Keap1-Nrf2/ARE信號通路介導(dǎo)的昆蟲抗藥性機(jī)制的研究進(jìn)展

曾苑芳，來有鵬

(1.青海大學(xué)，青海 西寧 810016；2.青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室，青海 西寧 810016)

氧化應(yīng)激(oxidative stress)是指生物有機(jī)體在受到各種有害刺激時，體內(nèi)的高分子化合物如活性氧(ROS)和活性氮(RNS)產(chǎn)生過多，導(dǎo)致氧化與抗氧化作用之間的失衡，引起細(xì)胞和組織的生理和病理變化[1]。昆蟲為了在各種環(huán)境和細(xì)胞壓力下生存，已經(jīng)進(jìn)化出了強(qiáng)大的細(xì)胞防御系統(tǒng)來保護(hù)自己免受氧化應(yīng)激和親電壓力，通過許多抗氧化酶和解毒酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、NAD(P)H醌氧化還原酶1(NQO1)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)等來減輕細(xì)胞損傷[2-3]。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(epoxy chloropropane Kelch sample related protein-1，Keap1)-核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)信號通路是抵御細(xì)胞氧化應(yīng)激和異生物質(zhì)反應(yīng)的關(guān)鍵通路[4]。該信號通路調(diào)控的下游靶蛋白主要分為Ⅱ相代謝酶、抗氧化蛋白酶、蛋白酶體/分子伴侶、抗炎因子以及Ⅲ相代謝酶。研究表明Keap1-Nrf2/ARE信號通路與昆蟲抗藥性的產(chǎn)生有著密切的聯(lián)系[5-8]。

長期以來，由于大量和高頻次的使用殺蟲劑，許多害蟲對殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，導(dǎo)致部分殺蟲劑失效。據(jù)統(tǒng)計，已有600多種昆蟲對殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性，成為害蟲防治的一大痛點[9]。昆蟲的抗性機(jī)制主要包括代謝抗性、靶標(biāo)抗性、表皮抗性和行為抗性[10]。其中代謝抗性是指昆蟲體內(nèi)酶過表達(dá)或構(gòu)象改變，導(dǎo)致解毒酶活性升高，從而加速殺蟲劑的代謝而產(chǎn)生的抗藥性。細(xì)胞色素P450酶系(P450s)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarEs)是昆蟲體內(nèi)主要的解毒酶系。

1 Keap1-Nrf2/ARE信號通路基本結(jié)構(gòu)

Nrf2最初由Moi等人在血紅素誘導(dǎo)的紅系K562細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量為66ku，和果蠅的CNC(Cap‘N’Collar)家族同源，屬于堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子(bZip)[11-12]。Nrf2有7個功能結(jié)構(gòu)域，Neh1-Neh7。Neh1包含一個C端亮氨酸b-zip結(jié)構(gòu)域，可與細(xì)胞核內(nèi)的小Maf蛋白形成異二聚體，用于識別并結(jié)合ARE調(diào)控元件，從而啟動目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。Neh2包含DLG和ETEG兩個結(jié)構(gòu)域，是胞漿蛋白Keap1的結(jié)合區(qū)[13]。Neh3位于羧基端，與CHD6結(jié)合可上調(diào)Nrf2靶基因的轉(zhuǎn)錄[14]。Neh4和Neh5參與下游轉(zhuǎn)錄激活，Nrf2-Maf與ARE結(jié)合后需借助輔助蛋白與這兩個結(jié)構(gòu)域結(jié)合才能啟動轉(zhuǎn)錄過程[15]。Neh6能與β-TrcP位點結(jié)合，調(diào)節(jié)Nrf2的降解[16]。RXRa與Nhe7結(jié)構(gòu)域結(jié)合會抑制下游的基因表達(dá)[17]。

Keap1蛋白是一種多區(qū)域阻遏蛋白，與果蠅肌動蛋白結(jié)合蛋白KELCH高度同源，分子質(zhì)量為69ku，是Nrf2的負(fù)調(diào)節(jié)器，通常錨定于胞漿肌動蛋白的細(xì)胞骨架上[13]。Keap1有5個功能結(jié)構(gòu)域，分別為N端區(qū)域、BTB區(qū)域、中間連接區(qū)域、KELCH區(qū)域和C端區(qū)域。BTB區(qū)域附于Actin結(jié)合蛋白上，與Keap1蛋白的二聚化有關(guān)，Ser104位點的突變會影響Keap1的二聚化[18]。KELCH區(qū)域具有多個蛋白接觸點，是Nrf2和Keap1的結(jié)合位點。中間連接區(qū)域含有半胱氨酸殘基，是Keap1與親電子化合物及氧化劑結(jié)合反應(yīng)的區(qū)域，對氧化和核輸出信號敏感。

ARE位于編碼解毒酶和細(xì)胞保護(hù)蛋白基因的上游，是一種包含特定DNA序列的調(diào)節(jié)元件，具有功能活性的區(qū)域長度為16個核苷酸序列：5’-T(A/C)ANN(A/G)TGA(C/T)NNNGC(A/G)-3’。當(dāng)生物體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，Nrf2激活進(jìn)入細(xì)胞核與Maf蛋白結(jié)合形成異二聚體，然后與ARE調(diào)控元件結(jié)合，啟動下游多種基因的表達(dá)。

2 Keap1-Nrf2/ARE信號通路調(diào)控下游代謝酶

借助雙元基因表達(dá)技術(shù)(GAL4/UAS)、基因干擾技術(shù)(RNAi)和基因編輯技術(shù)(CRISPR/Cas9)等來剖析昆蟲外源性解毒機(jī)制，已經(jīng)成為當(dāng)前研究昆蟲抗藥性機(jī)制的一種有利手段。目前，許多通路已被證明參與了解毒基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，與昆蟲抗藥性的形成有關(guān)，如GPCRs、MAPK-CREB、AhR/ARNT、HR96和Nrf2/ARE信號通路，其中Keap1-Nrf2/ARE信號通路是近幾年的研究熱點。Misra早期研究顯示，PB調(diào)節(jié)的一半以上基因受CncC控制，CncC的表達(dá)也會引起這些基因的上調(diào)，利用GAL4/USA系統(tǒng)對過表達(dá)的Keap1進(jìn)行測試，證明了CncC/Keap1通路的激活會影響馬拉硫磷抗性的產(chǎn)生。進(jìn)一步對果蠅的抗性菌株91R和RDDTR解毒基因表達(dá)機(jī)制進(jìn)行研究，CncC/Keap1通路的構(gòu)成性激活，會誘導(dǎo)多個解毒酶基因的過表達(dá)[8]。證明了CncC/Keap1通路在調(diào)節(jié)外源性解毒反應(yīng)中起著核心作用[19]。

P450s是一類在真核細(xì)胞中普遍存在的超基因家族酶系，在昆蟲外源性物質(zhì)解毒方面發(fā)揮著重要的作用。目前，從昆蟲體內(nèi)克隆出的P450基因有CYP4、CYP6、CYP9和CYP18，其中CYP6家族被認(rèn)為與昆蟲抗藥性的產(chǎn)生有關(guān)。有記錄顯示P450s家族參與了擬除蟲菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、吡蟲啉、烯啶蟲胺、茚蟲威等多種殺蟲劑抗藥性的形成，并且部分基因受到了Keap1-Nrf2/ARE信號通路的調(diào)控。Mohammed等報道，崗比亞按蚊CYP6M2啟動子中存在Nrf2/Keap1和AhR/ARNT的結(jié)合位點TFBS，推測這兩個通路可能調(diào)控了殺蟲劑抗性基因CYP6M2的上調(diào)[20]。Peng等用棉酚對棉蚜處理后，其體內(nèi)的CYP6DA2基因的活性顯著增加，RNAi干擾CYP6DA2基因后，顯著增加了棉酚對棉蚜的毒性，同時與對照相比，CncC、CYP6DA2的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，因此CncC可能調(diào)控了CYP6DA2基因的表達(dá)[21]。Kalsi也報道了對擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗藥性的赤擬谷盜QTC279品系體內(nèi)CYP6BQ9基因上調(diào)與CncC/Maf的調(diào)控有密切聯(lián)系，并證明了其結(jié)合位點[22]。后進(jìn)一步敲除CncC基因，采用序列差異表達(dá)分析，QTC279品系中有662個基因表達(dá)下調(diào)，91個基因表達(dá)上調(diào)，并鑒定出了其中16個P450s基因受CncC調(diào)控，分別屬于CYP3、CYP4、CYP6和CYP9基因家族[23]。此外對溴氰菊酯產(chǎn)生抗藥性的基因進(jìn)行研究，Keap1過表達(dá)，Cyp4e3、Cyp4d20、Cyp301a1、Cyp4g1、Cyp28c1、Cyp4ae1、Cyp4p2基因出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象[7]。在斜紋夜蛾體內(nèi)也報道了過表達(dá)的CYP321A16和CYP332A1基因受CncC/Maf通路的調(diào)控[24]。

GSTs是一類多功能的超家族酶系，廣泛分布于生物體內(nèi)[25]。主要通過催化還原型谷胱甘肽(GSH)的巰基與有毒的親電子化合物發(fā)生共價軛合反應(yīng)，將毒性物質(zhì)排出體外，是細(xì)胞解毒過程中的關(guān)鍵酶[26]。Cheng等報道用辛硫磷對家蠶處理24h后，其體內(nèi)的解毒酶基因P450s、GSTs和CarE的表達(dá)量增加，同時檢測到PI3K/Akt通路和CncC/Keap1通路的關(guān)鍵基因上調(diào)[27]。氯蟲苯甲酰胺和吡丙醚處理家蠶后，也出現(xiàn)了同樣的情況，證明了PI3K/Akt/CncC通路參與了這些解毒酶基因的調(diào)控[28-29]。Hu等對甜菜夜蛾的31個胞質(zhì)GSTs基因進(jìn)行了克隆，分析了其生物信息學(xué)和基因表達(dá)模式，其中7個SeGSTs基因顯著表達(dá)，均含有CncC/Maf通路的結(jié)合位點，pGL3-SeGST啟動子結(jié)構(gòu)在接觸殺蟲劑后活性增強(qiáng)，表明了CncC/Maf通路調(diào)控了不同殺蟲劑對甜菜夜蛾GST基因的共表達(dá)[30]。又進(jìn)一步鑒定了三個對毒死蜱和氯氰菊酯抗性有關(guān)的GST基因，CncC、Maf、AhR和ARNT蛋白在GSTe6啟動子的驅(qū)動下熒光素酶活性增加，在HZ16菌株中過表達(dá)，表明了CncC/Maf和AhR/ARNT協(xié)同調(diào)控了多條GST基因的表達(dá)，這些基因參與了甜菜夜蛾的殺蟲劑抗性[31]。其它解毒酶和抗氧化酶也有相關(guān)的報道。Pan等對Sf9細(xì)胞和草地貪夜蛾幼蟲中的SfCncC基因進(jìn)行RNAi處理，顯著降低了SOD基因的轉(zhuǎn)錄水平和活性[32]。Xu等也報道了敲除TcSULT1基因，能顯著增加赤擬谷盜對溴氰菊酯的敏感性，RNAi和雙熒光素酶測定均顯示轉(zhuǎn)錄因子TcCncC調(diào)節(jié)TcSULT1基因的表達(dá)[33]。

目前已有少許報道，抗氧化劑可能參與Keap1-Nrf2/ARE信號通路的調(diào)控，增強(qiáng)了抗藥性的產(chǎn)生。二氧化鈦納米顆粒(TiO2 NPs)是一種家蠶的飼料添加劑，能夠有效提高生絲的產(chǎn)量，對其代謝作用機(jī)制研究顯示，TiO2 NPs處理后可以緩解辛硫磷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，增強(qiáng)辛硫磷在脂肪體內(nèi)的代謝[34]。Lu等用CncC的激活劑姜黃素喂食斜紋夜蛾幼蟲，后暴露于λ-三氯氟氰菊酯殺蟲劑中進(jìn)行耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)姜黃素可誘導(dǎo)CYP6AB12的表達(dá)，增強(qiáng)殺蟲劑的耐受性[35]。Zhou等也報道，原花青素可以減少ROS的產(chǎn)生，負(fù)調(diào)節(jié)Nrf2/ARE信號通路，保護(hù)神經(jīng)元免受氯氰菊酯誘導(dǎo)的氧化損傷[36]。

3 展望

昆蟲抗藥性的不斷產(chǎn)生，已經(jīng)成為制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境保護(hù)的重要因素之一，如何減緩抗藥性的生成和減少農(nóng)藥殘留是當(dāng)前急切需要解決的問題。Keap1-Nrf2/ARE信號通路在引起人類氧化應(yīng)激的疾病中，研究的較多和深入，但在昆蟲抗藥性方面的研究較少。雖然已在擬除蟲菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、吡蟲啉等殺蟲劑方面，取得了突破性的進(jìn)展，但大部分研究仍然處于初步探索階段。昆蟲體內(nèi)的大部分解毒酶是否受到了Keap1-Nrf2/ARE通路的調(diào)控，或是和其它通路共同調(diào)控，內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)是否會激活該通路，誘導(dǎo)下游靶蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)昆蟲的抗藥性，這些仍然是不清楚的，需要進(jìn)一步研究。目前，對果蠅、赤擬谷盜、褐飛虱、馬鈴薯甲蟲、小菜蛾、家蠶等昆蟲CncC和Keap1基因，進(jìn)行了基因組學(xué)和比較基因組學(xué)研究，進(jìn)一步揭示了CncC和Keap1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，以及它們之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為進(jìn)一步研究昆蟲抗藥性分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。