紅樹(shù)林沉積物反硝化和厭氧氨氧化速率的時(shí)空變化及環(huán)境響應(yīng)

林雨彬，秦永強(qiáng)，馬思遠(yuǎn)，曾若菡，陳雨梅，刁曉平2,

（1.海南大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，海口 570228;2.海南大學(xué) 南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228;3.海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，?？?571158）

由于沿海養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展、施肥量增加和土地利用的變化，地表水污染程度穩(wěn)步上升[1]，導(dǎo)致徑流污染嚴(yán)重。濕地作為天然的環(huán)境屏障，能夠降低陸地向海洋的徑流污染排放。紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)是全球濕地的重要組成部分[2]，由于其高效的營(yíng)養(yǎng)循環(huán)系統(tǒng)而具有極高的生產(chǎn)力[3]，能夠凈化和過(guò)濾由內(nèi)陸向海洋的徑流中的有機(jī)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)鹽[4]。1960年以來(lái)，不合理的開(kāi)發(fā)活動(dòng)使得紅樹(shù)林面積銳減[5]。由于其獨(dú)特的地理環(huán)境和系統(tǒng)特點(diǎn)[6]，近年來(lái)紅樹(shù)林的研究日益增加，在紅樹(shù)林的清退修復(fù)工作及可持續(xù)發(fā)展方面，先后實(shí)施了藍(lán)碳戰(zhàn)略和“藍(lán)色港灣”、“南紅北柳”等生態(tài)工程[7]。

氮素循環(huán)是整個(gè)生物地球循環(huán)的重要組成部分，對(duì)維持整個(gè)生物圈的生態(tài)平衡意義重大。氮循環(huán)過(guò)程主要有硝化過(guò)程、固氮過(guò)程、反硝化過(guò)程、硝酸鹽銨化過(guò)程、厭氧氨氧化過(guò)程和氨化過(guò)程等重要步驟。其中反硝化和厭氧氨氧化過(guò)程被廣泛認(rèn)為是環(huán)境中活性氮去除的最主要途徑[8]，其中反硝化是全球氮循環(huán)的關(guān)鍵步驟，其貢獻(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出其他過(guò)程。反硝化是在低氧條件下的反硝化菌將硝酸鹽或者亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氮?dú)饣蛘哐趸倪^(guò)程，可以降低活性氮，維護(hù)氮循環(huán)平衡[9]。厭氧氨氧化則指在厭氧條件下,以亞硝酸鹽作為電子受體,將氨氮氧化成氮?dú)獾倪^(guò)程。不同種類(lèi)的生態(tài)環(huán)境中，厭氧氨氧化在氮循環(huán)中的貢獻(xiàn)比例有較大差異，但仍舊不可忽視[10]。反硝化和厭氧氨氧化作用能將固定態(tài)的氮素轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮?dú)w還大氣圈，被廣泛認(rèn)為是海洋生態(tài)系統(tǒng)中活性氮去除的兩個(gè)主要途徑，在維持各個(gè)圈層的氮素平衡中極其重要[11]，而微生物是物質(zhì)循環(huán)的主要驅(qū)動(dòng)者。隨著越來(lái)越多針對(duì)紅樹(shù)林物質(zhì)循環(huán)的研究，人們對(duì)紅樹(shù)林在全球生物化學(xué)循環(huán)中的作用越來(lái)越重視。氮素作為生物的必須元素，往往是濕地沉積物中的主要限制性養(yǎng)分，因此研究不同生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)具有十分重要的意義。已有部分研究發(fā)現(xiàn)，反硝化和厭氧氨氧化受到溫度、溶解氧（DO）、硝氮、pH、有機(jī)碳、總鐵等許多因素的影響，存在明顯的時(shí)空異質(zhì)性[12-13]。為了研究紅樹(shù)林退塘還林過(guò)程對(duì)沉積物氮循環(huán)速率的影響，實(shí)驗(yàn)選取海南省文昌市丹場(chǎng)村紅樹(shù)林清退工作區(qū)域，探究紅樹(shù)林修復(fù)過(guò)程的不同生境對(duì)沉積物理化因子、反硝化及厭氧氨氧化速率的影響，旨在為紅樹(shù)林的生態(tài)修復(fù)和清退工作的效果及階段評(píng)估提供科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況文昌市紅樹(shù)林地處海南省東北部，地理坐標(biāo)為110°30′～110°02′E，19°15′～20°09′N(xiāo)。屬于熱帶海洋性季風(fēng)氣候，全年日照時(shí)間長(zhǎng)，年均氣溫約24.1℃，年均降雨量約1750 mm，雨季為5—10月，旱季11至翌年4月[14]。文昌市自2017年開(kāi)始啟動(dòng)保護(hù)紅樹(shù)林工程，計(jì)劃3內(nèi)退塘還林還濕760 hm2。本研究在2021年3月（旱季）及8月（雨季）于文昌市丹場(chǎng) 村（19.62°N，110.81°E）的原生紅樹(shù)林濕地（原生區(qū)）、紅樹(shù)林修復(fù)區(qū)（修復(fù)區(qū)）及退養(yǎng)魚(yú)塘區(qū)域（魚(yú)塘區(qū)）3個(gè)區(qū)域選取樣點(diǎn)進(jìn)行采集，原生紅樹(shù)林濕地未進(jìn)行開(kāi)墾養(yǎng)殖，優(yōu)勢(shì)樹(shù)種為對(duì)葉欖李（Laguncularia racemosa），修復(fù)區(qū)為進(jìn)行了人工種植的幼年紅樹(shù)區(qū)域，魚(yú)塘區(qū)為已經(jīng)退養(yǎng)的原養(yǎng)殖魚(yú)塘（已經(jīng)推翻圍墻與外界紅樹(shù)林水體相連接）。

1.2 樣品采集采樣使用內(nèi)徑8 cm、長(zhǎng)50 cm的透明亞克力管垂直采集10～25 cm深度的紅樹(shù)林沉積物，在每個(gè)樣點(diǎn)進(jìn)行3次隨機(jī)采樣，帶回實(shí)驗(yàn)室后將平行樣在厭氧培養(yǎng)箱中使用聚乙烯無(wú)菌密封袋進(jìn)行混勻，混勻后將樣品存放于4℃冰箱，等待進(jìn)行速率測(cè)定和相關(guān)理化性質(zhì)測(cè)定[15]。

1.3 環(huán)境因子測(cè)定沉積物的溫度、鹽度、pH等在現(xiàn)場(chǎng)用土壤YSI（COMBI5000）采集數(shù)據(jù)。沉積物可溶性硝酸鹽氮（NO3--N）、氨氮（NH4+-N）的測(cè)定參照《中華人民共和國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)》（HJ634-2012）進(jìn)行。沉積物TOC使用重鉻酸鉀外加熱法進(jìn)行測(cè)定[16]。實(shí)驗(yàn)吸光度使用Perkin-Elmer Lambda-25分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。所有環(huán)境參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定。

1.4 反硝化與厭氧氨氧化速率測(cè)定沉積物反硝化及厭氧氨氧化速率采用同位素示蹤法結(jié)合泥漿培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定[15]，將沉積物與同鹽度人工海水按照1∶7的質(zhì)量比例混勻制成均質(zhì)泥漿，通入氦氣充分曝氣20 min以上，使用無(wú)菌注射器將泥漿注入到Labco頂空進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)，放入與原位溫度相同的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)24 h。選取其中1個(gè)小瓶測(cè)定硝酸根離子濃度，用以計(jì)算Fn(Fn=100×15NO3-/14+15NO3-)，其余所有小瓶加入0.1 mL濃度為12.5 mmol·L-1的15NO3-，加入后充分搖勻，起始樣加入200μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的ZnCl2，終止樣繼續(xù)培養(yǎng)8 h之后加入ZnCl2。反硝化與厭氧氨氧化速率通過(guò)培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)生的溶解性氣體29N2和30N2來(lái)確定。溶解性氣體29N2和30N2采用薄膜進(jìn)樣質(zhì)譜儀（Membrane Inlet Mass Spectrometry，MIMS）測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析使用IBM SPSS Statistics 25軟件對(duì)環(huán)境因子與速率的相關(guān)性數(shù)據(jù)進(jìn)行Person和Spearman分析，并使用Origin 2018以及Adobe Illustrator 2021進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的柱狀圖繪制，使用word插件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析以確定顯著性關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境因子時(shí)空分布特征采樣區(qū)域不同生境沉積物理化因子隨著季節(jié)和生境的變化而發(fā)生改變，并存在時(shí)空分布差異（圖1）。除TOC外，其余理化因子均受到季節(jié)的顯著影響；所有理化因子都受到采樣生境的顯著影響。

圖1 不同季節(jié)各生境沉積物的理化指標(biāo)

沉積物溫度范圍為旱季29.03～29.93℃，均值29.46℃、雨季為33.80～39.84℃，均值36.57℃，不同生境沉積物溫度存在極顯著季節(jié)差異（P＜0.01），雨季采樣點(diǎn)之間也存在極顯著差異（P＜0.01）。

旱季沉積物pH范圍為6.17～7.17，均值6.55；雨季pH為6.36～7.01，均值6.64，其中修復(fù)區(qū)pH存在極顯著的季節(jié)差異（P＜0.01），魚(yú)塘區(qū)存在顯著的季節(jié)差異（P＜0.05）。沉積物pH呈現(xiàn)原生區(qū)極顯著高于魚(yú)塘區(qū)（P＜0.01）和魚(yú)塘區(qū)顯著高于修復(fù)區(qū)的趨勢(shì)（P＜0.05）。

旱季沉積物鹽度范圍為4338～7902 mg·L-1，均值6151 mg·L-1；雨季為4509～9691 mg·L-1，均值7214 mg·L-1?？傮w呈原生區(qū)高于修復(fù)區(qū)和修復(fù)區(qū)高于魚(yú)塘區(qū)的趨勢(shì)，并且除旱季原生區(qū)和修復(fù)區(qū)差異顯著外，其余差異均極顯著。沉積物鹽度在原生區(qū)表現(xiàn)出極顯著的季節(jié)差異（P＜0.01），修復(fù)區(qū)表現(xiàn)出顯著的季節(jié)差異（P＜0.05）。

旱季沉積物氨氮（NH4+-N）范圍為15.92～17.59 mg·kg-1，均 值17.11 mg·kg-1，雨 季12.78～30.93 mg·kg-1，均值為20.51 mg·kg-1。旱季修復(fù)區(qū)氨氮顯著地低于雨季（P＜0.05），且雨季修復(fù)區(qū)顯著極顯著地高于其余2個(gè)區(qū)域（P＜0.01）。

旱季沉積物硝氮（NO3--N）范圍為0.72～7.86 mg·kg-1，均 值4.09 mg·kg-1，雨 季2.27～12.11 mg·kg-1，均值8.33 mg·kg-1。整體兩個(gè)季節(jié)沉積物硝氮具有顯著的季節(jié)差異（P＜0.05），原生區(qū)和修復(fù)區(qū)季節(jié)差異不顯著，魚(yú)塘區(qū)季節(jié)差異極顯著（P＜0.01）。且生境之間均具有極顯著的差異（P＜0.01）。

相同生境的沉積物TOC沒(méi)有季節(jié)性差異，不同生境的沉積物TOC存在明顯的季節(jié)性差異（P＜0.05），原生區(qū)沉積物TOC均顯著高于修復(fù)區(qū)和魚(yú)塘區(qū)（P＜0.05）。

2.2 反硝化速率與厭氧氨氧化速率的時(shí)空分布不同生境紅樹(shù)林沉積物的反硝化和厭氧氨氧化速率見(jiàn)圖2。由圖2可知，沉積物速率指標(biāo)之間存在較大時(shí)空差異。旱季反硝化速率區(qū)間為8.08～14.39 nmol·g-1·h-1，其中修復(fù)區(qū)的反硝化速率最高（14.39 nmol·g-1·h-1），顯著高于原生區(qū)（P＜0.05）；雨季反硝化速率則介于9.62～11.67 nmol·g-1·h-1之間，無(wú)顯著生境差異。同生境下反硝化速率沒(méi)有顯著季節(jié)差異。

圖2 不同季節(jié)各生境沉積物反硝化（A）及厭氧氨氧化速率(B)

旱季厭氧氨氧化速率區(qū)間為0.10～0.52 nmol·g-1·h-1，修復(fù)區(qū)的反硝化速率最高（0.52 nmol·g-1·h-1），顯著高于原生區(qū)（P＜0.05）。雨季厭氧氨氧化速率介于0.48-0.60 nmol·g-1·h-1之間，不同生境之間沒(méi)有顯著差異。原生區(qū)厭氧氨氧化速率存在極顯著的季節(jié)差異，雨季明顯高于旱季（P＜0.01）。

2.3 不同生境環(huán)境因子對(duì)反硝化及厭氧氨氧化速率的影響沉積物反硝化及厭氧氨氧化速率受到多項(xiàng)因子的綜合影響，本研究結(jié)果（表1）表明，反硝化和厭氧氨氧化速率呈現(xiàn)高度正相關(guān)（雨季修復(fù)區(qū)除外）；氨氮和硝氮對(duì)3種不同生境沉積物的反硝化和厭氧氨氧化速率均有顯著影響。選取部分與脫氮速率相關(guān)度較高的理化因子與反硝化和厭氧氨氧化速率進(jìn)行RDA分析，結(jié)果如圖3所示，RDA1軸解釋度為78.13%，RDA2軸解釋度為10.10%。結(jié)果表明，溫度和沉積物硝氮含量對(duì)反硝化和厭氧氨氧化速率產(chǎn)生了重要影響，沉積物氨氮含量的影響則較小。

圖3 部分理化因子和反硝化及厭氧氨氧化速率的RDA分析

表1 基于Spearman分析的N循環(huán)速率與沉積物理化因子的關(guān)系

3 討 論

研究區(qū)域沉積物pH低于海水的pH，整體沉積物偏酸性是紅樹(shù)林的特色，也可能與附近養(yǎng)殖魚(yú)塘廢水排放污染有關(guān)，3個(gè)區(qū)域中原生區(qū)受影響最小，故pH最高。而魚(yú)塘區(qū)由于質(zhì)地呈砂紙，淤泥含量少，有機(jī)質(zhì)含量也較少（如TOC），產(chǎn)生的還原性氣體較修復(fù)區(qū)少，故酸性較弱。區(qū)域鹽度差異是由于海陸距離差異導(dǎo)致，內(nèi)陸徑流多為淡水，在紅樹(shù)林入海過(guò)程存在鹽度漸變過(guò)程。紅樹(shù)林沉積物出現(xiàn)溫度、pH、鹽度等理化因子的季節(jié)性差異與Li等[17]的研究相同。旱季修復(fù)區(qū)較高的氨氮可能是因?yàn)樯锘顒?dòng)較旱季更活躍而導(dǎo)致，氨是魚(yú)類(lèi)和加殼類(lèi)生物主要的代謝產(chǎn)物之一，導(dǎo)致沉積物氨氮含量升高[18]。其中，雨季魚(yú)塘區(qū)硝氮的異常高含量可能是由于采樣區(qū)域現(xiàn)有養(yǎng)殖魚(yú)塘進(jìn)行排水換水導(dǎo)致。

有研究表明，細(xì)顆粒沉積物對(duì)有機(jī)質(zhì)的富集能力更強(qiáng)[19]，筆者在采樣時(shí)發(fā)現(xiàn)，魚(yú)塘區(qū)域的沉積物大部分為粗糙顆粒，這可能是導(dǎo)致該區(qū)域TOC含量最低的原因。土壤反硝化過(guò)程主要是由放線菌門(mén)( Actinobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)等微生物群調(diào)控，而厭氧氨氧化微生物主要?dú)w為浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)[19]，種類(lèi)繁多的微生物參與調(diào)控脫氮并且發(fā)揮重要作用[20]，而溫度、水分、pH、溶氧、資源可用性、植被類(lèi)型等均會(huì)對(duì)微生物種群多樣性和豐度產(chǎn)生不同的效應(yīng)[21]，因此脫氮是許多不同的微生物與環(huán)境共同協(xié)作的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)修復(fù)區(qū)是反硝化和厭氧氨氧化速率最高的生境，可能是由于原生區(qū)過(guò)高的鹽度抑制了該生境氮循環(huán)相關(guān)微生物，如厭氧氨氧化菌的活動(dòng)導(dǎo)致該生境反硝化和厭氧氨氧化速率最低[17,22]，王勇等[23]發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化的最適環(huán)境溫度為（35±1）℃，而本研究厭氧氨氧化在原生區(qū)的極顯著季節(jié)差異也可能是因?yàn)橛昙镜某练e物溫度極顯著地高于旱季，因?yàn)橛昙境练e物溫度更加接近最適值。且該處沉積物硝氮雨季高于旱季，反硝化潛力大[24]，有更高的反硝化速率[25]，提供了更多的厭氧氨氧化反應(yīng)底物。溫度和硝氮同時(shí)作用大幅提高了該生境的厭氧氨氧化速率。也可能是此處微生物群落結(jié)構(gòu)受其余未測(cè)定環(huán)境因素和人類(lèi)活動(dòng)的影響所致[26]，故不同生境氮循環(huán)速率的差異性不能局限于單一理化因子的影響。

兩項(xiàng)速率出現(xiàn)的耦合效應(yīng)與大多數(shù)研究相似，該關(guān)系的出現(xiàn)可能歸結(jié)于反硝化在厭氧條件下提供了厭氧氨氧化的底物NO2-。有研究發(fā)現(xiàn)隨溫度升高，反硝化速率提高[27]，本研究在旱季的修復(fù)區(qū)和魚(yú)塘區(qū)，反硝化速率和溫度呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)該區(qū)域的厭氧氨氧化速率同樣受到溫度的密切影響，與大多數(shù)結(jié)果相似。但可能由于采樣生境整體溫度較高，整體未能成為限制N循環(huán)速率的關(guān)鍵因素。反硝化作用的最佳pH為7～8，研究表明，高于或低于這個(gè)范圍反硝化速率將會(huì)下降[28]。本實(shí)驗(yàn)除原生區(qū)外其余生境的pH均低于該范圍，因此在旱季原生區(qū)和雨季魚(yú)塘區(qū)反硝化速率出現(xiàn)了明顯的下降。雨季原生區(qū)沉積物的鹽度最高，該生境反硝化速率下降與鹽度有關(guān)。有研究表明，鹽度升高會(huì)導(dǎo)致反硝化速率的降低[20]，本研究結(jié)果可能是該處鹽度極顯著高于其他點(diǎn)而抑制微生物活動(dòng)所致（P＜0.01）。

硝氮和氨氮會(huì)顯著地對(duì)反硝化速率造成影響[29-30]。一般來(lái)說(shuō)，沉積物反硝化速率與離子交換態(tài)（IEF）硝氮和氨氮會(huì)存在較為明顯的正相關(guān)性[31]，而分析結(jié)果表明僅有雨季魚(yú)塘區(qū)存在該正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紅樹(shù)林沉積物中硝氮賦存形態(tài)較為特殊，在雨季原生區(qū)和修復(fù)區(qū)可能有較多碳酸結(jié)合態(tài)（CF）及氧化物態(tài)的（IMOF）硝氮和氨氮，導(dǎo)致所測(cè)沉積物硝氮和氨氮含量與速率并未呈現(xiàn)大多數(shù)研究的正相關(guān)關(guān)系，也可能是采樣地點(diǎn)水質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素較豐富，硝態(tài)氮未成為反硝化與厭氧氨氧化速率的限制因素，反而超過(guò)正相關(guān)閾值導(dǎo)致。張波等[32]研究發(fā)現(xiàn)太湖反硝化速率與硝氮存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，認(rèn)為反硝化速率越大，厭氧程度越高而導(dǎo)致硝氮含量較低，沉積物的高反硝化速率會(huì)降低環(huán)境硝氮負(fù)荷。吳耀國(guó)[33]研究結(jié)果表明，適當(dāng)增加有機(jī)物可以提高反硝化速率，而本研究中雨季修復(fù)區(qū)較高的反硝化速率與沉積物TOC含量較高有一定相關(guān)性。

4 結(jié) 論

不同生境紅樹(shù)林區(qū)域理化因子存在復(fù)雜的時(shí)空變化特征，其中修復(fù)區(qū)各項(xiàng)理化因子相較于另外2個(gè)生境更低且季節(jié)性差異最為明顯，原生區(qū)理化因子受季節(jié)影響較小且除沉積物氨氮以外的理化因子數(shù)值均為原生區(qū)最高。沉積物反硝化速率具有空間差異，厭氧氨氧化速率具有時(shí)空差異。反硝化及厭氧氨氧化速率受到不同采樣生境、理化因子等的重要影響，反硝化和厭氧氨氧化速率均在修復(fù)區(qū)最高，原生區(qū)最低，總體季節(jié)差異不顯著，反硝化和厭氧氨氧化速率之間有十分明顯的耦合特性。所測(cè)理化因子中溫度、pH、鹽度、電導(dǎo)率、氨氮、硝氮、TOC均與紅樹(shù)林脫氮過(guò)程存在較為復(fù)雜的關(guān)系，其中溫度和硝氮與反硝化和厭氧氨氧化過(guò)程關(guān)系較緊密，是該實(shí)驗(yàn)中紅樹(shù)林脫氮過(guò)程的關(guān)鍵影響因素。