C10orf99下調(diào)對銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞LCN2表達(dá)的影響

陳彩鳳 陳 黎 張丹群

福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建省立醫(yī)院皮膚科，福建福州， 350001

銀屑病是一種慢性炎癥性復(fù)發(fā)性皮膚病，本病發(fā)病率高，全球發(fā)病率約2%～4%[1]。典型臨床表現(xiàn)為局限或泛發(fā)性鱗屑性紅斑或斑塊[1,2]。該病發(fā)病機(jī)制尚未闡明。此病反復(fù)發(fā)作、遷延不愈，給患者帶來巨大的精神心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，極大影響了患者的生活質(zhì)量[1,3]。

C10orf99是近年采用免疫組學(xué)策略發(fā)現(xiàn)并鑒定的新細(xì)胞因子，筆者前期通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)C10orf99通過參與銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和炎癥調(diào)控影響銀屑病的發(fā)生發(fā)展[4]。

LCN2是lipocalin蛋白超家族的成員，是一種分泌的糖蛋白。多項研究顯示LCN2在銀屑病患者皮損及血液中表達(dá)量均明顯升高，并且參與了銀屑病中的炎癥調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖調(diào)控[5-7]。但關(guān)于其上游調(diào)控機(jī)制尚不清楚，本實驗旨在檢測C10orf99下調(diào)對于銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞中LCN2表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 HaCaT長期保存于本實驗室。

1.2 主要試劑 重組人 IL-1α、IL-17、IL-22、TNFα及OSM均購自美國Peprotech公司；Trizol核酸抽提試劑購自Invitrogen公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量熒光底物購自TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；RIPA細(xì)胞裂解液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；兔抗人LCN2(YT7924)購自ImmunoWay公司；通用型SP試劑盒、DAB試劑盒、鼠抗人β-actin及實驗中所用二抗均購自中杉金橋生物公司；慢病毒載體的構(gòu)建和包裝來自上海吉瑪生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HaCaT培養(yǎng) 采用含10% FBS的高糖DMEM常規(guī)培養(yǎng)HaCaT，放置于37℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天更換1次培養(yǎng)基。以1∶5比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長期HaCaT進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實驗。

1.3.2 銀屑病細(xì)胞模型的建立 選擇對數(shù)生長期的HaCaT，按5×105個細(xì)胞/孔接種六孔板。待細(xì)胞生長至80%融合度時，更換為無血清的高糖DMEM培養(yǎng)。次日將培養(yǎng)基換成含10% FBS的高糖DMEM，并加入M5(IL-1α、IL-17、IL-22、TNFα及OSM，終濃度為10 ng/mL)刺激細(xì)胞48 h。

1.3.3 銀屑病動物模型的建立 參照既往實驗方法采用咪喹莫特乳膏構(gòu)建銀屑病動物小鼠模型[4]。

1.3.4 慢病毒的轉(zhuǎn)染 將處于生長期的HaCaT以5×105個細(xì)胞/孔接種六孔板。待細(xì)胞融合度為40%時，將培養(yǎng)基換成含有polybrene(終濃度為5 μg/mL)的無抗高糖DMEM培養(yǎng)基，加入100 μL已解凍的慢病毒顆粒(sh-C10orf99)。對照組加入等量的陰性對照慢病毒顆粒(sh-NC)。輕柔混勻孔中內(nèi)容物，放回CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染病毒48 h后，更換為完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染72 h后，開始使用嘌呤霉素(5 μg/mL)篩選，共篩選14天。

1.3.5 實驗分組及處理 細(xì)胞實驗總共分為4組，分別為對照組(Control組)、M5模型組(M5組)、陰性對照組(sh-NC組，即干擾空載感染穩(wěn)篩細(xì)胞組)和實驗組(sh-C10orf99，即干擾C10orf99感染穩(wěn)篩細(xì)胞組)。Control組即正常對照組；其余三組均予M5干預(yù)。

1.3.6 qRT-PCR 用Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。具體引物序列見表1。進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)，獲取各組標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用計算機(jī)分析Ct值。用β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后用2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量。

1.3.7 Western Blot 使用RIPA裂解各細(xì)胞組的蛋白質(zhì)，應(yīng)用BCA試劑盒測定蛋白濃度。樣品煮沸后開始進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜和5%的牛奶室溫封閉。一抗4℃恒溫?fù)u床孵育過夜；次日，二抗室溫?fù)u床2 h，后使用化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影。

表1 所用引物序列

1.3.8 免疫組化 石蠟標(biāo)本5 μm切片，常規(guī)脫蠟、水化；使用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；用枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)；血清封閉后37℃封閉10 min，一抗4℃過夜；二抗孵育后DAB顯色，后行復(fù)染、脫水，最后封片。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和作圖，組間數(shù)據(jù)比較采用T-test分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LCN2在銀屑病小鼠模型皮損中的表達(dá)情況 采用咪喹莫特乳膏構(gòu)建銀屑病的動物模型，獲取組織總RNA后，使用qRT-PCR檢測LCN2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：咪喹莫特模型組(Model組)小鼠皮損處LCN2 mRNA的表達(dá)水平明顯高于對照組(Control組)小鼠皮膚處的表達(dá)量(P<0.05)。見圖1。同時采用免疫組化法進(jìn)行蛋白水平的檢測，結(jié)果顯示LCN2低表達(dá)于正常小鼠皮膚組織中的表皮層，而其高表達(dá)于咪喹莫特銀屑病小鼠皮損中增厚的表皮棘層及下延的表皮突中。見圖2。

2.2 C10orf99慢病毒轉(zhuǎn)染效率的驗證 根據(jù)吉瑪公司提供的實驗指導(dǎo)，我們成功獲得了穩(wěn)定感染慢病毒的HaCaT株。為明確慢病毒的效果，我們收集了病毒轉(zhuǎn)染后的HaCaT，提取了細(xì)胞總RNA。qRT-PCR結(jié)果顯示：與sh-NC相比，C10orf99慢病毒感染的sh-C10orf99組HaCaT中C10orf99 mRNA的表達(dá)水平大幅度下降。見圖3。

2.3 LCN2在銀屑病細(xì)胞模型中的表達(dá)情況及C10orf99表達(dá)下調(diào)后HaCaT中LCN2的表達(dá)情況 采用M5刺激HaCaT細(xì)胞來構(gòu)建銀屑病細(xì)胞模型。結(jié)果示：與正常組相比，M5模型中LCN2 mRNA和LCN2蛋白的表達(dá)水平均明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明LCN2在M5銀屑病細(xì)胞模型中表達(dá)量明顯增加。此外，當(dāng)我們使用慢病毒敲低HaCaT中C10orf99后，數(shù)據(jù)顯示，與sh-NC組相比，C10orf99敲低組中LCN2 mRNA和LCN2蛋白的表達(dá)水平明顯下降，表明C10orf99的敲低下調(diào)了銀屑病細(xì)胞模型中LCN2的表達(dá)。見圖4、5。

圖1 LCN2 mRNA在各組小鼠皮損組織中的表達(dá)情況(* P<0.05) 圖2 銀屑病小鼠(2a)與正常小鼠(2b)皮膚組織中LCN2的表達(dá)(SP)

圖3 qRT-PCR 法檢測各細(xì)胞組中C10orf99 mRNA的相對表達(dá)量(*P<0.05) 圖4 LCN2 mRNA在各細(xì)胞組中的表達(dá)情況(*P<0.05 vs Control; # P<0.05 vs sh-NC) 圖5 LCN2蛋白在各細(xì)胞組中的表達(dá)情況

3 討論

銀屑病是常見的慢性系統(tǒng)性炎癥性皮膚病。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未闡明。目前銀屑病治療方法多樣，但是該病病情頑固、易反復(fù)，尚不能治愈，且患者常罹患代謝綜合征、心臟病等多種合并癥，對患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[1，8，9]。因此，銀屑病是亟待解決的世界性健康難題之一，進(jìn)一步研究及探尋更有效安全的治療新策略或者新靶點是銀屑病研究領(lǐng)域的重點和難點。

近來多項研究顯示LCN2高表達(dá)于銀屑病、濕疹和損傷皮膚等多種炎性皮膚病和角化棘皮瘤、鱗癌等皮膚腫瘤中，提示其在抗炎、細(xì)胞增殖分化中扮演重要角色[5，6，10-12]。作為中性粒細(xì)胞趨化因子，LCN2通過調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的功能和放大TH17細(xì)胞功能參與銀屑病發(fā)病機(jī)制，IL-17也誘導(dǎo)LCN2的產(chǎn)生和分泌，形成炎癥循環(huán)進(jìn)一步放大炎癥網(wǎng)絡(luò)[7，13]。動物實驗示中和LCN2后明顯改善銀屑病表皮的異常增生和炎癥情況[13]。但關(guān)于其具體上游調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步明確。

C10orf99是潛在新細(xì)胞因子，其異常表達(dá)于浸潤性導(dǎo)管癌、食管癌、肝細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌等多種腫瘤組織[14，15]。最新研究發(fā)現(xiàn)其是孤兒受體GRR15的天然配體，參與調(diào)節(jié)皮膚及胃腸道處淋巴細(xì)胞的募集[16，17]。另有研究發(fā)現(xiàn)C10orf99 mRNA在銀屑病皮損中表達(dá)增加[18]。筆者既往研究發(fā)現(xiàn)C10orf99通過ERK1/2和NF-κB信號通路參與了角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖調(diào)控[4]。動物實驗提示C10orf99還通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與銀屑病發(fā)生發(fā)展，但具體有待進(jìn)一步實驗研究[4]。

本次研究我們發(fā)現(xiàn)LCN2高表達(dá)于銀屑病細(xì)胞模型中，并確認(rèn)了其在銀屑病動物模型中表達(dá)量是增加的，此結(jié)果與既往報道一致[7，13]。通過慢病毒轉(zhuǎn)染成功獲得了C10orf99低表達(dá)的HaCaT株，并發(fā)現(xiàn)C10orf99的下調(diào)抑制了炎癥微環(huán)境HaCaT中LCN2的表達(dá)，表明C10orf99很可能通過調(diào)控LCN2的表達(dá)來參與銀屑病炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，具體有待后續(xù)進(jìn)一步實驗研究。該實驗發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實C10orf99在銀屑病發(fā)生機(jī)制中扮演著重要角色，為探尋銀屑病潛在治療靶點提供了新的思路。