QuEChERS/UPLC-MS/MS法測定雷公藤及根際土壤中3種農(nóng)藥殘留

李鳳鳳，張毅鵬，龔達林，劉三波，黃麒元，3，梅之南，王學(xué)奎，舒少華

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070； 2.華潤三九（黃石）藥業(yè)有限公司，黃石 435000；3.國藥集團中聯(lián)藥業(yè)有限公司，武漢 430070

雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.f.）是衛(wèi)矛科（Cleastraceae）雷公藤屬植物，是我國傳統(tǒng)的中藥材之一，其主要活性成分為萜類和生物堿類化合物，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、抗菌、止痛等多種作用［1］。在雷公藤栽培過程中，白絹病、炭疽病、麗長角巢蛾等多種病蟲害對其造成嚴重危害。目前，生產(chǎn)上多采用辛硫磷、氯氰菊酯、乙基多殺菌素等農(nóng)藥來防治麗長角巢蛾等害蟲。其中，辛硫磷作為廣譜、高效、低毒、易分解的殺蟲劑，已經(jīng)成為樂果、甲胺磷等高毒農(nóng)藥的替代產(chǎn)品［2］；氯氰菊酯是一種廣譜性擬除蟲菊酯類殺蟲劑，對害蟲具有觸殺和胃毒作用［3］；乙基多殺菌素因低毒、低殘留、作用位點獨特、殺蟲譜廣，已經(jīng)應(yīng)用到了多種作物上［4］。雷公藤活性成分復(fù)雜，施用化學(xué)農(nóng)藥后農(nóng)藥殘留會直接影響其藥效，且長期攝入殘留農(nóng)藥會對人體造成神經(jīng)毒性、致癌、致畸等危害［5-6］。因此，農(nóng)藥殘留量檢測是雷公藤中藥材質(zhì)量控制的一項重要指標。

目前，常見的檢測中藥材中農(nóng)藥殘留的方法主要包括色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、毛細管電泳法、免疫分析法和生物傳感器技術(shù)等，其中色譜和質(zhì)譜法在實際應(yīng)用中比較廣泛。中藥材基質(zhì)復(fù)雜，且待測農(nóng)藥大多數(shù)在高溫下不穩(wěn)定，所以液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)成為了測定農(nóng)藥殘留的主導(dǎo)技術(shù)［7-8］。

QuEChERS法是在固相萃取基礎(chǔ)上開發(fā)的一種新型樣品前處理技術(shù)［9］，最初針對一定含水量（>75%）的蔬果等樣本中的農(nóng)藥進行提取，具有快速、便捷、廉價、高效、耐用和安全等特點，得到快速廣泛應(yīng)用。Lehotay等［10］利用QuEChERS法結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測了蔬菜和水果中229種農(nóng)藥殘留。為保證提取效率，學(xué)者根據(jù)樣本特點和待提取物性質(zhì)進行了多種改進和優(yōu)化［11］。針對干燥或含水量較低的樣品，向樣品中添加適量的水，可提高樣品的浸潤性，弱化待測組分與樣品基質(zhì)之間的相互作用，使待測組分更容易在提取過程中被充分萃?。?2-13］。

目前，針對我國雷公藤種植生產(chǎn)過程中常用的3種農(nóng)藥殘留檢測方法報道較少，且目前我國沒有雷公藤藥材中的農(nóng)藥殘留標準。本研究通過快速樣品前處理結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（QuECh?ERS/UPLC-MS/MS）法測定雷公藤及根際土壤中辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多殺菌素3種農(nóng)藥殘留含量，并與相關(guān)國際標準進行對比，旨在為3種農(nóng)藥在雷公藤及根際土壤中的殘留檢測提供方法指導(dǎo)， 并為我國盡快制訂雷公藤中藥材中的農(nóng)藥殘留標準提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙酸銨（色譜純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（色譜純），中國武漢弗頓控股有限公司；乙腈和甲醇（質(zhì)譜純），美國Fisher公司；無水硫酸鎂（MgSO4，分析純），中國上海麥克林生化科技有限公司；氯化鈉（NaCl，分析純），德國BioFro公司；N-丙基乙二胺（PSA， 40～63 μm），美國Agela Technol?ogies公司；乙基多殺菌素原藥（100 mg，純度為88.28%），德國Dr. Ehrensorfer公司；氯氰菊酯標準溶液（1 000 mg/L，丙酮中）和辛硫磷標準溶液（100 mg/L，丙酮中），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

雷公藤根樣、土壤樣品于2021年11月13日采集于湖北省陽新縣平原村雷公藤種植基地 （115°E， 29°N）。隨機取30株雷公藤作為檢測植株樣品，其中根樣取自于所選定的雷公藤植株地下10～20 cm處，土樣選擇對應(yīng)部位的根際土壤（黃棕壤，有機質(zhì)17.88 g/kg，全氮0.46 g/kg，全磷0.86 g/kg，全鉀6.29 g/kg，堿解氮84.35 mg/kg，速效磷25.92 mg/kg，pH 4.94）。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（TSQ Altis?），美國Thermo Fisher Scientific公司；色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm），美國Waters公司；FW80高速粉碎機、101-AB電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；BX3200H超聲波清洗儀，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；AR223CN分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；B-20R型冷凍離心機，德國NACHT公司；MX-S型旋渦混合器，美國Scilogex公司。

1.3 樣品前處理

將雷公藤根樣洗凈，擦凈表面水分后于65 ℃烘箱中烘干6 h，粉碎，過孔徑230 μm篩，試驗前于65 ℃烘箱中烘干4 h，備用。土壤樣品自然風(fēng)干，除去碎石、雜草和植物根莖等雜物，過孔徑280 μm篩，備用。準確稱取雷公藤根樣和土壤樣品各2 g（精確至0.01 g），分別置于50 mL 離心管中，各加入去離子水4 mL，充分浸潤后，加入乙腈4 mL，渦旋混勻1 min，超聲30 min后依次加入氯化鈉0.4 g和無水硫酸鎂1.6 g，再次渦旋2 min后4 000 r/min離心5 min。精密量取上清液2 mL于15 mL離心管中，分別加入N-丙基乙二胺0.1 g和無水硫酸鎂0.3 g，旋渦1 min，于4 ℃、5 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm有機膜，待測。

1.4 標準溶液的配制

乙基多殺菌素標準儲備溶液：準確稱取乙基多殺菌素標準品10 mg（精確至 0.1 mg）至10 mL容量瓶中，加入乙腈溶解，定容至刻度，搖勻，配制成1 000 mg/L的標準儲備溶液，在4 ℃冰箱中保存，待用。空白基質(zhì)溶液：分別準確稱取未施藥的雷公藤根樣和土壤樣品各2 g（精確至0.01 g），按照本文“1.3”方法進行樣品前處理，得到根樣空白基質(zhì)溶液和土壤空白基質(zhì)溶液?？瞻谆|(zhì)標準工作溶液：用空白基質(zhì)溶液分別稀釋3種農(nóng)藥標準品溶液，配制一系列濃度的空白基質(zhì)標準工作溶液，用于做基質(zhì)匹配校準工作曲線。

1.5 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測條件

色譜條件：色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；進樣量1 μL；流速0.4 mL/min；流動相 A：乙腈；流動相B：5 mmol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫程序：0 min，5% A，95% B；10 min，99% A，1% B；13 min，99% A，1% B；13.1 min，5% A，95% B；15 min，5% A，95% B。

質(zhì)譜條件：Thermo Fisher超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（TSQ Altis?）檢測，電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；正離子掃描模式；選擇反應(yīng)監(jiān)測模式（selective reaction monitoring，SRM）；毛細管電壓3.5 kV；離子傳輸線溫度325 ℃；霧化溫度350 ℃；輔助氣和鞘氣均為N2，輔助氣流速10 mL/min；鞘氣流速40 mL/min。優(yōu)化后的各目標化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多殺菌素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of phoxim，cypermethrin and spinetoram

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜與質(zhì)譜檢測條件的優(yōu)化

考察了2種超高效液相色譜柱Waters ACQUI?TY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和Waters ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm）在乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-5 mmol/L的乙酸銨溶液2種流動相和梯度洗脫條件下分離目標物的情況。3種農(nóng)藥在不同的色譜柱和流動相條件下的保留時間、峰形和分離情況見表2。結(jié)果表明，采用乙腈-5 mmol/L的乙酸銨溶液為流動相，在本文“1.5”的梯度洗脫條件下，使用HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm ）色譜柱，15 min內(nèi)3種農(nóng)藥均可得到較高的靈敏度、峰形和重現(xiàn)性。其中乙基多殺菌素的2種本體乙基多殺菌素-J和乙基多殺菌素-L能達到較好分離，符合系統(tǒng)適用性的要求。

表2 4種色譜條件下化合物的保留時間、峰形和分離度情況Table 2 Retention time， peak shape and resolution of compounds under four different chromatographic conditions

2.2 線性范圍、檢出限與定量限分析

按照本文“1.4”方法配制一系列空白基質(zhì)標準工作溶液，以濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），線性回歸分析，擬合得各農(nóng)藥的基質(zhì)匹配線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)。如表3所示，在根樣空白基質(zhì)和土壤空白基質(zhì)中，辛硫磷（0.5～100.0 ng/mL）、氯氰菊酯（5～2 000 ng/mL）、乙基多殺菌素-J（0.01～1 000.00 ng/mL）、乙基多殺菌素-L（0.1～1 000 ng/mL）的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。為最大程度消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，保證檢測的準確性，在實際樣品檢測中采用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量分析。

以信噪比（S/N）為10和3時對應(yīng)的空白基質(zhì)標準溶液的濃度為定量限（LOQ）和檢出限（LOD），3種農(nóng)藥的定量限和檢出限結(jié)果如表3所示，均遠低于相關(guān)國際標準中3種農(nóng)藥在藥用植物中的最大殘留限量（MRL）（表4）。結(jié)果證明本研究建立的QuEChERS/UPLC-MS/MS方法靈敏度高，可滿足實際定量檢測需求。

表3 3種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear equations， correlation coefficients， LODs and LOQs of three pesticides

表4 國內(nèi)外標準體系中3種農(nóng)藥的最大殘留限量Table 4 The maximum residue limits of three pestcides in domestic and foreign standard systems mg/kg

2.3 方法的回收率與精密度分析

3種農(nóng)藥在雷公藤根和土壤樣中的回收率試驗結(jié)果見表5。參考3種農(nóng)藥在國內(nèi)外標準體系中的最大殘留限量，每種農(nóng)藥設(shè)定 3個添加水平，分別加入到不含農(nóng)藥殘留的雷公藤根樣和土壤樣品（未施藥）中，每個水平平行6次，計算得出平均加樣回收率在85.22%～113.08%，相對標準偏差（RSD）為2.56%～5.67%，均符合農(nóng)藥殘留檢測的技術(shù)標準。

表5 3種農(nóng)藥在雷公藤根和土壤樣中的平均回收率和相對標準偏差（n=6）Table 5 Average recoveries and RSDs of three pesticides in roots and soil samples （n=6）

2.4 雷公藤樣品和土壤樣品中3種農(nóng)藥殘留檢測

對采集于華潤三九（黃石）藥業(yè)有限公司雷公藤GAP種植示范基地（湖北省陽新縣平原村）的雷公藤根部樣品和土壤樣品各30份進行檢測，結(jié)果見表6。由表6可見，土壤樣品中辛硫磷、乙基多殺菌素、氯氰菊酯的殘留量均未檢出；根部樣品中辛硫磷的殘留量為0.010～0.037 mg/kg，乙基多殺菌素-J的殘留量為

表6 雷公藤根樣和土壤樣品中3種農(nóng)藥殘留量檢出范圍Table 6 Detected range of three pesticides residues in real samples mg/kg

3 討論

本研究檢測的3種農(nóng)藥是雷公藤種植過程中最常用的農(nóng)藥，其中辛硫磷屬于有機磷類農(nóng)藥，見光易分解、殘留期短、殘留危害小，適合施入土中，防止地下害蟲。乙基多殺菌素（XDE-175-J， XDE-175-L）是多殺菌素類的殺蟲劑，具有生物農(nóng)藥的安全性和化學(xué)農(nóng)藥的速效性，主要降解方式是光解和微生物降解，最終分解為碳、氮、氧等［14］。氯氰菊酯是廣譜性的菊酯類殺蟲劑，廣泛應(yīng)用于中藥材的生產(chǎn)、運輸和儲存過程，其殘留超標會對人體造成神經(jīng)毒性和生殖內(nèi)分泌毒性，這類農(nóng)藥超標較為嚴重的中藥材是菊花、金銀花和枸杞等［7］，但目前氯氰菊酯在雷公藤種植過程中的殘留情況很少見相關(guān)報道。

QuEChERS前處理方法，操作簡便，耗時短，溶劑少；UPLC-MS/MS檢測方法線性關(guān)系良好，檢出限和定量限均較低，具有較高的靈敏度和準確度，且串聯(lián)質(zhì)譜的選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）模式能較好地避免干擾，二者聯(lián)合可滿足定性和定量檢測要求。QuEChERS/UPLC-MS/MS法的不足之處是需要使用較為貴重的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，儀器操作相對復(fù)雜。

采用QuEChERS/UPLC-MS/MS法測定雷公藤及根際土壤中3種農(nóng)藥殘留，在實際樣品的檢測結(jié)果中，土壤樣品中3種農(nóng)藥殘留均未檢出，說明在雷公藤的種植過程中科學(xué)規(guī)范使用辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多殺菌素3種農(nóng)藥不會對雷公藤根際土壤造成殘留污染。雷公藤根部樣品中辛硫磷和乙基多殺菌素的殘留量較低，均低于GB 2763-2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中對藥用植物枸杞（干）規(guī)定的最大殘留限量（2 mg/kg），同時也低于《美國藥典-國家處方集》（USP40-NF35）、《歐盟藥典》（EP 9.2）和《日本藥典》（JP 17）中規(guī)定的2種農(nóng)藥的最大殘留限量（0.01 mg/kg）。張治科等［15］采用液相色譜法測定辛硫磷在甘草中的殘留量，最低檢出限為5.0 μg/kg。本研究建立的UPLC-MS/MS檢測技術(shù)最低檢出限為12.5 ng/kg，靈敏度更高。實際檢測結(jié)果表明雷公藤根部樣品中辛硫磷的殘留量均較低，說明在雷公藤的種植過程中科學(xué)規(guī)范使用辛硫磷不會對中藥材造成殘留污染。GB 2763-2021中對藥用植物只規(guī)定了枸杞（干）中氯氰菊酯的最大殘留限量（2 mg/kg），《中國藥典》未對藥用植物中氯氰菊酯的殘留限量做出規(guī)定，一些國外的標準體系中制定了藥用植物中氯氰菊酯的最大殘留限量標準，其中《美國藥典-國家處方集》（USP40-NF35）、《歐盟藥典》（EP 9.2）和《日本藥典》（JP 17）中規(guī)定的最大殘留限量為1.0 mg/kg，《韓國藥典》（KP10）中規(guī)定的最大殘留限量為0.5 mg/kg。楊紅兵等［16］采用氣相色譜法測定了枸杞中氯氰菊酯的殘留量，檢出限是4.360 μg/kg，而本研究建立的方法檢出限是0.714 μg/kg，靈敏度更高。實際樣品檢測結(jié)果中，氯氰菊酯在土壤樣品中未檢出，但在雷公藤根部樣品中殘留量在2.940～6.540 mg/kg，表明雷公藤可能對氯氰菊酯具有富集作用。

本研究建立的檢測方法和實際樣品檢測結(jié)果，為制定3種農(nóng)藥在雷公藤及根際土壤中的殘留限量標準提供了分析方法，對雷公藤種植過程中常用農(nóng)藥的風(fēng)險監(jiān)控具有一定的指導(dǎo)作用。但本研究只測定了乙基多殺菌素2種本體乙基多殺菌素-J和乙基多殺菌素-L的殘留量，為更加嚴格控制殘留，后續(xù)研究應(yīng)增加2種代謝物N-脫甲基-乙基多殺菌素-J（Ndemethyl-XDE-175-J）和N-甲?；?乙基多殺菌素-J（N-formyl-XDE-175-J）的殘留量檢測［17］。同時應(yīng)繼續(xù)深入研究氯氰菊酯在雷公藤中的殘留動態(tài)和富集情況，確定其在雷公藤上的使用劑量、施用方式、安全間隔期和安全采收期等，為科學(xué)評價該農(nóng)藥在雷公藤上應(yīng)用的殘留風(fēng)險提供依據(jù)，同時應(yīng)參考國外相關(guān)標準，結(jié)合中國雷公藤種植實際情況，盡快制定出更完善的農(nóng)藥殘留限量標準。