，具有無(wú)創(chuàng)、易獲取、檢測(cè)便捷等優(yōu)點(diǎn)[10]。此外，一些生物分子在體液循環(huán)過(guò)程中容易被各種酶等降解從而表現(xiàn)出一定的不穩(wěn)定性，而外泌體的包裹可對(duì)其進(jìn)行一定程度上的保護(hù)，從而可以延長(zhǎng)其存活時(shí)間[11]。外泌體體內(nèi)天然來(lái)源的特點(diǎn)賦予了其裝載和保護(hù)重要生物標(biāo)志分子的能力，其檢測(cè)和診斷應(yīng)用備受關(guān)注。另一方面，已有研究表明一些腫瘤組織分泌的外泌體數(shù)量會(huì)比正常組織多[12-14]。更重要的是，一些疾病相關(guān)的標(biāo)志物也會(huì)在其相應(yīng)的外泌體中富集。因此，外泌體作為重要生物標(biāo)志物的檢測(cè)分析是近年來(lái)的熱點(diǎn)。

2.2 外泌體在臨床診斷中的應(yīng)用

有研究表明，對(duì)外泌體的分析可有助于一些疾病的診斷。如，胰導(dǎo)管癌（PDAC）和結(jié)直腸癌（CRC）患者的循環(huán)外泌體中磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（GPC1）的水平相對(duì)于健康對(duì)照組明顯偏高[15-17]。在Cheshomi等[18]的報(bào)道中，膠原蛋白反應(yīng)介導(dǎo)蛋白2（CRMP-2）可在結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Colo205 和SW480 分泌的外泌體中檢出，并可以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步區(qū)分CRC 患者和正常人。此外，通過(guò)檢測(cè)尿液中的前列腺特異性膜抗原適體的陽(yáng)性外泌體，可以進(jìn)行前列腺癌的診斷、提高效率[19]。Jakobsen 等[20-21]開(kāi)發(fā)了一種可以分析外泌體中37 種肺癌相關(guān)蛋白水平的細(xì)胞外陣列技術(shù)。該方法可基于10 μL 血漿樣本的檢測(cè)以區(qū)分非小細(xì)胞肺癌患者與健康個(gè)體，準(zhǔn)確率達(dá)75%。外泌體中的膜蛋白和miRNA 可以作為胰腺癌早期監(jiān)測(cè)和預(yù)后監(jiān)察的生物標(biāo)志物，有助于降低胰腺癌的死亡率[22]。Li 等[19]構(gòu)建了一種基于適配體的納米平臺(tái)，通過(guò)檢測(cè)尿液中的前列腺特異性膜抗原（PSMA）陽(yáng)性的外泌體，以進(jìn)行前列腺癌的診斷。外泌體在診斷應(yīng)用中有著較快的發(fā)展，基于外泌體的癌癥診斷產(chǎn)品已在美國(guó)推出[9,23]。

2.3 外泌體的檢測(cè)分析進(jìn)展

外泌體的納米尺度大小使得其檢測(cè)分析具有一定的挑戰(zhàn)性。為了克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法時(shí)間較長(zhǎng)、儀器昂貴和操作復(fù)雜等問(wèn)題，研究人員已開(kāi)發(fā)出多種用于外泌體檢測(cè)的新型分析方法（尤其是新型生物傳感器），并表現(xiàn)出快速、靈敏、低價(jià)、實(shí)時(shí)檢測(cè)等特點(diǎn)。如，Yu 等[24]以外泌體特異蛋白CD63 作為檢測(cè)目標(biāo)構(gòu)建場(chǎng)效應(yīng)管生物傳感器，成功地檢測(cè)了胰腺癌外泌體。Jiang 等[25]報(bào)道了基于外泌體中蛋白檢測(cè)的金納米粒子比色傳感器，并可分別檢測(cè)CD63 及與腫瘤相關(guān)的多種標(biāo)志蛋白。該方法并不需要昂貴的儀器進(jìn)行分析，只需要通過(guò)肉眼觀察得到的顏色即可分析外泌體中的蛋白組分。Aβ42 低聚體可影響阿爾茨海默癥的進(jìn)展，是一種重要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。以氧化石墨烯（GO）為熒光淬滅劑，結(jié)合熵驅(qū)動(dòng)鏈位移反應(yīng)原理，構(gòu)建熒光信號(hào)放大型生物傳感器，可用于外泌體中Aβ42 的檢測(cè)分析[26-27]。此外，He 等[28-29]通過(guò)構(gòu)建抗體-適配體夾心免疫分析納米裝置，實(shí)現(xiàn)了單外泌體成像。目前，對(duì)外泌體的檢測(cè)主要集中在外泌體本身，以及其所攜帶的蛋白質(zhì)、核酸等重要分子的分析上。針對(duì)這些目標(biāo)物，近年已涌現(xiàn)了大量相關(guān)的傳感檢測(cè)策略，并朝著超靈敏、高通量、多目標(biāo)物檢測(cè)等趨勢(shì)發(fā)展[29-30]。這些檢測(cè)分析方法的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究將為外泌體的臨床診斷提供重要依據(jù)。值得注意的是，疾病的診斷往往需要多方面的信息支持。因此，基于外泌體的臨床診斷應(yīng)用應(yīng)結(jié)合對(duì)外泌體的多維度分析（如同時(shí)分析多種蛋白、基因等），以及其他標(biāo)志性臨床檢測(cè)指標(biāo)，以達(dá)到更精確的診斷。

3 外泌體的治療應(yīng)用

3.1 外泌體在治療應(yīng)用中的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及特點(diǎn)

外泌體的顯著特點(diǎn)之一是其天然存在于體內(nèi)，因此被認(rèn)為具有較好的體循環(huán)穩(wěn)定性[31]。此外，從藥劑學(xué)的經(jīng)驗(yàn)上考量，其納米囊泡結(jié)構(gòu)有利于構(gòu)建藥物/基因遞送系統(tǒng)。藥劑學(xué)領(lǐng)域的大量研究表明脂質(zhì)體（具有磷脂雙分子層的囊泡結(jié)構(gòu)）可作為一種優(yōu)異的藥物載體，但其體內(nèi)的穩(wěn)定性問(wèn)題仍面臨較大的挑戰(zhàn)，而外泌體天然體內(nèi)存在的特點(diǎn)使其在藥物遞送的應(yīng)用方面引起了較大的關(guān)注。已有報(bào)道顯示，外泌體中的一些生物分子可能是其能在體內(nèi)穩(wěn)定存在的物質(zhì)基礎(chǔ)。更進(jìn)一步地，外泌體所裝載的生物分子也可能在藥物遞送中扮演著重要角色。除了穩(wěn)定性方面的性質(zhì)外，外泌體的膜囊泡結(jié)構(gòu)賦予了其一定的生物相容性和親和力。如，得益于其血腦屏障（BBB）的穿透能力，外泌體已被用于一些腦部靶向的研究[32]。另一方面，由于外泌體裝載了多種生物活性分子，其本身亦可能表現(xiàn)出一定的活性。已有多個(gè)研究表明，外泌體參與多種生理、病理的調(diào)節(jié)過(guò)程。因此，外泌體作為活性物質(zhì)具備作為治療劑的潛力。下面將著重介紹外泌體分別作為遞送載體和生物活性物質(zhì)的治療應(yīng)用。

3.2 外泌體作為藥物/基因載體的治療應(yīng)用

由于外泌體的固有特性，包括低免疫原性、體內(nèi)穩(wěn)定性和跨越生物屏障的能力，外泌體作為治療性的藥物/基因的載體具有重要的研究意義和臨床應(yīng)用前景[33]。目前，外泌體已經(jīng)被用于遞送小分子藥物、蛋白質(zhì)、基因等多種類(lèi)型的活性物質(zhì)。

藥物的裝載是外泌體給藥系統(tǒng)的重要環(huán)節(jié)。目前常用的藥物裝載方法可分為物理方法、化學(xué)方法和生物方法。物理方法是較為常用的裝載方式，主要包括電穿孔法、擠出法、超聲法、凍-融法等；化學(xué)方法包括皂苷輔助滲透法和轉(zhuǎn)染法等；生物方法有孵育法和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法等[34]。每一種方法具有不同的特點(diǎn)，可根據(jù)實(shí)際的研究和應(yīng)用需要選取適合的載藥策略。此外，受到脂質(zhì)體載藥策略的啟發(fā)，研究人員已研究出具有長(zhǎng)循環(huán)、靶向等性能的外泌體載藥系統(tǒng)。

目前國(guó)內(nèi)外科學(xué)家已開(kāi)發(fā)各種基于外泌體的藥物遞送系統(tǒng)，并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)考察其治療效果。如，Kim 等[35]通過(guò)超聲處理將化療藥物紫杉醇裝載到巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體中，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)耐藥癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性提高了50 倍，制劑在肺轉(zhuǎn)移小鼠中顯示出很強(qiáng)的抗腫瘤作用。在近期的報(bào)道中，Li 等[36]用人結(jié)直腸癌細(xì)胞系LIM1215 中分離得到的外泌體作為載體裝載阿霉素，并將其工程化構(gòu)建含超順磁性氧化鐵納米顆粒和A33 抗體的制劑，結(jié)果顯示該制劑對(duì)結(jié)腸癌具有良好的靶向性能，而且能降低心臟細(xì)胞毒性。此外，外泌體能夠保護(hù)核酸免受降解，被認(rèn)為是基因治療中核酸（如siRNA 和miRNA）的理想載體。Kobayashi 等[37]將腫瘤抑制因子miR-199a-3p 裝載到外泌體中，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明該miRNA-外泌體可有效減少c-Met的產(chǎn)生，并抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲。另一方面，基于自體乳腺癌細(xì)胞外泌體具有有效的肺靶向能力，Zhao等[38]研制了一種由外泌體膜包裹的白蛋白和siS100A4的新型仿生納米顆粒，并發(fā)現(xiàn)該基于外泌體的siRNA遞送系統(tǒng)能夠顯著抑制乳腺癌的術(shù)后轉(zhuǎn)移。考慮到脂質(zhì)體在藥物遞送中的特性，Lin 等[39]通過(guò)外泌體和脂質(zhì)體的雜交構(gòu)建了一種用于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)遞送的納米粒，并使被遞送的基因較好地在間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)。目前，已有多個(gè)基于外泌體載體的制劑處于臨床研究階段[40]?？偟膩?lái)說(shuō)，生物來(lái)源的外泌體表現(xiàn)出了較好的生物分子負(fù)載能力，能有效地進(jìn)行體內(nèi)遞送，是一種具有重大應(yīng)用前景的藥物/基因載體。

3.3 外泌體作為活性物質(zhì)的治療應(yīng)用

外泌體通過(guò)其中含有的生物活性分子實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)，從而誘導(dǎo)一些生理病理事件的發(fā)生。另外由于外泌體的內(nèi)源性，含有各種生物活性物質(zhì)的外泌體有望開(kāi)發(fā)成為安全有效的治療藥物。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有抗炎和再生作用，也是最常用的外泌體來(lái)源。相對(duì)于直接的細(xì)胞治療，基于外泌體的治療具有穩(wěn)定性好、易于保存和質(zhì)量控制等的優(yōu)勢(shì)。有報(bào)道稱(chēng)，MSCs 分泌的外泌體與其治療作用息息相關(guān)。通過(guò)裝載和傳遞其中的組分，包括miRNA 和蛋白質(zhì)、白介素-10 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，MSCs 分泌的外泌體可以抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用，并通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)重塑促進(jìn)組織再生[41-42]。因此，MSCs 來(lái)源的外泌體具有治療多種疾病的潛力，如心血管疾病、肝損傷、腎損傷和神經(jīng)損傷等。另外，由于樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的抗原呈遞細(xì)胞（APCs）屬性，來(lái)源于DC 的外泌體似可用于抗癌治療。有研究表明，來(lái)源于成熟DC的外泌體可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T 細(xì)胞反應(yīng)[43]。除了抗原呈遞外，DC 來(lái)源的外泌體可通過(guò)其表面蛋白如NKG2D配體和IL-15Rα 激活自然殺傷細(xì)胞[44]。因此，來(lái)自某些類(lèi)型的細(xì)胞（如MSCs 和DC 等）的外泌體具有重要的治療潛力，可以作為生物相容的有效藥物用于治療各種疾病，如器官損傷、癌癥等。然而，在以外泌體作為治療劑時(shí)，由于其較為復(fù)雜的組成，應(yīng)考慮劑量和毒副作用之間的平衡點(diǎn)[45]。

4 小結(jié)與展望

外泌體作為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，已引起大量科研人員的興趣。如上文所述，細(xì)胞來(lái)源的外泌體具有獨(dú)特的性質(zhì)，其在診斷和治療應(yīng)用中的潛力巨大。截至2021 年，已成立了超過(guò)50 家外泌體相關(guān)的企業(yè)（包括上市公司Codiak bioscience），主要涉及外泌體診斷和外泌體治療兩個(gè)方向。目前，基于外泌體的診斷試劑已經(jīng)上市，而外泌體治療相關(guān)的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，相信在不久的將來(lái)會(huì)看到外泌體的相關(guān)治療藥物的臨床應(yīng)用。外泌體領(lǐng)域的研究仍在不斷的探索和進(jìn)步中。外泌體組成復(fù)雜，其研究開(kāi)發(fā)尚處于起步階段，其結(jié)構(gòu)組成、作用機(jī)制等目前還沒(méi)被完全闡明。而不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體可能會(huì)包含一些截然不同的組分。此外，外泌體的研究標(biāo)準(zhǔn)尚存在一些爭(zhēng)議。針對(duì)此情況，Théry 等于2018 年對(duì)外泌體等囊泡進(jìn)行了進(jìn)一步定義，以便相關(guān)研究進(jìn)一步統(tǒng)一。另一方面，外泌體的大量提取制備也是當(dāng)前的一大難點(diǎn)。外泌體的復(fù)雜組分也使其安全性考察顯得尤為重要。作為一個(gè)較新的研究領(lǐng)域，雖然外泌體存在一些需要解決問(wèn)題，但是其巨大的應(yīng)用潛力更是備受矚目。日后的研究可以聚焦于外泌體的形成機(jī)制、組成成分等方面的全維度解析，以及質(zhì)量穩(wěn)定可靠的外泌體的大量制備。雖然外泌體的研究目前還存在一些問(wèn)題，但相信隨著更多關(guān)注的投入，這些問(wèn)題都會(huì)逐漸被解決，外泌體將會(huì)是診斷和治療中的重要工具。本文對(duì)外泌體及其診斷和治療應(yīng)用進(jìn)行了介紹和討論，以期為該領(lǐng)域的科研人員提供一定參考。