雙光子鈣成像技術在嚙齒類動物前邊緣皮層中的應用研究進展

趙心愿，楊 洋，孫偉銘a,,e，賀彬峻，趙 紅，馮 珍，馬朝林

(南昌大學a.第一附屬醫(yī)院康復醫(yī)學科； b.第一臨床醫(yī)學院2019級； c.生命科學學院；d.生命科學研究院； e.第一臨床醫(yī)學院康復醫(yī)學教研室，南昌 330006)

鈣離子(Ca2+)是生物體內最重要的信使之一，可產生多種細胞內信號控制神經元的關鍵功能[1]。細胞鈣信號與神經系統(tǒng)內各種細胞的興奮性、細胞通訊、遞質釋放、突觸可塑性以及基因轉錄等生理、病理過程相關，監(jiān)測細胞內鈣信號變化有助于研究鈣依賴的生理過程以及神經活動[2]。以往細胞內Ca2+檢測方法主要是電生理技術，這項技術存在一些缺點，特別表現(xiàn)在長時間記錄細胞活動時，電生理記錄使用的電極會隨著時間改變位置，即發(fā)生電極漂移，導致電極無法持續(xù)監(jiān)測特定細胞的信號[3]。細胞內鈣濃度變化能產生可被光學方法有效檢測到的信號，鈣成像技術利用這一特點，通過將鈣離子指標與適當?shù)墓鈱W成像技術相結合，可以在體外如神經元培養(yǎng)或腦切片，以及在動物模型的體內、腦內監(jiān)測鈣離子變化[4]。目前較常見的鈣成像技術包括單光子鈣成像技術、雙光子鈣成像技術、光纖記錄技術和深腦顯微鈣成像技術等。雙光子鈣成像能在活體條件下對特定細胞中鈣變化的時空動力學進行測量，實現(xiàn)在深層組織細胞水平上的形態(tài)和生理學監(jiān)測，是更理想的研究工具[2]。

人類背外側前額葉(dorsolateral PFC,dlPFC)負責認知、情感和感覺處理等多種重要功能。大多數(shù)關于前額葉皮層認知功能的理論都來自于對人類和非人靈長類動物的研究，有待在嚙齒類動物中進行轉化。dlPFC怎樣為靈長類動物提供獨特的心智能力的問題，也需要在不同物種之間進行比較性的研究[5]。與人類dlPFC功能相似的嚙齒動物前邊緣皮層(prelimbic cortex,PrL)雖被廣泛研究，但在活體動物模型上長時程、小創(chuàng)傷和精準的監(jiān)測實施較少，應用雙光子鈣成像技術可以對該皮層中神經功能機制繼續(xù)深入的探究。 可見，應用雙光子鈣成像技術監(jiān)測嚙齒動物不同疾病模型或特定行為過程中PrL區(qū)細胞鈣信號，分析其病理、生理過程，利于豐富有關人類dlPFC功能的研究。本文全面綜述了雙光子鈣成像技術在嚙齒動物PrL腦區(qū)的活動和功能機制研究中的應用。

1 雙光子鈣成像技術概述

鈣成像技術能夠可視化和定量檢測細胞內的鈣信號。鈣成像應用于神經系統(tǒng)時，可根據實驗要求來選擇合適的鈣指示劑、不同染料負載技術以及體外或體內鈣成像設備。鈣成像技術的發(fā)展主要包括鈣傳感器以及其相應儀器的發(fā)展和不斷改進[1]。其主要的進展是在1990年DENK等[6-7]引入雙光子顯微鏡，并將其用于神經系統(tǒng)的鈣成像。

近年來，雙光子鈣成像技術已成為探究皮層神經元功能的一種常用方法。雙光子顯微鏡系統(tǒng)主要由激光發(fā)射器、光束擴展器、二向色鏡、物鏡、探測系統(tǒng)、數(shù)據采集系統(tǒng)組成。主要過程是激光發(fā)射器發(fā)出激光，經過光束擴展器的調整被轉換成對稱均勻的平行光束，光束透過二向色鏡，經過物鏡匯聚到皮層目標區(qū)域，激發(fā)后的皮層目標區(qū)域發(fā)出相應熒光，再通過二向色鏡反射到探測系統(tǒng)，最終探測到的信號由數(shù)據采集系統(tǒng)收集[3]。雙光子鈣成像能在單細胞甚至突觸水平來研究神經元的鈣活動，且其大范圍的細胞分辨率成像能夠同時記錄數(shù)百個細胞[2]。它使一系列關于嚙齒類動物的神經科學研究成為可能，如分析皮層之間的功能連接、皮層對各種感覺刺激的反應、行為過程中的神經活動、神經血管耦合以及軸突結構和功能等諸多研究[8]。目前小動物雙光子活體成像在神經科學、神經藥理學、腫瘤治療、免疫學、干細胞應用等領域廣泛應用[9]。

2 PrL腦區(qū)

人類前額皮層(Prefrontal cortex,PFC)指初級運動皮層和次級運動皮層以外的全部額葉皮層。許多神經成像研究關注于人類前額葉皮層的功能定位和劃分，其中dlPFC、背內側(dorsolateral prefrontal cortex，dmPFC)、腹內側(ventromedial prefrontal cortex，vmPFC)和眶額葉前部皮質(orbital prefrontal cortex,OFC)是常見的功能分區(qū)[5]。dlPFC的功能通常與自上而下調節(jié)的維持和調節(jié)以及驅動適當?shù)男袨榉磻嘘P，它在注意力、價值編碼、工作記憶、創(chuàng)造力、決策和情緒調節(jié)等認知過程中發(fā)揮重要作用[10]。

嚙齒動物PFC由多個子區(qū)域組成，具有明顯的連通性和功能。內側前額葉皮質(medial prefrontal cortex，mPFC)是一個被廣泛研究的大腦區(qū)域，它與其他腦區(qū)有著廣泛而復雜的聯(lián)系。其中，PrL是mPFC的關鍵腦區(qū)，與動機、注意和獎勵相關等信息加工密切相關[11]。目前，PrL的劃分和術語名稱存在差異，VAN DE WERD等[12]在Paxinos和Franklin定義的OFC中發(fā)現(xiàn)了下邊緣皮層(infralimbic cortex，IL)和PrL。此外，CARLéN[5]還將部分前邊緣皮層置于Paxinos和Franklin定義的扣帶皮層2區(qū)(cingulate cortex 2，Cg2)。從功能上看,嚙齒類動物的PrL與靈長類動物的dlPFC功能相似[11]，可大致對應人類Brodmann分區(qū)系統(tǒng)中32區(qū)[13]。靈長類動物dlPFC通過32區(qū)與25區(qū)進行交流以平衡理智與感情[14]。對嚙齒動物PrL深入研究有利于進一步了解人類背外側前額葉的神經機制。

3 雙光子鈣成像在PrL區(qū)的應用

3.1 在動物疾病模型的應用

雖然不同物種之間很少有相同的行為，但某些為解決日常生活中必要需求的行為在哺乳動物中都可以看到，這類活動被稱為類共同行為(class-common behaviors)。類共同功能和行為的存在支持了涉及背外側前額葉皮質的基本神經活動過程可以在嚙齒類動物中進行有效研究的觀點[5]，所以對動物模型的研究很有必要。應用雙光子成像技術在應激、抑郁、阿爾茲海默癥等動物疾病模型上監(jiān)測PrL腦區(qū)神經元形態(tài)、數(shù)量、功能等的改變，目的是詳細描述病理生理機制。在動物疾病模型上開展藥理學研究，有助于研究藥物治療機制，對藥物有效性和安全性進一步評價。

3.1.1 在應激嚙齒類動物模型中的應用

應激(壓力)會導致焦慮出現(xiàn)或加重，甚至造成認知障礙。同時，應激(壓力)也是許多精神疾病的主要風險因素，如精神分裂癥、廣泛性焦慮障礙、重度抑郁障礙、雙相情感障礙和創(chuàng)傷后應激障礙[15]。嚙齒類動物研究表明，應激(壓力)會誘導PFC、海馬和杏仁核神經元的樹突形態(tài)和樹突棘發(fā)生顯著變化。LIU等[16]對小鼠進行應激處理后用雙光子激光掃描系統(tǒng)對Cg1和PrL區(qū)的第5層神經元進行成像，發(fā)現(xiàn)頂端樹突的長度和遠端樹突的密度降低，進而導致頂端靶向興奮性輸入的反應減弱。LIU等[15]對小鼠進行7 d約束應激實驗后進行雙光子成像，發(fā)現(xiàn)慢性約束應激導致前扣帶皮層(anterior cingulate,ACC)與PrL的樹突回縮及樹突密度降低。

3.1.2 在抑郁癥嚙齒類動物模型中的應用

有研究[17]表明，抑郁癥患者PFC的突觸密度降低。同樣，嚙齒動物慢性應激模型的額葉皮層中也出現(xiàn)突觸缺陷，包括樹突分支的減少、樹突密度的降低和神經傳遞的衰減[18]。

30%的普通人群攜帶BDNF基因多態(tài)性，導致pro BDNF蛋白第66密碼子(Val66Met)中纈氨酸到蛋氨酸的替代，攜帶Met多態(tài)性的人患與壓力相關的嚴重抑郁癥的風險增加。LIU等[19]將具有人類常見的BDNF Val66Met多態(tài)性基因敲入小鼠，使用雙光子激光掃描系統(tǒng)對前扣帶回第5層和PrL區(qū)內標記的神經元進行成像，發(fā)現(xiàn)小鼠的遠端的樹突頂端發(fā)生了結構性萎縮，PFC第5層錐體細胞的頂端靶向性興奮性突觸后電流(EPSCs)減少，樹突密度和直徑減少，突觸形成和成熟受損。

多項研究[20-21]表明，東莨菪堿在抑郁癥患者中可產生快速抗抑郁作用。VOLETI等[22]對東莨菪堿治療1 d后的抑郁癥大鼠進行麻醉取腦，從含有mPFC的組織塊上切下400 μm厚的冠狀切片，采用雙光子激光掃描系統(tǒng)對前扣帶回第5層和PrL區(qū)內標記的神經元進行成像，發(fā)現(xiàn)東莨菪堿顯著增加了PFC第5層神經元遠端節(jié)段棘突密度，近端樹突密度無明顯增加。此外，東莨菪堿可使上述神經元的遠端和近端節(jié)段的樹突棘直徑增加，但增加程度并不顯著。

3.1.3 在精神分裂癥嚙齒類動物模型中的應用

精神分裂癥是一種常見的異質精神疾病，它的特征是出現(xiàn)陽性癥狀(妄想、幻覺和混亂的行為)，陰性癥狀(缺乏動機、情感遲鈍、表達貧乏和社交退縮)，以及持久的神經認知障礙(注意力、處理速度、工作和長期記憶、執(zhí)行功能和社會認知)。精神分裂癥患者樹突棘的過度修剪和異常的突觸可塑性會導致大腦連接錯誤和突觸效率低下，從而導致精神分裂癥的主要負面癥狀和認知缺陷[23]。

ZHOU等[24]利用在體雙光子成像技術對清醒小鼠PrL神經元鈣濃度的變化進行記錄，基于鈣峰值的總數(shù)和鈣瞬變頻率來看，精神分裂癥合并抑郁癥的小鼠模型與經典抑郁模型、經典精神分裂癥模型以及未處理的對照組小鼠相比，神經元活動均顯著減少，鈣信號較低。這表明伴有抑郁癥的精神分裂癥可能涉及一種獨特的病理生理學，與單獨的精神分裂癥或抑郁癥不同。

人類CHRNA5基因中編碼a5 nAChR亞基的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)增加了吸煙和精神分裂癥的風險[25]。KOUKOULI等[26]對表達人類α5 SNP的清醒小鼠的PrL進行在體雙光子鈣成像來評估靜息態(tài)網絡活動，發(fā)現(xiàn)小鼠神經元活動減少，表現(xiàn)出類似精神疾病患者(包括精神分裂癥和成癮患者)前額葉活動過低的現(xiàn)象。

3.1.4 在阿爾茲海默病嚙齒類動物模型中的應用

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)以大腦皮層和海馬體淀粉樣斑塊和神經纖維纏結(NFTs)的擴散為特征。同時，可溶性β淀粉樣蛋白(Aβ)寡聚物也被證實在AD患者的大腦中積累，其與認知功能障礙的相關性大于斑塊沉積的程度。KOUKOULI等[27]通過以PrL為靶點向成年小鼠體內立體定向注射人突變淀粉樣前體蛋白(AAV-hAPP)來誘導AD樣缺陷。小鼠在體雙光子成像顯示，在可溶性寡聚物積累過程中，小鼠神經元活動增加，Aβ干擾了PFC神經元的同步自發(fā)活動，PFC以超低波動模式為病理特征。

3.2 用于正常動物高級認知活動的研究

嚙齒動物PrL與靈長類的dlPFC功能相似，在認知過程起到重要作用。在特定行為過程中對動物PrL區(qū)進行雙光子成像可以探索對任務的編碼及表現(xiàn)。

3.2.1 獎勵尋求機制的研究

嚙齒類動物的mPFC皮層和皮層下結構廣泛連接形成神經回路[28]，神經回路起到目標導向、幫助獲得習慣性行為的作用[29]。巴甫洛夫條件反射是刺激與結果形成關聯(lián)的過程[30]，通過監(jiān)測整個巴甫洛夫獎賞條件反射過程中神經元的活動有助于研究者們探索復雜的神經回路如何編碼獎賞相關信息來指導行為輸出，KONDO等[31]發(fā)現(xiàn)PrL的神經活動比mPFC的淺表部(M2)更活躍。獎勵前階段的PrL活動可能反映了對獎勵發(fā)放的期望，包括激勵、對獎勵的預測或對獎勵時間的關注。OTIS等[32]發(fā)現(xiàn)前額葉皮層輸出回路通過不同的線索編碼來引導獎勵尋求，具有投射特異性和解剖分離特性的前額葉神經元可以具有相反的活動動力學、可塑性和對條件獎賞尋求的功能控制。GRANT等[33]發(fā)現(xiàn)dmPFC中的異質性興奮性神經元集合在線索-獎勵學習中形成了專門的編碼模式，并在學習后穩(wěn)定保持，興奮性輸出神經元的活動動態(tài)可用于線索檢測、線索辨別、獎勵檢測以及學習后舔舐的預測。但KONDO等[34]將小鼠頭部固定，用兩種聲音線索訓練小鼠(這兩種聲音所獲得供水的概率不同)。在這一經典的條件反射訓練后，實驗者對小鼠3個背側額葉區(qū)域(背內側額葉皮層、背外側額葉皮層、初級運動皮層)和PrL背側部分進行雙光子成像后顯示：在小鼠接收聲音線索來預測獎賞結果(獎賞或不獎賞)的過程中，dmPFC深層神經元活動最為強烈。

3.2.2 在注意轉移活動中的應用

為了監(jiān)測PFC神經元中與注意力轉移相關的活動，SPELLMAN等[35]通過對PrL和IL進行雙光子鈣成像，發(fā)現(xiàn)PFC輸出神經元不是實時調節(jié)注意力，而是整合和維護最近的行為及其后果的表征。mPFC活動并不會使注意轉移過程中的感覺運動反應產生偏差，而是通過編碼試驗反饋信息來實現(xiàn)注意轉移。

3.3 用于GABA-A受體激活對錐體神經元影響的研究

皮層中間神經元激活GABA-A受體，以快速調控錐體神經元的電信號和生化信號。為研究中間神經元抑制棘突和樹突Ca2+信號的能力，MARLIN等[36]使用雙光子顯微鏡對小鼠PrL的急性冠狀切片中的胞體和樹突進行成像，發(fā)現(xiàn)GABA-A受體的激活可顯著抑制第5層錐體神經元棘突和樹突的動作電位Ca2+信號。

3.4 對丘腦投射通路的研究

丘腦和前額葉皮層(PFC)之間的相互作用在認知功能和覺醒中起著關鍵作用，ANASTASIADES等[37]結合解剖示蹤術、電生理學、光遺傳學、雙光子鈣成像和藥理學發(fā)現(xiàn)背內側丘腦和腹內側丘腦2個高階丘腦投射到前額葉PrL區(qū)第一層(Layer1,L1)的不同網絡。丘腦核具有獨特的抑制微回路，可以影響樹突和胞體的活動，對PFC的功能具有重要意義。

4 總結與展望

雙光子鈣成像技術的應用是鈣成像領域的一大進展，極大地便利了在亞細胞結構或水平上的研究。雙光子鈣成像技術在嚙齒動物PrL的應用，可幫助研究者們了解在特定行為下該區(qū)神經元的編碼機制以及特定類型神經元突觸功能和突觸可塑性。通過構建動物疾病模型，對疾病的發(fā)生發(fā)展以及轉歸機制進行研究，可為疾病預防與治療提供新的方向。目前，對于嚙齒類動物前邊緣皮層的研究主要在小鼠模型中進行，對于大鼠等其他嚙齒動物前邊緣皮層的神經機制研究相對較少。今后可以拓展實驗動物類型，用雙光子鈣成像技術觀察特定神經元鈣活動，進一步在單細胞甚至突觸水平了解各種疾病發(fā)病機制及其特征，也可比較嚙齒動物間皮層機制的異同，間接幫助研究者們更深層次地探索人類背外側前額葉皮層的功能與神經機制。

未來雙光子鈣成像技術的固定裝置、成像視窗的構建方法以及成像窗口方法會不斷進步，在活體成像時提高圖像穩(wěn)定度、清晰度，提高觀察深度和精度[9]，為監(jiān)測神經細胞鈣離子變化提供更高質量設備基礎。目前，雙光子鈣成像技術在PrL腦區(qū)的應用相對較少，但隨著該技術的不斷進步以及腦科學的不斷發(fā)展，更多dlPFC背外側前額葉的高級神經機制也將在嚙齒動物體內進行探索。