海南3種相思樹紅根病病原菌的鑒定

朱清亮，李增平，丁婧鈺，張 宇，程樂(lè)樂(lè)

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228）

相思樹（Acaciaspp.）是豆科相思子屬的一種常綠喬木，常見(jiàn)的有臺(tái)灣相思（A. confuseMerr.）、馬占相思（A. mangiumWilld.）、耳葉相思（A. auriculiformisA.Cunn.ex Benth.）等。相思樹具根瘤固氮，速生豐產(chǎn)，改土性能好的特點(diǎn)[1]。相思樹的木材纖維含量高，是造紙的優(yōu)良材料，也可制成枕木以及各類家具與農(nóng)具，還可以用作飼料與薪炭材，馬占相思樹皮可以制作品質(zhì)優(yōu)良的栲膠[2-4]。此外，相思樹還是優(yōu)良的速生行道樹與綠化植物，也是我國(guó)南方沿海防風(fēng)林主要的造林樹種之一，其在我國(guó)的工業(yè)發(fā)展與生態(tài)建設(shè)上發(fā)揮著重要的作用[2]。海南地處中國(guó)的熱帶地區(qū)，在多種生態(tài)環(huán)境下，特別是在熱帶雨林中，生長(zhǎng)著各種大型真菌，在眾多的大型真菌類群中，以靈芝科（Ganodermataceae）最為常見(jiàn)，其物種數(shù)目多達(dá)72種，占中國(guó)已知靈芝科真菌總數(shù)的70%左右，其中的15種在海南被作為藥用真菌[5]。近年來(lái)，筆者在田間調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在海南不同市縣種植的臺(tái)灣相思、馬占相思和耳葉相思均有受靈芝菌侵染后引發(fā)的根腐病，導(dǎo)致相思樹整株枯死，并在林間形成中心病區(qū)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)靈芝（Ganoderma）侵染引起的相思樹紅根病有一定的報(bào)道。1988年，弓明欽[6]在對(duì)海南進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，多種樹木包括如青皮象耳豆（Enterolobium contortisiliquum）、紅皮 象 耳 豆（E. contortisiliqum）、臺(tái) 灣 相 思（A.confuse）、鳳凰木（Delonix regia）、鐵刀木（Cassia siamea）等受到熱帶靈芝（Ganoderma tropicum）與擬熱帶靈芝（G. ahmadii）侵染引起根腐病且發(fā)病較重，但未對(duì)2種病原進(jìn)行致病性測(cè)定與進(jìn)一步的鑒定。1993年，MAHMUD等[7]報(bào)道了馬來(lái)西亞與巴布亞新幾內(nèi)亞的馬占相思上發(fā)生根腐病。1996年，Mehrotra等[8]鑒定了印度馬占相思根腐病的病原菌為靈芝（G. lucidum）。1998—2001年，岑炳沾等[9]對(duì)廣東相思樹主要栽培區(qū)進(jìn)行調(diào)查，根據(jù)子實(shí)體形態(tài)將廣東馬占相思與耳葉相思根腐病病原菌鑒定為靈芝（G. lucidum(Leyss.ex Fr.) Karst.），并鑒定臺(tái)灣相思根腐病病原菌為假芝菌（Amauroderma omphalodes(Berk.)Torr.）。劉運(yùn)華等[10]對(duì)廣西的相思樹進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)馬占相思心腐均是從間伐的傷口開(kāi)始，再擴(kuò)展到心材并向上下蔓延。2002年，戴玉成等[11]在海南考察時(shí)發(fā)現(xiàn)了臺(tái)灣相思樹干基腐朽病，并通過(guò)形態(tài)觀察將病原鑒定為熱帶靈芝（G. tropicum）與粗柄假芝（A. elmerianum）。秦凡文[12]在對(duì)海南省橡膠園靈芝屬真菌進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)熱帶靈芝（G. tropicum）是危害相思樹并造成死亡的重要病原物。但已有的相關(guān)報(bào)道主要以傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法為主，由于靈芝在不同生境下的形態(tài)可塑性較強(qiáng)，其鑒定結(jié)果往往容易受到環(huán)境與研究者主觀因素的干擾。同時(shí)，目前尚未見(jiàn)有熱帶靈芝（G.tropicum）引起相思樹種紅根病的系統(tǒng)性報(bào)道。為進(jìn)一步明確引起海南相思樹根腐病的病原靈芝菌種類，本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)手段對(duì)海南相思樹靈芝菌根腐病病原菌進(jìn)行了系統(tǒng)性鑒定，以期為生產(chǎn)上防治海南相思樹靈芝菌根腐病提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試樣本臺(tái)灣相思根腐病樣本采自海南省?？谑薪鹋X公園（20°0′40′′N，110°19′8′′E）、馬占相思根腐病樣本采自儋州西慶農(nóng)場(chǎng)（19°32′11′′N，109°26′50′′E）、耳葉相思根腐病樣本采自昌江紅林農(nóng)場(chǎng)（19°17′37′′N，108°57′55′′E）等地。從發(fā)病相思上采集靈芝菌擔(dān)子果，對(duì)病株進(jìn)行拍照、定位并記錄。擔(dān)子果用塑料保鮮袋裝好帶回并設(shè)計(jì)編號(hào)，拍照，測(cè)量大小。

1.2 供試苗木選擇種植于海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院教學(xué)實(shí)踐基地內(nèi)2～3 a生的臺(tái)灣相思、馬占相思、耳葉相思等作為供試苗木。

1.3 培養(yǎng)基PDA與木屑培養(yǎng)基分別參照文獻(xiàn)[13-14]提供的配制方法。

1.4 引物與試劑PCR引物由生工生物技術(shù)有限公司合成，序列見(jiàn)表1。OMEGA Fungal DNA Kit，DNA Marker DL2000，2×TaqMasterMix(Dye)。

表1 用于擴(kuò)增病原菌ITS、SSU與LSU基因的引物序列

1.5 菌株分離采用擔(dān)子果組織分離法分離菌株。具體方法參考方中達(dá)《植病研究方法》[13]，純化出菌株后備用，從臺(tái)灣相思、馬占相思與耳葉相思上采集到的靈芝屬擔(dān)子果上分離的菌株中各選擇1株分別命名為TWXSGF001、MZXSGF001和EYXSGF001。

1.6 致病性測(cè)定接種方法參照文獻(xiàn)[14]的方法，略加改動(dòng)，先配制木屑培養(yǎng)基，121℃濕熱滅菌3 h后備用。從長(zhǎng)有目標(biāo)菌株菌落的培養(yǎng)基上劃取菌絲塊，放置在袋裝木屑培養(yǎng)基中，用報(bào)紙包裹室溫黑暗放置30 d，當(dāng)木屑培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿菌絲后用作接種體，進(jìn)行致病性測(cè)定。以相同方法制作接入空白瓊脂塊的木屑棒作為對(duì)照。選擇5株健康的臺(tái)灣相思、馬占相思與耳葉相思幼樹，在莖干基部制造傷口，將布滿菌絲的接種體貼于傷口，下方用濕棉花保濕，再用保鮮膜纏繞固定接種體，對(duì)照組采用相同方法，2個(gè)月后檢查苗木接種部位的發(fā)病情況并拍照。

1.7 病原菌鑒定

1.7.1 形態(tài)學(xué)鑒定以趙繼鼎《中國(guó)真菌志》第十八卷靈芝科[18]、卯曉嵐《中國(guó)大型真菌》[19]、吳興亮《中國(guó)靈芝圖鑒》[20]等書籍為依據(jù)對(duì)病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。觀察病原菌擔(dān)子果的形狀、大小、顏色、有無(wú)菌柄、有無(wú)光澤、菌肉質(zhì)地、擔(dān)孢子直徑顏色等形態(tài)特征并進(jìn)行拍照記錄。

1.7.2 分子鑒定用真菌DNA提取試劑盒提取供試擔(dān)子果的DNA，使用引物ITS1/ITS4，NS1/NS4和LROR/LR7對(duì)所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至海口楠山生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將獲得的測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)并上傳NCBI獲得GenBank登錄號(hào)。在GenBank上搜尋靈芝與其他屬中同時(shí)含有ITS，SSU，LSU基因的菌株，下載相關(guān)序列，使用Sequences Matrix進(jìn)行拼接，使用MEGA7.0對(duì)拼接好的序列通過(guò)NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹，對(duì)所采集的病原菌進(jìn)行分子鑒定。

1.8 數(shù)據(jù)分析處理所測(cè)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

2.1.1 臺(tái)灣相思紅根病癥狀臺(tái)灣相思在發(fā)病初期出現(xiàn)葉片褪綠、發(fā)黃、下垂，樹勢(shì)差，新生葉子變小等癥狀，隨著病程進(jìn)展，樹葉逐漸枯萎，枯枝變多，樹冠變小，最后整株枯死（圖1-A、圖1-B）。在臺(tái)灣相思的樹干和莖基部，可以產(chǎn)生大量的擔(dān)子果，其形態(tài)隨不同地區(qū)生長(zhǎng)環(huán)境變化而產(chǎn)生差異（圖1-C）。發(fā)病莖干和樹根會(huì)產(chǎn)生海綿狀濕腐（圖1-D），病根表面黏泥沙（圖1-E），用水洗凈后可見(jiàn)黑紅色革質(zhì)菌膜（圖1-F）。海南各地臺(tái)灣相思紅根病的癥狀基本相似，總體田間發(fā)病率約為3%～4%。

圖1 臺(tái)灣相思樹紅根病癥狀

擔(dān)子果編號(hào)：HNHKJNL201909281003；HNDZ-202010221023；HNHK202108111034；HNHK2021-08111035；HNHK202108119036；HNHK2021081-11037。

2.1.2 馬占相思紅根病癥狀馬占相思在發(fā)病初期無(wú)明顯癥狀，后出現(xiàn)葉片發(fā)黃，萎垂，脫落（圖2-A），樹冠稀疏，部分枝條在葉片脫落后枯死。病株生長(zhǎng)不良，長(zhǎng)勢(shì)衰弱，最終整株葉片脫落并枯死（圖2-B）。在環(huán)境條件適合時(shí)，莖干和莖干基部能產(chǎn)生黃褐色到紅褐色的擔(dān)子果（圖2-C），即使枯樹被砍倒，樹樁上多處在雨季過(guò)后依然會(huì)長(zhǎng)出擔(dān)子果（圖2-D）。該病發(fā)生較多，在儋州、定安、陵水等地均有發(fā)現(xiàn)，田間發(fā)病率為4%～5%。

圖2 馬占相思紅根病癥狀

擔(dān)子果編號(hào)；HNDZDC201910161005；HNXQ-202001061011；HNBS202008291013；HNDA2020-09031016；HNDA202009031017；HNDA20201021-1021；HNLS 202011201025；HNDA202108141043；HNQH20 2109051057。

2.1.3 耳葉相思紅根病癥狀耳葉相思受到侵染后隨著病情發(fā)展出現(xiàn)樹冠稀疏，葉片短小，發(fā)黃、下垂，枯枝多等癥狀，發(fā)病后期整株枯死（圖3-A、圖3-B）。病株死后變成枯樹，病原菌依然能夠在其病殘?bào)w特別是根莖部存活數(shù)年。在環(huán)境濕度大的時(shí)候，病樹的莖干和莖基部上會(huì)長(zhǎng)出紅褐色擔(dān)子果（圖3-C～圖3-E）。耳葉相思根腐發(fā)病較少，田間發(fā)病率約為1%～2%。

擔(dān)子果編號(hào)：HNCJ202108261036；HNDZXL-202109271068。

2.2 致病性測(cè)定人工接種2～3個(gè)月后，被接種不同待測(cè)菌株TWXSGF001、MZXSGF001、EYXSGF001的各5株相思樹苗樹冠葉片失綠、發(fā)黃或枯死，接種部位組織白腐，有的長(zhǎng)有黃白色腐竹狀菌膜、黑紅色革質(zhì)菌膜，對(duì)照創(chuàng)傷部位已長(zhǎng)出愈傷組織，頂端葉片無(wú)異常變化（圖4）。從發(fā)病植株的接種部位采取樣本，再分離得到相同的菌株，結(jié)果表明分離菌TWXSGF001、MZXSGF001、EYXSGF001均為3種相思樹的致病菌。

TWXSGF001、MZXSGF001、EYXSGF001 3株菌株分別在木屑培養(yǎng)基生長(zhǎng)120 d后長(zhǎng)出與田間發(fā)病植株上生長(zhǎng)相似的擔(dān)子果（圖5）。

圖5 相思紅根病原菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的擔(dān)子果

2.3 形態(tài)鑒定

2.3.1 臺(tái)灣相思紅根病原菌的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的TWXSGF001病原菌菌絲絨毛狀，平伏生長(zhǎng)，乳白色圓形，邊緣整齊，無(wú)氣味（圖6-A）。擔(dān)子果一年生，生長(zhǎng)初期的擔(dān)子果為球狀，以純白色為主。有短柄，有漆樣光澤。菌柄細(xì)長(zhǎng)，側(cè)生，紅褐色至紫黑色。生長(zhǎng)后期的擔(dān)子果有柄或無(wú)柄，木栓質(zhì)到木質(zhì)。菌蓋近半圓形、近腎形或近扇形，單生或疊生，大小為（2.5～8.5）cm×（4.5～15） cm，厚0.5～2 cm，表面紅褐色、紫褐色或紫紅色，有漆樣光澤，靠邊緣為黃褐色至白色，中心厚邊緣?。缓?.5～1.9 cm，菌肉為褐色，無(wú)黑色殼質(zhì)層；菌管長(zhǎng)0.1～0.2 cm，褐色；孔面污白色或淡褐色。不同地區(qū)的臺(tái)灣相思樹病株上長(zhǎng)出的擔(dān)子果形態(tài)略有差異（圖6-B～圖6-D）。擔(dān)孢子卵圓形，雙層壁，頂端平截，外壁光滑透明；內(nèi)壁淡褐色有小刺，部分中央有1個(gè)油滴。大小為（6.2～8.9）μm×（3.6～6.4）μm，平均長(zhǎng)7.540μm，平均寬5.01μm，長(zhǎng)寬比Q為1.394～1.729（圖6E）。

圖6 臺(tái)灣相思紅根病病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.3.2 馬占相思紅根病原菌的形態(tài)特征MZXSGF001菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的病原菌菌絲絨毛狀，菌落為白色圓形，邊緣圓鈍，平伏生長(zhǎng)，（圖7-A）。擔(dān)子果一年生，單生，有柄或無(wú)柄，木栓質(zhì)或木質(zhì)。菌蓋半圓形，腎形或扇形，長(zhǎng)4～12 cm，寬3.5～8.0 cm，邊緣厚0.2～0.7 cm，柄長(zhǎng)4～8 cm。菌蓋中心為紅褐色，邊緣為黃褐色或白色，表面有漆樣光澤，有同心環(huán)紋。菌肉深褐色，無(wú)殼質(zhì)層。背面白色或淡褐色，無(wú)光澤，邊緣圓鈍。菌柄長(zhǎng)，側(cè)生，紅褐色至紫褐色（圖7-B～圖7-D）。擔(dān)孢子南瓜子形或頂端平截，有內(nèi)外兩層壁，外壁透明，內(nèi)壁褐色，（5.3～7.2）μm×（6.8～11.2）μm，平均長(zhǎng)9.13μm，平均寬6.16μm，長(zhǎng)寬比Q為1.133～1.833（圖7-E）。

圖7 馬占相思紅根病病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.3.3 耳葉相思紅根病原菌的形態(tài)特征菌落特征：在PDA上，菌絲平伏生長(zhǎng)，絨毛狀，邊緣平滑，菌落為白色圓形，無(wú)氣味（圖8-A）。擔(dān)子果一年生。菌肉褐色，無(wú)黑色殼質(zhì)層，單層或多層。有細(xì)柄或無(wú)柄，木栓質(zhì)或木質(zhì)，菌蓋單生，長(zhǎng)4.0～7.4 cm，寬4.0～6.8 cm，邊緣厚0.6～0.8 cm，柄長(zhǎng)5.8～7.2 cm，半圓形，扇形或腎形，有同心環(huán)紋。正面靠邊緣一圈為白色，朝內(nèi)均為深紅褐色。有光澤；背面通常白色至淡褐色，沒(méi)有光澤，邊緣圓鈍。菌柄細(xì)長(zhǎng)，側(cè)生，深紅褐色（圖8-B～圖8-E）。擔(dān)孢子南瓜子形，中間有一個(gè)較大的油滴，雙層壁，淡褐色，大小為（4.5～6.4）μm×（6.6～10.0）μm，平均長(zhǎng)8.09 cm，平均寬5.71 cm。長(zhǎng)寬比Q為1.25～1.56（圖8-F）。根據(jù)其形態(tài)特征參考《中國(guó)靈芝圖鑒》《中國(guó)大型真菌》《中國(guó)真菌志》等文獻(xiàn)，將上述3種病原菌初步鑒定為熱帶靈芝[Ganoderma tropicum(Jungh.) Bres.][19]。

圖8 耳葉相思紅根病病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.4 分子生物學(xué)鑒定測(cè)序結(jié)果顯示，rDNA-ITS序列為610～619 bp，SSU序列為1048～1084 bp，LSU序列為960～1104 bp（表2）。在NCBI上進(jìn)行Blastn比對(duì)，結(jié)果顯示，所得序列與熱帶靈芝[G. tropicum(Jungh.) Bres.]序列的相似度均高于98%。選取親緣關(guān)系較近的10個(gè)菌株，經(jīng)序列比對(duì)后在MEGA7.0中利用NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果可見(jiàn)，分離獲得的菌株均與熱帶靈芝聚為一類（圖9）。結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將侵染臺(tái)灣相思、馬占相思與耳葉相思的菌株TWXSGF001、MZXSGF001與EYXSGF001鑒定為熱帶靈芝[G. tropicum(Jungh.)Bres.]。

表2 菌株的序列登錄號(hào)

3 討 論

本研究采集了海南3種相思樹紅根病的病原菌擔(dān)子果，分離得到病原菌完成致病性測(cè)定，結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法將引起海南臺(tái)灣相思、馬占相思、耳葉相思紅根病的病原菌鑒定為熱帶靈芝（G. tropicum）。弓明欽[6]將海南臺(tái)灣相思根腐病病原菌經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為熱帶靈芝（G.tropicum），本研究結(jié)果與其研究結(jié)果相同。岑炳沾等[9]根據(jù)子實(shí)體形態(tài)將廣東多地馬占相思與耳葉相思根腐病病原菌鑒定為靈芝（G. lucidum），Mehrotra等[8]將印度馬占相思樹根腐病的病原菌鑒定為靈芝（G. lucidum）。吳如慧等[22]通過(guò)形態(tài)學(xué)特征鑒定和SSU序列分析將海南定安、臨高等地的臺(tái)灣相思根腐病原菌鑒定為假芝(Amauroderma rugosum)。戴玉成等[11]報(bào)道引起海南五指山與瓊中的臺(tái)灣相思死亡的根腐病原菌為熱帶靈芝(Ganoderma tropicum)和粗柄假芝 (Amauroderma. elmerianum)。多種靈芝菌均可引起相思樹根腐病，包括靈芝屬(Ganoderma)與假芝屬(Amauroderma)下的多個(gè)物種，不同地區(qū)和不同地理環(huán)境下相思樹根腐的病原菌可能不同。在田間調(diào)查的過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)，海南?？?、定安、瓊中、萬(wàn)寧、樂(lè)東、保亭、三亞、東方、昌江、白沙、儋州、澄邁、臨高等市縣均發(fā)現(xiàn)由熱帶靈芝引起的相思樹根腐病，此病多在公路旁的行道樹上發(fā)現(xiàn)，在海南各地分布廣泛。

熱帶靈芝引起相思樹紅根病，其地上枝條枯死程度與地下根系腐爛程度存在相關(guān)性。病原菌從相思樹莖基部或根部侵入后在根部感染部位形成黃白色、腐竹狀的菌膜，然后繼續(xù)發(fā)育，在樹莖基部產(chǎn)生大型子實(shí)體；病株死后，病原菌依然能夠在其病殘?bào)w特別是根莖部存活數(shù)年，在雨季和雨季過(guò)后，其近地面和暴露于地表的根上依然能長(zhǎng)出黃白色擔(dān)子果。在病害蔓延的過(guò)程中，可通過(guò)病根與健康植株的根系接觸產(chǎn)生短距離的傳播，長(zhǎng)距離的傳播通過(guò)人力和風(fēng)雨對(duì)病原菌子實(shí)體產(chǎn)生的擔(dān)孢子擴(kuò)展蔓延，并在林間形成明顯的發(fā)病中心。在本研究的調(diào)查過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)相思樹紅根病多在道路邊與公園內(nèi)發(fā)現(xiàn)，而山林內(nèi)發(fā)現(xiàn)較少，說(shuō)明人為活動(dòng)加劇了病害的傳播。同時(shí)，在土壤濕度較大、較為粘重且透氣性較差的地方該病發(fā)生較重。在高溫、高濕季節(jié)，相思樹紅根病也更容易發(fā)生。

由于紅根病在染病前期不易被發(fā)現(xiàn)與診斷，一旦出現(xiàn)明顯癥狀或長(zhǎng)出擔(dān)子果時(shí)其內(nèi)部組織已經(jīng)大部分白腐，施藥較難治愈。在對(duì)熱帶靈芝所致紅根病的防治上，應(yīng)堅(jiān)持“預(yù)防為主，綜合防治”的植保方針，徹底清除病樹病根，及時(shí)銷毀其病殘?bào)w是預(yù)防此病發(fā)生的關(guān)鍵措施。在公園與市政綠化的過(guò)程中，應(yīng)避免在除草時(shí)傷及樹木莖基部造成傷口而導(dǎo)致紅根病的發(fā)生。此外，在設(shè)計(jì)和培育防護(hù)林時(shí)，要注意將豆科與非豆科植物混合種植，也可以起到預(yù)防減緩紅根病發(fā)生和傳播的效果。一旦發(fā)生病情，應(yīng)當(dāng)盡可能在早期進(jìn)行診斷。對(duì)已被輕度侵染的發(fā)病樹木建議用十三嗎啉或根康等藥劑進(jìn)行灌根處理，對(duì)于發(fā)病嚴(yán)重的老齡樹木應(yīng)及早清除，將病殘?bào)w和子實(shí)體集中燒毀，防止病害擴(kuò)散。