細菌纖維素膜純化條件的優(yōu)化及性能表征

王耀強，王 濤，李旖曦，張 虹，張 勇，李家兵，韓永和

(1.福建師范大學環(huán)境與資源學院、碳中和現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學院，福建 福州 350117；2.福建省污染控制與資源循環(huán)利用重點實驗室，福建 福州 350117)

纖維素(cellulose)是一種以葡萄糖為基本單元組成的生物高分子材料，其分子式和相對分子質(zhì)量分別為(C6H10O5)n和50 000～2 500 000[1]．作為木材、亞麻、大麻等植物的主要成分，纖維素與果膠、木質(zhì)素和半纖維素共同構成植物細胞壁[2]．植物源纖維素是制備紙張、紡織品、全纖維素復合物等產(chǎn)品的主要原料[3-5]．但植物纖維素的純化需經(jīng)酶或機械預處理以去除木質(zhì)素、半纖維素和其他雜質(zhì)，該過程成本較高且可能改變纖維性能，進而限制了其在某些領域的應用[6-9]．除植物外，多種微生物也具備產(chǎn)纖維素能力，此類纖維素被稱為細菌纖維素(bacterial cellulose，BC)[10]．Cladophora、Vallonia等微藻，Dictyostelium、Saprolegnia等真菌和Acetobacter、Achromobacter、Aerobacter、Agrobacterium、Asaia、Gluconobacter、Gluconacetobacter、Komagataeibacter、Rhizobium、Saccharibacter、Sarcina、Tanticharoenia等細菌均具備良好的產(chǎn)纖維素能力[10]．與植物纖維素相比，BC的純度和結晶度更高、持水能力更強、纖維尺寸更小(30～50 nm)且生物相容性更好[11-13]．因此，BC已被廣泛用于食品、水凝膠、高強度可再生紙、樂器膜、濾膜、醫(yī)用材料等產(chǎn)品的開發(fā)，具有廣闊的市場前景[14-19]．

BC是微生物以葡萄糖為底物通過β-1,4-糖苷鍵合成的生物高分子材料．因BC不含木質(zhì)素和半纖維素，其純化成本更低，也更受企業(yè)歡迎[20-23]．然而，BC是伴隨著微生物二分裂繁殖過程產(chǎn)生的納米纖維，因此BC網(wǎng)狀結構中分布著大量菌體[10，24]．盡管在食品開發(fā)過程中一般不對BC進行除菌處理[25-26]，菌體等雜質(zhì)的存在會影響B(tài)C在生物醫(yī)學、膜和電化學等領域的應用[14，27-29]．已報道的純化方法包括機械破碎處理、低溫破碎處理、超聲處理、強酸處理、堿處理和生物預處理等，這些方法對纖維素微觀形貌和理化性能產(chǎn)生的影響有較大差異[27-28]．堿處理作為BC純化的常用手段，其原理是將BC糖苷鏈中的范德華力和纖維束層中的氫鍵打開以降低機械強度[30]．例如，Rachtanapun等[31]研究了0.20～0.60 g·mL-1NaOH對以椰果為原料純化制備羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose，CMC)的影響，發(fā)現(xiàn)0.30 g·mL-1NaOH處理下CMC的產(chǎn)率較高，但產(chǎn)物的微觀形貌發(fā)生了較大變化．研究表明，當NaOH體積分數(shù)為6%～18%時，微波加熱處理8 min還可實現(xiàn)Ⅰ型纖維素向Ⅱ型纖維素的轉化[32]．采用0.1 mol·L-1NaOH水浴煮沸2 h是目前BC純化的常規(guī)參考條件[33]，但鮮有研究者系統(tǒng)地考察不同NaOH濃度和處理時間對BC微觀形貌、晶體結構等性質(zhì)的影響．通過優(yōu)化NaOH濃度和處理時間以獲得高純度BC樣品是提高其應用價值的重要前提．

本研究以不同NaOH濃度和處理時間為主要優(yōu)化條件，對BC進行純化，通過SEM、XRD、FTIR等表征手段探討純化條件對BC材料性能的影響．具體包括：設置不同NaOH濃度(0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mol·L-1)和處理時間(30、60、120、240 min)，分別采用SEM、XRD和FTIR分析BC的微觀形貌、晶體結構和表面官能團，探討純化BC的最適NaOH濃度和處理時間．結果有望為BC的純化制備提供參考，為醫(yī)藥、化學等領域提供可靠的BC基生物高分子材料．

1 材料與方法

1.1 實驗菌株和培養(yǎng)基

菌株Komagataeibactersp．W1分離自福建省泉州市某食醋有限公司的食醋發(fā)酵池，由本實驗室保存[33]．實驗HS培養(yǎng)基組分包括(g·L-1)：葡萄糖20、酵母膏5、蛋白胨5、十二水磷酸氫二鈉6.8、一水檸檬酸1.15和七水硫酸鎂0.51，并利用1.0 mol·L-1NaOH或HCl將培養(yǎng)基pH調(diào)至6.0[34]．培養(yǎng)基經(jīng)115 ℃滅菌30 min，備用．

1.2 細菌纖維素膜的制備與純化

取一環(huán)Komagataeibactersp．W1菌株單克隆，接種至滅菌的HS培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d．收集培養(yǎng)基表面的BC膜，備用．

用去離子水反復沖洗BC膜，瀝干．將BC膜分別浸泡于0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mol·L-1NaOH溶液中，100 ℃水浴煮沸2 h；隨后，將BC膜轉移至去離子水中繼續(xù)煮沸2 h以徹底除去膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基．根據(jù)NaOH濃度的優(yōu)化結果，選取最適NaOH濃度重復上述純化過程，控制水浴煮沸時間(30、60、120、240 min)，獲得最優(yōu)處理時間．

將純化后的BC膜轉移至清水中浸泡24 h，瀝干后通過美國Labconco FreeZone 6 plus冷凍干燥機對樣品進行冷凍干燥48 h直至恒質(zhì)量．

1.3 細菌纖維素膜的微觀形貌與理化性能表征

將少量冷凍干燥的BC樣品置于樣品臺的導電膠上，噴金處理后采用S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM,QuantaTM250 FEG，F(xiàn)EI，美國)觀察BC膜表面的微觀結構．SEM參數(shù)為：斑點3.0，電壓15 keV，放大倍數(shù)×10 000．為分析BC表面的聚集性顆粒物是否為NaOH晶體，同時對BC進行SEM-EDS(能譜)分析，通過面掃描模式計算各元素的相對原子含量(以百分比計)．

采用X’Pert Pro型粉末X射線衍射儀(XRD，Bruker D8 ADVANCE，德國)分析BC膜的晶體結構．首先，選擇BC膜中較平整的測試面，以帶有鎳過濾的銅Kα(λ= 0.154 06 nm)為輻射條件，設置電壓為40 keV、燈絲發(fā)射電流為30 mA、掃描步長為0.1°、掃描角度為11°～30°(2θ)．為消除背景干擾，以硅零背景板為對照采集干擾信號響應值，實際測量值與硅零背景板干擾信號的差值即為樣品的XRD吸收值．BC膜的晶面距離(d)和表觀晶粒度近似值分別根據(jù)Bragg方程(式1)和Scherrer公式(式2)進行計算[35].

(1)

(2)

其中，λ為X射線的波長，θ表示平面與衍射或入射光束之間的角度(即Bragg角)，半峰全寬b是最大吸收峰一半處的峰寬．半峰全寬數(shù)值由OriginPro 9.0軟件的峰值和基線模塊(the Peaks and Baseline module)中的綜合峰值分析(Integrated Peaks analysis)計算而得．通過公式(3)和(4)計算BC的結晶指數(shù)和結晶度[36].

(3)

(4)

其中，Ima表示2θ在22°～24°處晶格峰的最大衍射強度，Iam表示2θ在18°～19°處非晶相的最小衍射強度．

除SEM和XRD分析外，本文還采用FTIR(Thermo Scientific Nicolet iS5，美國)研究BC膜的表面官能團．采用衰減全反射模式，每次測量進行32次掃描，掃描范圍為400～4 000 cm，分辨率為0.5 cm-1．

2 結果與討論

2.1 不同NaOH處理濃度對BC形貌的影響

NaOH作為一種常用的BC純化試劑，在合適的濃度范圍內(nèi)可通過影響范德華力和氫鍵使BC膜呈松散結構，但過高的濃度會破壞納米纖維的微觀結構[30]．本研究設置NaOH濃度為0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mol·L-1，觀察不同NaOH濃度對BC膜的表觀和微觀形貌的影響．結果顯示，對照組BC膜呈黃色且不透明，其納米纖維表面可見大量附著物，說明膜內(nèi)存在較多菌體和雜質(zhì)(圖1a)．當NaOH處理濃度為0.1 mol·L-1時，BC膜的雜質(zhì)顯著減少，但仍可見典型的菌體附著(圖1b)．隨著NaOH濃度繼續(xù)提高至0.2和0.5 mol·L-1，BC膜呈現(xiàn)良好的透明度，SEM顯示BC纖維分布均勻且未見明顯的菌體或雜質(zhì)(圖1c、1d)．其中，0.5 mol·L-1NaOH處理時BC膜出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，且其微觀形貌呈現(xiàn)更高的致密性(圖1d)，說明該濃度下BC的結構已有明顯變化．NaOH濃度進一步提高至1.0 mol·L-1會加劇BC膜的皺縮現(xiàn)象，同時可見納米纖維表面附著菌體和大顆粒雜質(zhì)(圖1e)．當NaOH濃度達2.0 mol·L-1時，樣品已失去膜狀外觀，SEM分析亦未見典型的納米纖維結構(圖1f)．以上結果表明，0.1 mol·L-1NaOH仍難滿足BC膜的純化要求(圖1b)，表現(xiàn)出前期研究中常見的菌體殘留現(xiàn)象[33]．盡管高濃度NaOH(0.20～0.60 g·mL-1)處理有利于制備羧甲基纖維素，但所制備的產(chǎn)物的晶體結構已發(fā)生顯著改變[31，37-39].結合本研究結果，說明NaOH濃度過低或過高均不是獲得高純度BC膜的理想條件，而0.2 mol·L-1可作為BC膜純化的最優(yōu)參考濃度．

圖1 在不同NaOH濃度(左)處理下BC膜的外觀形貌(中)和微觀形貌(右，SEM：×10 000)Fig．1 The apparent morphology (middle) and micromorphology (right，SEM：×10 000 ) of BC membranes treated with different NaOH concentrations (left)

如圖1e、1f所示，在進行SEM分析時發(fā)現(xiàn)，NaOH濃度過高會導致BC纖維表面附著大量顆粒物．該顆粒物呈白色長條狀，在纖維表面成堆隨機分布(圖2a)．為探討其成分，在SEM基礎上選取區(qū)域Spectrum 9進行EDS分析．結果表明，該區(qū)域內(nèi)的元素組成主要為O(45.5%)、C(37.4%)和Na(17.1%)，散布的Au峰為噴金導致的信號值(圖2b)．由此可見，除影響B(tài)C膜的正常納米纖維結構外，過量的NaOH還會以晶體形式析出．在進行BC膜純化處理時，盡管菌體和雜質(zhì)的去除是主要目的[40-41]，但NaOH結晶析出也會影響材料的純度和性質(zhì)，該結果提示NaOH濃度需控制在一個合適范圍內(nèi)．

(a) SEM圖(×10 000)；(b) 基于圖a中區(qū)域Spectrum 9的EDS掃描結果圖2 基于SEM-EDS解析BC膜上元素的相對原子含量Fig.2 SEM-EDS-based analysis of the relative atomic content of elements on the BC membrane

2.2 不同處理時間對BC形貌的影響

水浴加熱是BC膜純化的關鍵步驟，處理時間的長短不僅會影響NaOH與樣品的充分接觸，同時可影響NaOH的濃度．為探究不同處理時間對BC形貌的影響，以0.2 mol·L-1NaOH為處理濃度，采用SEM分析了在30、60、120、240 min時BC膜的微觀形貌差異．如圖3a所示，處理30 min未能有效去除BC膜表面及網(wǎng)狀結構中的菌體和雜質(zhì)，納米纖維呈致密結構且纖維網(wǎng)絡不清晰．將處理時間提高至60 min時，BC膜纖維網(wǎng)絡均勻性大幅提升，但纖維表面及網(wǎng)絡中仍附著大量菌體和雜質(zhì)(圖3b)．當處理時間達120 min時，BC納米纖維尺寸均勻、纖維網(wǎng)絡清晰，說明該處理時間可有效去除菌體和雜質(zhì)(圖3c)．但處理時間過長(240 min)時BC纖維的均勻性較差，且可見明顯的雜質(zhì)堆積，可能與長時間水分蒸發(fā)導致的NaOH濃度增加有關(圖3d)．

圖3 基于SEM分析不同處理時間對BC膜微觀形貌的影響(×5 000)Fig.3 Effects of pretreatment time on the micro-morphology of BC membrane based on SEM analysis (×5 000)

BC含有大量氫鍵，確保恰當?shù)乃r間內(nèi)經(jīng)適當濃度的NaOH處理有助于打開分子間氫鍵[30，33]，進而使附著其上的菌體和雜質(zhì)脫落．Li等[23]指出，處理時長是破壞BC纖維鍵能進而打開纖維網(wǎng)絡的關鍵因素之一．但處理時間過長會導致NaOH濃度升高并破壞BC的晶體結構[42]．結果說明，僅當NaOH濃度為0.2 mol·L-1、處理時間為120 min時，BC膜的純化效果才比較理想(圖3c)．

2.3 基于XRD分析不同純化條件對BC晶體結構的影響

本研究結果顯示，不同NaOH濃度和處理時間會顯著影響B(tài)C的晶體衍射峰強度，且前者對纖維素的典型晶體峰影響比后者大(圖4)．在各處理組中，BC膜在2θ為14.5°、16.6°和22.7°均出現(xiàn)了典型衍射峰，表明存在纖維素晶體結構(圖4)．當NaOH濃度為0 mol·L-1時，BC膜的XRD衍射峰強度較弱，且在2θ為16.6°處未出現(xiàn)典型吸收峰(圖4a)．隨著NaOH濃度升高，BC膜的XRD衍射峰強度呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢；其中，NaOH濃度為0.1～0.2 mol·L-1時衍射峰較明顯(圖4a)，但NaOH濃度達1.0 mol·L-1之后衍射峰逐漸消失(圖4a)．因此，NaOH濃度過低或過高不僅不利于菌體和雜質(zhì)的去除(圖1)，而且對纖維素的晶體結構會產(chǎn)生顯著影響．

圖4 不同NaOH濃度(a)和處理時間(b)對BC晶體結構的影響Fig.4 Effects of different NaOH concentrations (a) and treatment time (b) on the crystal structure of BC

當處理時間為30 min時，BC膜的XRD衍射峰強度與低濃度NaOH處理結果類似(圖4b)，說明短時間處理未能將BC內(nèi)大分子間的氫鍵打開[47]．盡管60～240 min處理時間對BC膜的微觀形貌產(chǎn)生了較大影響(圖3b、3c、3d)，但BC膜均含有典型的纖維素晶體衍射峰(圖4b)．結合SEM結果可知，在0.2 mol·L-1NaOH和120 min處理條件下，BC膜呈現(xiàn)出較好的纖維結構和晶體特征．

為進一步探討不同NaOH濃度和處理時間對BC晶體特性的影響，系統(tǒng)分析了BC的d值、表觀晶粒度、結晶指數(shù)和結晶度．如表1所示，NaOH濃度為0～1.0 mol·L-1時，峰1(14.5°)對應的d值為0.606～0.610，與報道的結果一致[33，49]，說明各樣品的Iα含量相近[48]．但當NaOH達2.0 mol·L-1時，d值為0.731(表1)，表明BC晶體結構已被破壞．盡管不同濃度NaOH對峰3(22.7°)的d值影響不大(0.388～0.398；表1)，但峰2(16.6°)的d值在高濃度NaOH處理組中無法計算獲得(表1)，說明NaOH濃度主要影響B(tài)C在14.5°和16.6°處的晶體結構．與d值不同的是，表觀晶粒度在各處理組中差異較大且沒有明顯規(guī)律(表1)，可能與BC膜中微纖維的不規(guī)則特性和雜質(zhì)的干擾有關[49]．因此，NaOH濃度過低或過高均會破壞BC晶體結構的穩(wěn)定性，當NaOH濃度為0.1～0.5 mol·L-1時，BC結晶度較高(結晶指數(shù)為0.75～0.82，結晶度為80%～85%；表1)．

表1 不同NaOH濃度處理時BC膜的d、表觀晶粒度、結晶指數(shù)和結晶度Tab.1 d-spacing，apparent crystal size，crystallinity index and crystalline of BC membrane pretreated with different concentrations of NaOH

經(jīng)不同處理時間純化時，BC膜的3個XRD衍射峰所對應的d值與NaOH處理組相當，區(qū)別在于各峰的d值未受處理時間的顯著影響(表2)．然而，處理時間對表觀晶粒度的影響呈現(xiàn)出與NaOH濃度相似的趨勢．此外，不同處理時間純化時BC膜的結晶指數(shù)(0.73～0.84)和結晶度百分比(79%～86%)均較高(表2)．結合表1結果，說明BC晶體結構主要受起始NaOH濃度影響，但處理時間過長也能通過影響NaOH濃度而間接影響B(tài)C膜的晶體結構．基于BC膜微觀形貌和纖維的晶體特性，采用0.2 mol·L-1NaOH水浴煮沸120 min是比較理想的BC膜純化條件．

表2 處理時間對BC膜d值、表觀晶粒度、結晶指數(shù)和結晶度的影響Tab.2 Effects of the treatment time on d-spacing，apparent crystal size，crystallinity index and crystalline of BC membrane

2.4 基于FTIR解析不同純化條件下BC表面官能團的變化

圖5 不同濃度NaOH(a)和處理時間(b)下的BC表面官能團差異分析Fig.5 Differential analysis of the surface functional groups of BC treated with different concentrations of NaOH (a) and treatment time (b)

3 結論

本研究設置不同濃度NaOH溶液和處理時間，通過SEM、XRD、FTIR等考察純化條件對BC膜外觀形貌、微觀結構和表面官能團的影響．結果表明，NaOH溶液濃度太低或處理時間不足不能有效去除BC膜中的菌體和雜質(zhì)，該條件下制備的BC膜在2θ為14.5°、16.6°和22.7°處的吸收峰不顯著且結晶度低于85%，而NaOH濃度太高或處理時間太長會破壞BC晶體結構．當NaOH濃度和處理時間分別為0.2 mol·L-1和120 min時，所制備的BC材料純度較高、纖維結構規(guī)整、晶體特征明顯．但NaOH濃度和處理時間對BC膜的表面官能團影響較?。狙芯績?yōu)化了BC膜的純化條件，結果可為獲得純度更高、性能更好的BC材料提供理論依據(jù)．