魚類神經(jīng)壞死病毒研究進展

謝海舟，王朝溪，歐陽松應,3

(1.福建師范大學南方生物醫(yī)學研究中心，福建 福州 350117；2.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，湖北 武漢 430070；3.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117)

石斑魚肉質(zhì)細膩肥美、營養(yǎng)豐富，已成為我國大量養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟魚類之一，2020年養(yǎng)殖量19.2萬t，占全國海水魚養(yǎng)殖總量的11%[1]．但石斑魚養(yǎng)殖過程中面臨著重大的風險，石斑魚為易感染神經(jīng)壞死病毒(nervous necrosis virus，NNV)的魚類，病毒主要影響石斑魚苗種生產(chǎn)期的仔魚和幼魚，導致魚的腦細胞與視網(wǎng)膜壞死產(chǎn)生空泡，繼而發(fā)病使魚苗死亡，死亡率最高可達100%[2]．2018—2020年我國神經(jīng)壞死病毒抽查陽性率分別為29%、18.2%與12.3%[3]，是我國養(yǎng)殖魚類病毒中檢出率較高的病毒．

NNV屬于諾達病毒科β諾達病毒屬，為引起石斑魚的病毒性神經(jīng)壞死病(viral nervous necrosis，VNN)的病原．NNV于20世紀80年代在澳大利亞發(fā)現(xiàn)，病毒形態(tài)為無包膜的二十面體，大小約為25 nm，在氯化銫中浮力密度為1.30～1.34 g·cm-3，病毒的遺傳物質(zhì)為RNA，基于上述特點該病毒最早被認為是類小RNA病毒[4]．之后在對病毒顆粒以及RNA基因組的鑒定中發(fā)現(xiàn)其RNA基因組由兩條單鏈正義RNA組成，分別為2 970 bp的RNA1和1 440 bp的RNA2，且RNA鏈的3′末端沒有poly(A)序列，故將其歸類為諾達病毒科，并因為這種病毒主要感染魚的神經(jīng)中樞，將其命名為神經(jīng)壞死病毒[2]．

當前主要采用西澤所提出的方法對NNV進行分類，根據(jù)神NNV RNA2的同源性，可將NNV分為4類，分別為條斑星鰈神經(jīng)壞死病毒(barfin flounder nervous necrosis virus，BFNNV)、赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒(redspotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV)、擬鲹神經(jīng)壞死病毒(striped jack nervous necrosis virus，SJNNV)與紅鰭東方鲀神經(jīng)壞死病毒(tiger puffer nervous necrosis virus，TPNNV)[5](如圖1)．此外，也可根據(jù)抗原表位的不同分為A、B、C 3種血清型，A型對應SJNNV，B型對應TPNNV，C型對應RGNNV與BFNNV[6]．

圖1 根據(jù)不同基因型病毒株衣殼蛋白序列構(gòu)建的分子進化樹Fig.1 Molecular phylogenetic tree constructed from capsid protein sequences of virus strains of different genotypes

1 NNV基因組與編碼的蛋白

NNV的RNA1與RNA2分別編碼RNA依賴性的RNA聚合酶(RdRp)與衣殼蛋白(CP)，RNA1的3′末端亞基因組中可產(chǎn)生RNA3，RNA3僅存在于病毒感染細胞的過程中，可編譯B1與B2兩個小蛋白[2,7]．

CP蛋白為NNV的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，大小約為37 ku，可形成同源三聚體．RGNNV的CP蛋白三維結(jié)構(gòu)可將其分為4個區(qū)域：N端的N-arm可以結(jié)合病毒的核酸，從而對病毒的遺傳物質(zhì)起到保護作用，S-domain為病毒衣殼的主要組成部分，P-domain是病毒衣殼上的突刺的主要組成部分，linker region連接S-domain與P-domain[8-9](圖2a-b)．3個CP蛋白共用3個鈣離子，鈣離子與病毒顆粒的形成、病毒的穩(wěn)定性與感染力有關(guān)．CP蛋白可以與多腺苷酸結(jié)合蛋白(PABP)相互作用，降解PABP及抑制細胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯[10]，CP蛋白的表達還可以激活Caspase-8與Caspase-3，進而最終導致細胞的凋亡[11]．RdRp為NNV編碼的最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，大小約100 ku，在病毒入侵之后定位于宿主線粒體[12]，利用宿主核糖體以RNA1為模板進行RdRp的合成，之后RdRp對病毒自身基因組進行復制，并參與病毒基因組RNA 5′端的加帽以及指導病毒的亞基因組RNA3的產(chǎn)生．

(a)RGNNV CP蛋白三維結(jié)構(gòu)(Cartoon模式)：紫色結(jié)構(gòu)域為N-arm,紅色結(jié)構(gòu)域為S-domain,青色結(jié)構(gòu)域為linker region,藍色結(jié)構(gòu)域為P-domain,黃色球狀粒子為鈣離子;(b)RGNNV病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)圖；(c)B2蛋白(紅與藍)與dsRNA結(jié)合模式圖圖2 RGNNV CP與B2FHV蛋白結(jié)構(gòu)Fig.2 Protein of RGNNV CP and B2FHV

B1蛋白由NNV的RNA1的3’末端的亞基因組中產(chǎn)生的RNA3轉(zhuǎn)錄翻譯而來，分子質(zhì)量為12 ku．B1蛋白為感染早期表達的蛋白，從感染之后12 h開始表達，表達之后定位于細胞核中，B1蛋白的表達可以防止受感染細胞的死亡[13]，還可以使細胞周期停留于G1/S期，從而短暫的阻止細胞凋亡，為產(chǎn)生新的病毒爭取足夠的時間[14]．B2蛋白由RNA3產(chǎn)生，大小約為8.5 ku，在感染后24 h可檢測到B2蛋白的表達．B2蛋白主要存在于細胞核中，細胞質(zhì)中的B2蛋白主要集中于線粒體中[15-16]．在RNA病毒復制過程中，產(chǎn)生的dsRNA會被RNAi途徑切割，而B2蛋白可以與dsRNA結(jié)合，對RNAi起拮抗作用，從而保護病毒的基因組[15-17]．NNV的B2蛋白與dsRNA的結(jié)合模式可能類似于α諾達病毒屬的FHV(flock house virus)中B2蛋白(B2FHV)與dsRNA的結(jié)合模式，B2FHV蛋白自身形成同源二聚體，與dsRNA雙螺旋上的大溝相互作用，一條長24 bp的dsRNA可結(jié)合三對B2蛋白的同源二聚體，以此保護核酸不受RNAi的影響[17](圖2c)．線粒體上的B2蛋白可以抑制線粒體電子傳遞鏈中的復合體Ⅱ的活性，導致ATP的產(chǎn)生受到抑制與細胞內(nèi)的活性氧的含量上升，使線粒體發(fā)生斷裂并觸發(fā)氧化應激介導的細胞死亡[18-19]．

2 NNV受體與誘導的免疫反應

2.1 NNV受體研究

NNV侵入細胞首先需要和細胞膜表面的蛋白相互作用，吸附至細胞膜表面，進而與膜上的受體蛋白相結(jié)合，然后通過網(wǎng)格蛋白依賴性的胞吞作用進入細胞中，并且以pH和細胞骨架依賴性的方法進入細胞內(nèi)[20]．使用神經(jīng)酰胺酶處理后的細胞可以大幅度降低NNV對細胞的附著，說明細胞膜外可能存在某種糖蛋白可以幫助NNV依附于細胞表面，起到富集病毒顆粒的作用[21]．目前鑒定的NNV受體蛋白有Nectin4、HSP70與HSP90ab1，對這3個基因的分別敲低均可降低或抑制NNV的感染[22-24]．Nectin-4為Nectin家族的成員，在上皮細胞極化過程中參與粘附連接的形成，且可以調(diào)節(jié)多種細胞活動，包括細胞的運動、極化以及分化[25]．HSC70與HSP90ab1在細胞膜外錨定于網(wǎng)格蛋白上，可與NNV形成NNV-GHSC70/HSP90ab1-網(wǎng)格蛋白復合物，之后通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用進入細胞[24]．

2.2 NNV誘導的免疫反應

病毒的感染可以誘導引發(fā)宿主的一系列免疫應答，先天免疫為宿主抵御病毒的第一道防線，干擾素(IFNs)與干擾素刺激基因(ISGs)為魚類先天性免疫的重要組成部分．硬骨魚中存在Ⅰ型、Ⅱ型與Ⅳ型IFN[26-27].Ⅰ型IFN可分為IFNa、IFNb、IFNc、IFNd、IFNe、IFNf、IFNh等7個亞型，目前報道的I型IFN的異源受體主要組合有細胞因子受體CRFB1/CRFB5和CRFB2/CRFB5；Ⅱ型IFN包括IFN-γ和IFN-γrel，由自然殺傷細胞(NK)與自然殺傷T細胞(NKT)產(chǎn)生，與IFNGR1/IFNGR2受體復合物相互結(jié)合；Ⅳ型IFN為IFN-υ，可通過作用于受體IFN-υR1與CRFB4以誘導干擾素刺激基因的表達，使細胞進入抗病毒狀態(tài)[27]．其中Ⅰ型干擾素作為最主要的抗病毒干擾素，與受體結(jié)合后形成信號傳導復合物，進一步激活JAK/STAT信號通路，最終通過上調(diào)細胞核中ISGs的表達，ISGs可進一步發(fā)揮抗病毒功能[26]．

在感染了NNV的大菱鲆中，IFN-γ引起抗病毒因子Mx蛋白的表達上調(diào)，進而引發(fā)Ⅰ型IFN的表達升高[28]，且Mx蛋白可誘導RdRp的降解[29]．在感染了NNV的石斑魚中發(fā)現(xiàn)了Ⅰ型IFN的表達上調(diào)[30]．感染了RGNNV的石斑魚脾臟(GS)細胞中檢測到了泛素特異性蛋白酶12(USP12)、T細胞胞內(nèi)抗原(TIA-1)、線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TRAF3)等一系列蛋白的表達升高，它們都可作為IFN信號傳導的正調(diào)節(jié)因子，增加IFN相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平[31-34]．圖3為NNV入侵宿主以及產(chǎn)生相應免疫應答的詳細機制圖．

① NNV吸附至細胞膜表面，之后與受體Nectin-4、HSC70、HSP90相互作用，進入細胞；② IFN與受體相互作用，激活JAK/STAT信號通路，引起STAT1磷酸化，磷酸化的STAT1與IRF9結(jié)合，入核激活I(lǐng)SGs基因的轉(zhuǎn)錄；③ Mx與RdRp相互作用，將RdRp引導至細胞核附近的溶酶體中進行降解；④ RLRs識別細胞質(zhì)中NNV的dsRNA，將信號轉(zhuǎn)導至MAVS，MAVS活化IRF-3/7，促進IFN表達，激活NF-κB信號通路，促進促炎細胞因子的表達；⑤ TNFR被TNFα/β激活，信號轉(zhuǎn)導至TRAF3/NIK復合物，誘導TRAF3降解，引起NIK的積累，NIK激活I(lǐng)KKα，激活NF-κB信號通路圖3 NNV入侵宿主以及相關(guān)免疫應答機制Fig.3 NNV invasion of host and related immune response mechanism

獲得性免疫為機體抵御病毒的第二道防線，包括體液免疫與細胞免疫2個方面．B淋巴細胞為魚類體液免疫的主要效應細胞，分泌免疫球蛋白IgM對入侵的病毒進行防御，T淋巴細胞為魚類細胞免疫的主要效應細胞，分泌效應因子殺傷感染病毒的細胞，對抗原進行清除[35]．腦是NNV侵染的主要器官，在感染了NNV的石斑魚腦部可以檢測到CD8α與IgM的表達量升高，在受到NNV攻擊的石斑魚腦中還發(fā)現(xiàn)了小膠質(zhì)細胞與NK細胞的標志物，表明獲得性免疫在抗病毒過程中同樣發(fā)揮了重要作用[36]．

使用基因表達分析、差異表達分析等一系列轉(zhuǎn)錄組學分析可更全面地對病毒感染過程中的免疫反應、細胞凋亡等途徑進行分析．對感染了NNV的歐洲鱸魚腦細胞(DLB-1)進行了差異表達分析，結(jié)果顯示許多與IFN、熱休克蛋白以及細胞凋亡相關(guān)的基因表達上調(diào)，表明了以IFN為主的免疫反應途徑不足以消除NNV的感染，細胞最終凋亡并釋放出NNV病毒顆粒[37]．miRNA的高通量測序表明120條miRNA的表達存在差異，這些miRNA的靶基因主要對應免疫相關(guān)的信號通路，如自噬和TGF-β信號通路[38]．在感染了NNV的海鱸魚中觀察到了p53信號通路參與了NNV的感染并且被NNV所抑制，過表達Ljp53基因可以抑制NNV的復制并上調(diào)凋亡相關(guān)基因的表達，表明了p53信號通路可能促進細胞凋亡以抑制病毒復制[39]．在對于感染了NNV的石斑魚的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)通路的分析中發(fā)現(xiàn)25個相關(guān)基因表達存在上調(diào)，表明了NNV的感染可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應[40]．

3 NNV的檢測及引起疾病的預防與治療研究

3.1 NNV的檢測技術(shù)

NNV可以通過水體傳播，一旦魚種攜帶病毒，可能危害整個魚塘，因此對病毒的檢測尤為重要．由于實時熒光定量聚合酶鏈反應技術(shù)(RT-PCR)特異性強、靈敏度高的特點，且技術(shù)較為成熟，目前市面上銷售的NNV檢測試劑盒主要為RT-PCR檢測試劑盒，許多其他的檢測技術(shù)也開始應用于NNV的檢測中，包括逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增法(RT-LAMP)[41]、膠體金試紙條[42]、夾心酶聯(lián)免疫吸附劑測定技術(shù)(ELISA)[43]．

對病毒進行檢測的PCR技術(shù)有實時熒光定量PCR(RT-PCR)與逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增法(RT-LAMP)．根據(jù)NNV的RNA2進行RT-PCR引物的設(shè)計，最少可檢測2個拷貝的病毒載量[44]，針對RNA1所設(shè)計的RT-PCR程序可以檢測最低0.4 TCID50的病毒，且可利用魚鰭組織進行檢測，無需殺死石斑魚，可應用于平日的檢測與早期檢測中[45]．根據(jù)NNV的RNA1序列進行RT-LAMP檢測，可在1 h內(nèi)完成擴增反應，靈敏度較RT-PCR靈敏100倍，反應完成之后陽性樣本產(chǎn)生的白色焦磷酸鎂沉淀便于直接觀察判斷結(jié)果[46]．

側(cè)向流動檢測是一種簡單、快速的檢測方法，只需要少量病毒樣品，可在幾分鐘內(nèi)實現(xiàn)對病毒的檢測．針對于NNV的膠體金試紙條有著與RT-PCR相當?shù)臋z驗特異性與74%的診斷敏感性，檢測極限為10-3 TCID 50，可在養(yǎng)殖場環(huán)境中對NNV進行快速簡便的檢測[47]．

抗原固定化ELISA可對病毒進行定量檢測，但是由于檢測NNV的抗體與NNV之間的非特異性反應導致背景較高，使得這種方法重復性較低[48]．而使用夾心ELISA法對NNV進行檢測可以避免上述問題的發(fā)生，且固定過程中NNV的聚集狀態(tài)的改變使夾心ELISA相比于抗原固定化ELISA有更好的重復性與定量性[49]．表1為列舉的NNV檢測方法及相應特點．

表1 NNV檢測方法對比Tab.1 Comparison of NNV detection methods

3.2 神經(jīng)壞死病的預防與治療研究

魚類病毒的預防包括養(yǎng)殖環(huán)境的調(diào)節(jié)、挑選無病毒攜帶的親本進行育種以及疫苗接種等方法．養(yǎng)殖環(huán)境的調(diào)節(jié)主要為養(yǎng)殖水體的消殺，包括使用次氯酸鈣等化學消毒劑、臭氧消毒、對水體進行加熱以及使用紫外線照射水體等手段使NNV完全滅活[50]．NNV可通過魚卵由親代向子代傳播，在魚卵內(nèi)部可檢測到活病毒的存在，因此在育種時挑選無NNV攜帶的親魚[51]以及對魚卵使用病毒清洗液進行清洗[52]可較為有效地抑制NNV傳播．

使用疫苗為預防病毒感染的一種重要措施，但現(xiàn)階段國內(nèi)并未有商業(yè)化的疫苗可以售賣，在國外有ALPHA JECT micro? 1 Noda與ICTHIOVAC? VNN這2款注射型疫苗售賣，由于注射型疫苗需要單獨對每條魚進行接種，效率低下，因此更為省時省力的浸泡式疫苗的研發(fā)也在不斷推進，并且取得了較好的保護效果[53]．

滅活NNV疫苗和亞單位疫苗可使接種的魚產(chǎn)生高滴度的中和抗體，使用滅活的NNV病毒對多種魚苗進行免疫均顯示出了強大的保護能力[54-56]．此外，使用熱滅活方法對NNV進行滅活無法起到免疫保護效果，原因是在熱滅活過程中，NNV表面的突刺結(jié)構(gòu)消失，導致其免疫原性消失[57]．

亞單位疫苗是通過對病毒的結(jié)構(gòu)蛋白進行體外重組表達，使其組裝形成與野生型病毒高度相似的病毒樣顆粒(VLP)，為一種免疫原性好且安全性高的疫苗．報道的NNV-VLP已在大腸桿菌[58]、畢赤酵母[59]、本氏煙草[60]以及昆蟲細胞[61]中表達成功．使用NNV-VLP對魚苗進行免疫可以有效地保護魚苗不受NNV的侵害，且可在疫苗注射后的數(shù)月中持續(xù)保護魚苗，降低NNV感染的死亡率[59,62]．使用凍干技術(shù)對NNV-VLP進行儲存可以有效延長疫苗的保質(zhì)期，相比于水相保存，凍干疫苗無需冷鏈保存，可大幅度降低疫苗的保存成本[63]．

抗體與抗原存在較強的親合力與特異性，因此可用于防治多種病原性疾?。甀gY存在于多種卵生動物的卵黃中，使用含有抗NNV的IgY卵黃處理GF-1細胞表現(xiàn)出了良好的保護作用[64]．羊駝納米抗體(VHH)天然缺失輕鏈，只由重鏈構(gòu)成，體積只有IgG的十分之一，有著體積小、滲透性好以及穩(wěn)定性高的特點，使用抗NNV的VHH對NNV進行中和也展現(xiàn)了VHH的良好的保護能力[65-66]．

使用GF-1細胞對NNV的抑制藥物進行篩選，得到了多種有抗病毒效果的藥物，包括抗菌藥物、神經(jīng)遞質(zhì)劑與細胞色素P450抑制劑等．細胞色素P450抑制劑——鹽酸丙二芬可抑制NNV細胞病變效應(CPE)的形成與病毒RNA的復制[67]．金剛烷胺廣泛用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，有抗NNV感染的效果，且金剛烷胺可迅速的從魚體內(nèi)排出，無需擔心藥物殘留[68]．此外，以單壁碳納米管做為載體配合抗NNV藥物金剛烷胺和靶向配體NNV特異性納米抗體，構(gòu)建了納米體介導的NNV靶向給藥平臺，此平臺可以有效地穿過血腦屏障，有良好的NNV靶向能力，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒性疾病治療中展現(xiàn)出廣闊的前景[69]．適體是指通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(SELEX)篩選得到的短單鏈DNA或RNA，適體通過特殊的三維結(jié)構(gòu)與目標蛋白結(jié)合，形成適體-蛋白復合物，達到對疾病進行治療的目的[70]．對于抗NNV感染的DNA適體的表征顯示出了適體具有良好的抗病毒效果[71-73]．抗NNV的適體可以和病毒的CP蛋白相互結(jié)合進入感染的細胞中，將DNA適體-siRNA進行偶聯(lián)可遞送siRNA進入受感染的細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)阻止NNV的RNA復制，可有效地阻斷NNV的感染[73]．

抗菌肽為一種短肽鏈藥物，起到免疫調(diào)節(jié)與抗細菌感染的作用，可作為抗生素的替代藥品[74]．羅非魚鐵調(diào)素1-5(TH1-5)與環(huán)狀蝦抗脂多糖因子(cSALF)2種抗菌肽可吸附NNV，將病毒粒子凝集成團塊狀，從而阻止病毒進入細胞；石斑魚epinecidin-1則可誘導Mx蛋白表達從而起到抗病毒作用[75]；抗菌肽NK-lysin由NK細胞或CTLs細胞分泌，在細胞介導的細胞毒性(CMC)中起主要作用，NK-lysin抗菌肽可調(diào)節(jié)免疫標志物的轉(zhuǎn)錄與提高鱸魚對NNV感染的抗性，大幅提高NNV感染時鱸魚的存活率，顯示出了良好的抗病毒效果[76]．表2為列舉的NNV預防、治療方法及其優(yōu)缺點．

表2 NNV預防與治療方法對比Tab.2 Comparison of NNV prevention and treatment methods

4 總結(jié)與展望

NNV廣泛分布于世界各地的海洋之中，可感染以石斑魚為主的多種魚類，中國也不例外，NNV的高檢出率說明其可能對中國海水魚養(yǎng)殖行業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，所幸的是現(xiàn)在快速準確的檢測技術(shù)，可對攜帶NNV的魚類進行檢測．此外，對NNV的治療藥物的開發(fā)也在不斷進行，雖然還未有商業(yè)化產(chǎn)品，但大部分藥物都顯示出了有較好的治療效果，具有開發(fā)為有效的抗NNV商品化藥物的潛力．

在病毒致病機理研究方面，現(xiàn)階段已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一系列ISGs在NNV的入侵過程中發(fā)揮了抗病毒作用，誘導機體對病毒入侵做出反應，包括激活TNF信號通路、活化免疫細胞．關(guān)于NNV是否存在更多受體值得進一步探討，對NNV感染過程，深入對NNV與受體結(jié)合機制的研究有利于NNV靶向治療研究的發(fā)展．對于NNV的入侵以及致病機制研究的深入可加深對于這類病毒的理解，有利于未來針對NNV的疫苗以及藥物設(shè)計提供新的思路．