水澇脅迫對草石蠶生理特性的影響及抗?jié)承栽u價

班甜甜，張素勤，馬超，吳傳遞，徐彥軍，李曉慧，耿廣東

1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，貴陽 550006； 2.貴州省園藝工程技術(shù)研究中心，貴陽550006；3.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025

水分是影響植物生長的重要環(huán)境因子之一，水分過多可降低土壤中O2溶解度，形成缺氧或無氧的根系環(huán)境而危害植物［1］。近年來全球氣候變暖導(dǎo)致異常天氣增多，其中洪澇對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成極大威脅［2］。洪澇是中國發(fā)生幾率最高、影響范圍最廣以及造成損害最大的自然災(zāi)害，西南地區(qū)受臺風(fēng)影響，夏季經(jīng)常發(fā)生暴雨洪澇災(zāi)害，嚴(yán)重影響植物的正常生長，甚至引起植株的死亡，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成不利影響。水澇條件下，植物活性氧（reactive oxygen spe?cie，ROS）代謝失衡，造成過氧化氫（H2O2）、超氧根陰離子（O2?）等大量積累，過多的 ROS導(dǎo)致細(xì)胞氧化和膜系統(tǒng)受損［3］，產(chǎn)生膜質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA），與酶發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，造成膜系統(tǒng)變性，影響植株正常生理代謝，最終導(dǎo)致產(chǎn)量降低。研究表明，玉米苗期淹水3～7 d可使產(chǎn)量降低58.80%～69.80%［4］；綠豆始粒期淹水可使產(chǎn)量降低18.07%～28.87%［5］；大豆V3 期淹水可使單株產(chǎn)量降低11.11%［6］。高水平的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性在植物抵御淹水脅迫中發(fā)揮重要作用［7］，可以有效維持 ROS平衡，同時通過滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢，保證植株的生長［8-9］。

草石蠶（Stachys sieboldiiMiq.）是唇形科水蘇屬多年生草本作物，也是一種以地下莖為食用部分的特色蔬菜，富含水蘇糖、脂肪、蛋白質(zhì)、維生素等，營養(yǎng)價值豐富，有補(bǔ)血、強(qiáng)身、清熱解毒、治咳嗽等功效［10］。草石蠶喜濕潤的環(huán)境，但在西南地區(qū)由于雨水過多，長期水澇導(dǎo)致土壤板結(jié)，限制地下莖的生長，嚴(yán)重影響草石蠶的產(chǎn)量，加強(qiáng)草石蠶抗?jié)称贩N篩選和澇害生理特性研究，對于深入了解草石蠶抗?jié)硻C(jī)制及有針對性地提出抗?jié)臣夹g(shù)措施具有重要的理論價值和實(shí)踐意義。目前，對玉米［11］、黃瓜［12］、辣椒［13］等作物水澇脅迫研究較多，而關(guān)于草石蠶的相關(guān)研究還鮮見報道。因此，本研究以3個草石蠶品種為試材，研究水澇脅迫對其葉綠素含量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、保護(hù)酶活性以及膜脂過氧化產(chǎn)物的影響，以期解析草石蠶的抗?jié)硻C(jī)制，建立抗?jié)承栽u價方法，為選育抗?jié)承云贩N提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為“貴栽1號”（貴州務(wù)川主栽品種）、“魯引1號”（山東濱州主栽品種）和“贛引1號”（江西萍鄉(xiāng)主栽品種）。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院教學(xué)實(shí)驗(yàn)基地大棚內(nèi)進(jìn)行，每個小區(qū)2畦，畦面寬100 cm，每畦種植2行，株距40 cm。常規(guī)管理，待6-7月份（旺盛生長期，且為雨季時期）時進(jìn)行水澇處理（在做畦前先將土挖出鋪上塑料膜后再填上，進(jìn)行水澇處理時向小區(qū)人工放水，使水淹過土壤表面，保證土壤中的水分一直處于飽和狀態(tài)），脅迫1、3、5、7 d后，分別測定各品種的相關(guān)生理指標(biāo)，以正常澆水管理的草石蠶為對照，每個小區(qū)面積為10 m2，3次重復(fù)，隨機(jī)排列。于08：00-09：00采樣，所采樣品為從上到下第3和第4片葉。

1.3 測定方法

樣品葉采用95%乙醇-丙酮混合液浸泡、提取，測定葉綠素含量［14］；采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量，考馬斯亮藍(lán) G-250 染色法測定可溶性蛋白含量，茚三酮比色法測定脯氨酸（proline，Pro）含量，硫代巴比妥酸法測定MDA含量［15］。參照文獻(xiàn)［15］測定SOD、POD和CAT活性。

1.4 主成分分析

對3個品種草石蠶的葉綠素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、Pro含量、SOD活性、POD活性、CAT活性、MDA含量等數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用SPSS 22.0進(jìn)行主成分分析，依據(jù)其特征值和貢獻(xiàn)率等，計算草石蠶的抗?jié)承缘梅帧?/p>

1.5 數(shù)據(jù)處理

用 Excel 2003整理數(shù)據(jù)并繪制圖表，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性、相關(guān)性及主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水澇脅迫對草石蠶葉綠素含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示，水澇脅迫處理后3種草石蠶葉綠素含量先升高后降低?！百F栽1號”葉綠素含量在水澇脅迫3 d后達(dá)到最大值，較對照升高了9.59%，兩者之間具有極顯著差異（P<0.01）?！棒斠?號”和“贛引1號”水澇脅迫5 d后達(dá)到最大值，分別較對照升高了8.90%、13.96%，而“貴栽1號”葉綠素含量處理3 d后則有所下降。水澇脅迫7 d后，3種草石蠶的葉綠素含量均有所降低。

圖1 水澇脅迫下草石蠶葉綠素含量的變化Fig.1 The change of chlorophyll content of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress

2.2 水澇脅迫對草石蠶可溶性糖含量的影響

從圖2可見，3種草石蠶可溶性糖含量均呈先升高后降低的變化。水澇脅迫1 d，3種草石蠶可溶性糖含量均高于對照，且達(dá)到極顯著差異水平（P<0.01）。水澇脅迫3 d，“貴栽1號”可溶性糖含量達(dá)到最大值，較對照升高了33.05%；“魯引1號”和“贛引1號” 在脅迫5 d后可溶性糖含量達(dá)到最大值，分別高于對照25.98%和28.54%，與脅迫3 d的可溶性糖含量差異極顯著。水澇脅迫7 d后，3種草石蠶可溶性糖含量均比脅迫5 d時有所降低，但仍高于對照，且與對照間差異極顯著。脅迫7 d后，“贛引1號”升高幅度最大，“魯引1號”次之，“貴栽1號”最低。

圖2 水澇脅迫下草石蠶可溶性糖含量的變化Fig.2 The change of soluble sugar content of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress

2.3 水澇脅迫對草石蠶可溶性蛋白含量的影響

從圖3可以看出，3種草石蠶可溶性蛋白含量隨水澇脅迫時間延長均呈先升高后降低的變化趨勢。水澇脅迫3 d后，3種草石蠶可溶性蛋白含量均有所增加，“貴栽1號”可溶性蛋白含量達(dá)到最大值，高于對照23.46%，兩者之間差異極顯著（P<0.01）?！棒斠?號”和“贛引1號”可溶性蛋白含量在脅迫5 d后達(dá)到最大值，分別高于對照22.65%和27.89%。水澇脅迫7 d后，3種草石蠶可溶性蛋白含量下降，但仍高于對照。在脅迫處理末期，“贛引1號”可溶性蛋白含量較對照的升高幅度最大。

圖3 水澇脅迫下草石蠶可溶性蛋白含量的變化Fig.3 The change of soluble protein content of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress

2.4 水澇脅迫對草石蠶Pro含量的影響

由圖4可見，水澇脅迫處理后“魯引1號”和“贛引1號”Pro含量先升高后降低，而“貴栽1號”則一直升高。水澇處理1 d后，3種草石蠶Pro含量均高于對照，且與對照之間的差異極顯著（P<0.01），“貴栽1號”“魯引1號”和“贛引1號” Pro含量分別比對照增加30.73%、51.59%和89.06%。水澇脅迫5 d后，“魯引1號”和“贛引1號”Pro含量均達(dá)到最大值，分別與對照和脅迫3 d后的Pro含量均達(dá)到極顯著差異水平。水澇脅迫7 d后，“貴栽1號”的Pro含量達(dá)最大值，比對照升高97.93%，而“魯引1號”與“贛引1號”Pro含量有所降低，但仍高于對照。水澇脅迫7 d后，“贛引1號” Pro含量升高幅度最大。

圖4 水澇脅迫下草石蠶脯氨酸含量的變化Fig.4 The change of proline content of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress

2.5 水澇脅迫對草石蠶SOD活性的影響

試驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，隨水澇脅迫時間延長，“貴栽1號”和“魯引1號”的SOD活性先升高后降低，“贛引1號”則一直升高。水澇脅迫3 d后“貴栽1號”SOD活性達(dá)到最大值，高于對照48.49%，并達(dá)到極顯著差異水平（P<0.01）。水澇脅迫5 d后，“魯引1號”SOD活性升高到最大值，較對照升高32.47%。水 澇 脅 迫7 d后，“贛 引1號”SOD活性 升 高到 最大值，比對照升高34.71%，“魯引1號”和“貴栽1號”則低于水澇脅迫5 d的活性，但仍高于對照。水澇脅迫末 期，“贛引1號”SOD活性升高 幅 度 最 大，“魯引1號”次之，“貴栽1號”最低。

圖5 水澇脅迫下草石蠶SOD活性的變化Fig.5 The change of SOD activity of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress

2.6 水澇脅迫對草石蠶POD活性的影響

由圖6可見，3種草石蠶的POD活性隨水澇脅迫時間延長先升高后降低。水澇脅迫1 d后，3種草石蠶的POD活性均高于對照，且與對照間差異極顯著（P<0.01）。 3種草石蠶的POD活性在脅迫5 d后達(dá)到最大值，“貴栽1號”“魯引1號”和“贛引1號”分別比對照升高了66.37%、102.95%和104.46%。水澇脅迫7 d后，3種草石蠶的POD活性有所降低，但仍高于對照。脅迫末期，“贛引1號”的升高幅度最大，“貴栽1號”升高幅度最小。

圖6 水澇脅迫下草石蠶POD活性的變化Fig.6 The change of POD activity of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress

2.7 水澇脅迫對草石蠶CAT活性的影響

由圖7可見，3種草石蠶CAT活性隨水澇脅迫時間延長先升高后降低。水澇脅迫1 d，3種草石蠶CAT活性均高于對照，且差異極顯著（P<0.01）（圖7）。3種草石蠶的CAT活性在脅迫5 d后達(dá)到最大值，“貴栽1號”“魯引1號”和“贛引1號”分別比對照升高了280.65%、260.29%和266.67%。水澇脅迫7 d后，3種草石蠶CAT活性有所降低，但仍高于對照。脅迫處理末期，“贛引1號”和“魯引1號”升高幅度大，“貴栽1號”CAT活性升高幅度小。

圖7 水澇脅迫下草石蠶CAT活性的變化Fig.7 The change of CAT activity of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress

2.8 水澇脅迫對草石蠶MDA含量的影響

3種草石蠶MDA含量隨水澇脅迫時間的延長一直增加。水澇脅迫1 d后，3種草石蠶MDA含量與對照之間差異極顯著（P<0.01）。水澇脅迫7 d后，3種草石蠶 MDA含量均達(dá)到最大值，且分別高于對照256.86%、282.93%和301.20%；脅迫末期，“贛引1號” MDA含量升高幅度最小，“貴栽1號”MDA含量升高幅度最大（圖8）。

圖8 水澇脅迫下草石蠶MDA含量的變化Fig.8 The changeof MDA content of Stachys sieboldii Miq. under waterlogging stress on

2.9 草石蠶各生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

水澇脅迫處理后草石蠶各生理指標(biāo)間的相關(guān)性分析結(jié)果（表1）顯示，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、Pro含量、SOD活性、POD活性之間的相關(guān)系數(shù)均>0，絕對值均>0.8，因此，各指標(biāo)之間均呈極顯著正相關(guān)。MDA含量與其他生理指標(biāo)之間均呈負(fù)相關(guān)；葉綠素含量與可溶性糖含量、可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)，與SOD活性、CAT活性呈極顯著正相關(guān)；CAT活性與Pro含量、MDA含量、POD活性呈一定程度負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性均不顯著。綜上，各項生理指標(biāo)間存在一定的相關(guān)性，但相關(guān)程度不一致。因此，可用主成分降維的方法對草石蠶的8個生理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，綜合評價草石蠶的抗?jié)承浴?/p>

表1 草石蠶各生理指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of Stachys sieboldii Miq. physiological indexes

2.1 0 3種草石蠶的抗?jié)承栽u價

1）主成分分析。對水澇脅迫后草石蠶各生理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，得到初始特征值、方差貢獻(xiàn)率、累計方差貢獻(xiàn)率和旋轉(zhuǎn)平方和后的特征值、方差貢獻(xiàn)率、累計方差貢獻(xiàn)率（表2）。選取初始特征值大于1的前2個主成分，第1主成分的方差貢獻(xiàn)率為 78.510%，第2主成分的方差貢獻(xiàn)率為15.490%，累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)94%，可代表8個原始性狀94%的數(shù)據(jù)信息?？捎眠@2個主成分代替上述8個生理指標(biāo)進(jìn)行抗?jié)承跃C合評價。

由表3可知，第1主成分得分系數(shù)為正且較大的指標(biāo)有可溶性糖、可溶性蛋白、Pro、SOD和POD，表明這5項指標(biāo)對第1主成分的貢獻(xiàn)較大；第2主成分得分系數(shù)為正且較大的指標(biāo)有葉綠素、SOD和CAT，這3項指標(biāo)對第2主成分的貢獻(xiàn)較大。

2）抗?jié)承跃C合評價。通過對 2個主成分的得分系數(shù)（表3）和8個生理指標(biāo)（X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8分別代表葉綠素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、Pro含量、MDA活性、SOD活性、POD活性、CAT活性）進(jìn)行處理，建立2個主成分的線性回歸方程如下：

表3 主成分得分系數(shù)Table 3 The matrix of principal component scoring coefficient

然后以每個主成分所對應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率作為權(quán)重系數(shù)，計算草石蠶的綜合得分。從表2可見，2個主成分旋轉(zhuǎn)后的方差貢獻(xiàn)率分別為70.482%和23.518%，故3種草石蠶的綜合得分公式為：FZ=70.482%×F1+23.518%×F2。各主成分得分和綜合得分見表4，“魯引1號”“贛引1號”和“貴栽1號”綜合評價的抗?jié)承缘梅址謩e為-0.174、0.815、-0.641，評價得分最高的為“贛引1號”，其抗?jié)承宰詈谩?/p>

表2 各成分特征值和貢獻(xiàn)率Table 2 The characteristic value and contribution rate of each component

表4 草石蠶主成分得分及綜合評價Table 4 Principal component score and comprehensive evaluation value of S. sieboldii Miq.

3 討論

水分作為植物生長的重要環(huán)境因子，可影響植物的形態(tài)、生理生化以及地理分布。水澇脅迫嚴(yán)重影響植物生長發(fā)育，脅迫時間越長傷害越大［16］。

3.1 水澇脅迫對草石蠶葉綠素及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

葉片是植物最敏感的器官，逆境脅迫下葉片往往最先表現(xiàn)出癥狀［17］。本試驗(yàn)3種草石蠶的葉綠素含量均隨脅迫時間的延長先升高后降低，這與宴增等［18］對黑楊幼苗的研究結(jié)論一致。脅迫初期葉綠素含量升高，這可能是草石蠶喜水性的嗜水生理反應(yīng)，促進(jìn)了葉綠素的合成，以維持生存所需的光合能力［19］。隨水澇時間的延長，3種草石蠶的葉綠素含量均下降，表明水澇脅迫末期抑制了葉綠素合成，加快了葉綠素的降解［20］，進(jìn)而影響草石蠶的生長。植物體內(nèi)的可溶性糖、可溶性蛋白和Pro等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)具有保護(hù)酶活性和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的功能［21］。本試驗(yàn)3種草石蠶的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)均隨脅迫時間的延長先升高后降低，與張志浩等［22］對花椒的研究結(jié)果一致。Pro含量的增加既可提高細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，還可以清除活性氧，增強(qiáng)植株抗氧化能力［23］，這對提高植物的逆境抗性是有益的。水澇脅迫3 d后“魯引1號”和“贛引1號”的可溶性糖、可溶性蛋白、Pro含量繼續(xù)升高，表明這2種草石蠶在水澇脅迫下具有較好的滲透調(diào)節(jié)能力，“貴栽1號”的可溶性糖、可溶性蛋白在脅迫3 d后，達(dá)到最大值，然后下降，因此，“貴栽1號”的滲透調(diào)節(jié)能力較差?？扇苄蕴呛蚉ro含量初期上升是因?yàn)橹仓曜陨淼淖晕冶Ｗo(hù)機(jī)制，但這種自我調(diào)節(jié)作用有一定的限度，當(dāng)外界的脅迫程度超過自身的調(diào)節(jié)能力時就會對植株造成傷害，其含量開始下降［24］；可溶性蛋白含量前期升高是由于水澇脅迫刺激了蛋白合成，后期含量降低是因?yàn)榻到獯笥诤铣桑?5］。

3.2 水澇脅迫對草石蠶過氧化及抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

葉片 MDA 含量為逆境脅迫下植物受害程度的重要指標(biāo)，淹水脅迫會造成膜脂過氧化反應(yīng)加劇，導(dǎo)致膜系統(tǒng)受損，從而影響膜透性，間接反映植物組織抗氧化的能力［26］。本試驗(yàn)中，3種草石蠶MDA含量均隨水澇脅迫的延長而上升，這與王桂林等［27］的研究結(jié)果一致，“貴栽1號”和“贛引1號”含量的變化規(guī)律與汪宗立等［28］的研究結(jié)果一致，均為前期緩慢上升，后期快速上升。這表明隨脅迫時間的延長，葉片細(xì)胞質(zhì)膜透性增大，導(dǎo)致細(xì)胞各項功能紊亂，危害植物的生長，這與葉綠素含量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量在脅迫末期下降的反應(yīng)一致?！百F栽1號”和“贛引1號”MDA含量后期快速上升，是因?yàn)殡S脅迫時間的延長細(xì)胞內(nèi)的活性氧大量積累，膜脂過氧化作用加劇，草石蠶對水澇脅迫的適應(yīng)性逐漸下降。脅迫末期“贛引1號”MDA含量較對照的升高幅度最小，表明其膜脂過氧化程度最低。

植物在遭受逆境脅迫時，可通過改變體內(nèi)SOD、POD、CAT 等酶的活性清除大量的自由基，抵御外界的傷害［29］。試驗(yàn)表明，“魯引1號”和“貴栽1號”的SOD活性和3種草石蠶的POD和CAT活性均呈先升高后降低的變化，這與裴姿琛等［30］、張曉佩等［31］的研究結(jié)果一致，抗氧化酶活性隨脅迫時間的延長而降低，可能源于持續(xù)的澇害導(dǎo)致植株的抗?jié)硻C(jī)能已無法發(fā)揮作用，與文中MDA的含量一直升高的結(jié)果相對應(yīng)。一般來說，耐澇能力強(qiáng)的植物，抗氧化酶的活性會顯著升高［32］，根據(jù)綜合評價結(jié)果可知“贛引1號”的抗?jié)承宰顝?qiáng)，水澇脅迫1～7 d其SOD活性一直在升高，脅迫末期較對照的升高幅度最大。

3.3 草石蠶抗?jié)承跃C合評價

植物的抗?jié)承允怯啥喾N因素互作而構(gòu)成的一個比較復(fù)雜的綜合性狀，用單一指標(biāo)評價具有局限性，需將多個指標(biāo)進(jìn)行綜合分析才能科學(xué)反映植物的抗?jié)承裕?3-34］。本研究通過對草石蠶的8個生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，各指標(biāo)間存在復(fù)雜的相關(guān)性，給草石蠶抗?jié)承缘蔫b定帶來一定的困難。本研究通過主成分分析將8個指標(biāo)降維為2個主成分，根據(jù)3種草石蠶的得分，明確3種草石蠶的抗?jié)承詾椤摆M引1號”>“魯引1號”>“貴栽1號”。