CRISPR/Cas9技術在昆蟲基因功能研究中的應用及優(yōu)化

劉露露，林 哲，鄒 振

（1.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002;2.中國科學院動物研究所 農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室，北京 100101;3.中國科學院大學 生物互作卓越創(chuàng)新中心，北京 100049）

隨著基因測序技術的發(fā)展，基因編輯系統(tǒng)逐漸成為生物科學領域研究的有力工具，也是昆蟲基因功能研究的重要手段。2013年第三代基因編輯技術Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9（CRISPR/Cas9）被首次應用在真核細胞中成功進行了基因編輯[1]，隨后該技術以其操作簡便、材料成本低和效率高等優(yōu)勢，被迅速應用于人類細胞[2-4]、小鼠(Mus musculus)[5]、大鼠(Rattus norvegicus)[6]、斑馬魚(Danio rerio)[7]、酵母（Saccharomyces cerevisiae）[8]、果蠅（Drosophila melanogaster）[9]和家蠶（Bombyx mori）[10]等的研究中。本研究系統(tǒng)綜述了CRISPR/Cas9技術在非模式昆蟲色素表型、殺蟲劑抗性和神經(jīng)行為學研究中的應用情況及優(yōu)化改良方案，旨在為昆蟲基因學的深入研究和農(nóng)業(yè)害蟲的綠色防控提供參考。

1 基因編輯技術的由來

在CRISPR/Cas9基因編輯技術誕生之前，鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）技術[11]和類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activatorlike effector nuclease，TALEN）技術[12]是常用的基因編輯工具，ZFN技術由鋅指蛋白結構域特異性識別靶基因一單鏈上的三聯(lián)子位點，F(xiàn)okI核酸切割酶進行切割[13-15]；TALEN技術通過TALE蛋白串靶向識別DNA，二聚化的FokI進行切割[16-17]，二者均基于蛋白質對DNA的識別。

CRISPR/Cas9原理與ZFN和TALEN的蛋白質-DNA識別模式不同，該技術對DNA靶標位點的識別更加準確。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展最早源于1987年，Ishino等[18]在大腸桿菌K12中首次發(fā)現(xiàn)一段含29個堿基的重復序列。直到2002年Jansen等[19]將這種結構命名為規(guī)律間隔成簇短回文重復序列（CRISPR），并認為此序列僅存在于古生菌和細菌中，在真核生物和病毒中不存在。2005年研究者發(fā)現(xiàn)在病毒和質粒中也具有CRISPR序列，推測其可能與細菌適應性免疫功能相關[20-22]?？茖W家利用噬菌體感染嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），終于發(fā)現(xiàn)了細菌捕獲噬菌體基因片段并插入到自身基因組的機制，證實該系統(tǒng)確是細菌的適應性免疫系統(tǒng)[23]。隨后，2008—2012年，研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了CRISPR/Cas9免疫系統(tǒng)的作用靶點及CRISPR RNA（crRNA）、反式激活crRNA（trans-activating CRISPR RNA，tracrRNA）和Cas9蛋白等參與分子，并表明該系統(tǒng)可應用于基因編輯[24-27]。2013年，張鋒團隊[8]實現(xiàn)了此技術在真核細胞中的首次應用。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)含一個源于釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9效應蛋白，該蛋白在一條sgRNA（single guide RNA）或gRNA（guide RNA）的引導下即可實現(xiàn)對靶基因的特異性剪切。當靶標DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂缺口（double stand break,DSB），在其斷裂位點，細胞啟動自我修復機制，即非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）或同源介導的雙鏈DNA修復（homology-directed repair，HDR）。NHEJ是一種容易出錯的修復機制，過程中通常出現(xiàn)堿基缺失或插入，導致移碼突變，破壞目的基因開放閱讀框，實現(xiàn)基因敲除（gene knockout）；HDR修復機制則更加精確，通過引入外源DNA作為修復模板，就能夠實現(xiàn)基因敲入（gene knockin）。

2 CRISPR/Cas9技術在昆蟲基因功能研究中的應用

在昆蟲基因功能研究中，遺傳學手段主要依靠基因可遺傳的操縱。1982年，P element在果蠅中實現(xiàn)敲除而使基因功能喪失。然而在非模式昆蟲中，直到21世紀90年代才利用Mariner，piggyBac等轉座子技術實現(xiàn)，但繁瑣、成功率低。雖然基于雙鏈RNA的基因沉默技術在昆蟲中廣泛使用，但其存在轉染效率低、遺傳不穩(wěn)定等缺點。自從2013年張鋒和Church兩個團隊相繼報道CRISPR/Cas9系統(tǒng)在人和小鼠細胞中成功實現(xiàn)基因的定點編輯以來[1,4]，此技術已廣泛應用于昆蟲基因功能研究當中，其中主要是農(nóng)業(yè)昆蟲（表1），這極大地推進了昆蟲科學研究的發(fā)展。

表1 CRISPR/Cas9技術在非模式生物昆蟲中的部分應用

續(xù)表1

2.1 基因敲除技術在昆蟲基因功能研究中的應用

2.1.1 在昆蟲色素沉著的表型可塑性上的應用早期基因敲除技術集中研究昆蟲體色、眼色和翅色等色素基因，對于探索昆蟲的遺傳發(fā)育具有重要意義。在褐稻虱（Nilaparvata lugens）中，Chen等[52]敲除黑色素代謝基因CSAD（cysteine sulfinic acid decarboxylase）誘 導G0代 的 突 變，證 明CSAD是成蟲正常體色的必需基因；Xue等[65]成功驗證cinnabar和white基因的沉默會引起褐稻虱紅色復眼和白色復眼可遺傳突變。Khan等[66]利用CRISPR/Cas9技術敲除棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）體細胞的色素沉著基因white、brown、scarlet和ok，結果發(fā)現(xiàn)：white的敲除對卵、一齡幼蟲和成蟲眼色有影響；scarlet敲除后產(chǎn)生了一齡無色幼蟲和黃色成蟲；brown敲除不影響其色素沉著表型；ok的敲除使幼蟲角質層變透明及眼色變黑。昆蟲的翅色通常也是由多基因決定的。研究人員對偏瞳蔽眼蝶（bicyclus anynana）的眼色進行研究，發(fā)現(xiàn)通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除TH、DDC、aaNAT、yellow和ebony基因會影響其翅膀的結構組成和翅色[67]。

2.1.2 在殺蟲劑抗性研究上的應用研究昆蟲對殺蟲劑的抗性機制對防治害蟲有重要作用。2016年，Wang等[68]通過基因組敲除技術證明棉鈴蟲CAD基因是Bt（Bactospeine）殺蟲劑CrylAc毒素受體；2017年，該團隊又通過基因敲除分別建立了1個ABCA2基因第二外顯子上2 bp缺失的突變品系和1個類似r2突變的5 bp缺失品系，證明了棉鈴蟲ABCA2對Bt殺蟲劑Cry2Aa和Cry2Ab毒素的高抗性[69]。在對亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）的研究中發(fā)現(xiàn)，ABCC2基因對Cry1Fa具有高水平抗性，而對Cry1Ab和Cry1Ac抗性較低[42]。草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）ABCC2基因的敲除使其對Cry1F的抗性增加118倍[70]。雙酰胺類殺蟲劑具有胃毒作用，對鱗翅目昆蟲防治效果好，但小菜蛾（Plutella xylostella）由于其繁殖能力強和周期短的特點很快產(chǎn)生了抗藥性[71]，Troczka等[72]發(fā)現(xiàn)其抗藥性與魚尼丁受體G4946E的突變有關。隨后Zuo等[73]利用CRISPR/Cas9技術在甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）中證明魚尼丁受體G4946E突變，對氯蟲苯甲酰胺、氯蟲酰胺和氯蟲雙酰胺的抗性分別提高223、336和1 000倍以上。

2.1.3 在昆蟲神經(jīng)行為學研究中的應用化學信息素信號通過昆蟲神經(jīng)外周組織接受，觸角神經(jīng)組織處理，進而在腦部中樞神經(jīng)系統(tǒng)嗅覺和其他感受器官共同指導昆蟲覓食、交配、生殖等[74-75]。Garczynski等[76]通過該技術靶向敲除蘋果蠹蛾（Cydia pomonella）的OR1基因，發(fā)現(xiàn)對突變雌蟲繁殖力影響嚴重。煙草天蛾（Manduca sexta）的嗅覺受體ORCO被敲除后，其覓食行為發(fā)生變化，而產(chǎn)卵行為不變[77]。Ye等[78]通過CRISPR/Cas9敲除棉鈴蟲編碼信息素結合蛋白（Pheromone binding proteins）基因PBP1，證實PBP1在雌蟲性信息素的感知中具有重要作用，性信息素的感知與交配有關。敲除斜紋夜蛾信息素結合蛋白基因PBP3引起突變體對性信息素感知能力顯著下降[79]。

研究昆蟲性別分化有利于農(nóng)業(yè)昆蟲的種群控制和害蟲防治。家蠶和小菜蛾ser2基因敲除引起雄性個體不育，但并不影響突變體的交配行為，最終將雄性不育表型傳遞給后代[80]。在家蠶和斜紋夜蛾中，osp基因的敲除使突變雌性的交配行為不變，但所產(chǎn)的卵不發(fā)育[81]。Markert等[82]利用TALENS和CRISPR/Cas9系統(tǒng)使君主斑蝶（Danaus plexippus）時鐘相關基因cryptochrome2（cry2）和clock（cl）突變，發(fā)現(xiàn)clk是位于Z性染色體的性別連鎖基因；敲除clk會破壞其羽化的晝夜節(jié)律。

2.2 基因敲入技術在昆蟲基因功能研究中的應用基因敲入難于基因敲除，該技術利用細胞自身的HDR修復機制通過靶向編輯系統(tǒng)將外源基因定點整合到基因組中。果蠅中基因敲入的應用較多。如，Xue等[83]將sgRNA與環(huán)狀DNA供體注射到果蠅胚胎，成功實現(xiàn)了同源重組介導的熒光基因敲入；Zimmer等[84]使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)引入了果蠅nAChRα6受體中的同源突變，發(fā)現(xiàn)該受體G275E突變顯著增加了果蠅對多殺菌素的抗性；隨后Lamb等[85]利用該技術在果蠅的目標位點實現(xiàn)了精確替換?；蚯萌朐谄渌r(nóng)業(yè)昆蟲中也有一些相關報道。如，2015年，Gillies等[29]將非同源末端連接產(chǎn)生的突變引入赤擬谷盜（Tribolium castaneum），證實這種突變能傳遞給下一代，并在14%的注射個體中觀察到標記的定向敲入；2021年，Matsuoka等[60]通過將供體序列敲入雙斑蟀（Gryllus bimaculatus）基因Ubx、abd-A的外顯子來破壞目標基因的功能，將成功應用于Hox相關基因的功能分析。

3 CRISPR/Cas9技術的優(yōu)化與改良

傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9基因組編輯技術是通過引入DSB進行基因編輯的，但由于細胞修復機制的復雜性和多變性，在實驗操作中脫靶效應（offtarget effect）和編輯效率低仍然是目前需要面對的難題。Cas9活性、sgRNA序列設計和靶DNA位點下游PAM序列識別等都是造成脫靶效應或增加脫靶效應風險的因素。目前已經(jīng)報道了許多針對該技術改良優(yōu)化以提升基因編輯成功率的方案，如選擇不同的Cas9同源蛋白[86-88]，優(yōu)化sgRNA靶點的設計[89-90]；也可通過優(yōu)化Cas9RNP的傳遞方式和提高sgRNA-Cas9復合物的濃度[91]等進行該技術改良和優(yōu)化。

3.1 Cas9同源蛋白優(yōu)化CRISPR/Cas9研究人員將突變引入Cas9蛋白的D10A或H840A，即使一個HNH結構域或RuvC結構域失去活性或同時失活，以得到僅具有結合能力和單鏈裂解活性或不具裂解活性的dCas9（deadCas9）蛋白；dCas9在sgRNA導向下與DNA結合的功能不受影響[92-93]。CRISPR/dCas9系統(tǒng)能夠調(diào)控 基因的轉錄抑制和轉錄激活[93-94]，如Liu等[95]將dCas9與調(diào)控因子DNMT3A融合，O'Geen等[96]將dCas9與調(diào)控因子FOG1融合，二者的目的均是使基因轉錄水平得到抑制。上述Cas9蛋白均為來源于釀膿鏈球菌的SpCas9蛋白，近年來還發(fā)現(xiàn)了來自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的SaCas9蛋白。SaCas9在晶體結構和基因組編輯效率方面和SpCas9非常相似，但其分子量小，首選PAM序列為5′-NNGRRT（N為任意核苷酸；R=A或G），增加了靶位點識別的特異性[97-98]。2017年，Ma等[99]通過用SaCas9替換SpCas9編碼序列構建載體，選取BmKu70為靶點，成功驗證了SaCas9/sgRNA介導的新型CRISPR/Cas9系統(tǒng)在家蠶中的應用，基因編輯效率達到11.9%。除此之外，Hu、Guo等[100-101]均報道了一種Cas9的變體—xCas9 3.7，它的突變使PAM序列的識別不及Cas9精準，但可靈活識別多個PAM序列，這是由E1219構象變化導致鹽橋不穩(wěn)定引起的。xCas9 3.7變體無論是在體外生化實驗還是在胞內(nèi)實驗都表現(xiàn)出優(yōu)良的PAM識別兼容性和DNA靶向性，為解決基因編輯效率問題提供了更多選擇[100]。

3.2 sgRNA靶點設計優(yōu)化CRISPR/Cas9研究發(fā)現(xiàn)，sgRNA基因編輯效率與靶DNA PAM序列附近10～12 bp堿基的GC含量成正比[102]，且含量在40%～80%具有切割效率[103]。Gagnon等還發(fā)現(xiàn)，5'-GA sgRNAs的切割效率與5'-GG sgRNAs相比存在輕微下降。對于sgRNA的長度設計，研究者存在爭議。早期研究通常設計20個核苷酸序列，F(xiàn)u等[104]認為低于20個核苷酸序列的短sgRNA能夠在不影響基因編輯效果的條件下降低脫靶風險，而Kleinstiver等[105]則認為無法增加靶位點識別特異性，且還會降低基因編輯效率，因此問題有待進一步探索。Zhang等[106]根據(jù)鱗翅目昆蟲的CRISPR/Cas9技術進行了總結，建議使用CasBLASTR web工具識別任一單鏈的GGN18NGG或N20NGG序列，以確定sgRNA靶位點；并建議基因插入用含有EGFP蛋白編碼序列和同源臂的供體質粒來匹配Cas9位點兩側序列。

3.3 Cas9 RNP傳遞方式優(yōu)化CRISPR/Cas9 Rodriguez等[107]受卵黃蛋白前體（Yolk Protein Precursor）通過受體介導的內(nèi)吞作用進入卵巢過程的啟發(fā)，開發(fā)了一種受體介導的卵巢分子轉運（Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo,ReMOT control）技術，使配體P2C肽與Cas9蛋白結合，從而介導Cas9核糖核蛋白（Cas9 RNP）從雌性蚊子血淋巴轉導到發(fā)育中的卵母細胞，實現(xiàn)了可遺傳給后代的基因編輯，效率達到30%。2020年，研究人員又利用ReMOT控制技術融合EGFP對麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）基因cinnabar進行編輯，成功觀察到卵巢輸送的熒光標記[51]。Shirai等[30]利用該技術通過向赤擬谷盜成蟲進行顯微注射，建立了新的cardinal突變系。Heu等[54]也利用該技術以BtKV作為卵巢靶向肽配體，成功完成了在煙粉虱（Bemisia tabaci）上的基因編輯。此外，Wu等[108]開發(fā)了一種新型的蛋白質電暈納米顆?！Y合介導的蛋白質冠狀體，由Cas9 RNP、納米粒子核心和親和配體構成，具有高效傳遞、高穩(wěn)定性和低細胞毒性等優(yōu)點。

3.4 sgRNA-Cas9復合物優(yōu)化 CRISPR/Cas9最新研究認為sgRNA與Cas9蛋白的濃度比例與脫靶效應密切相關[91]，復合體的濃度較高時，錯配即使發(fā)生在PAM區(qū)或鄰近PAM區(qū)，DNA切割仍然繼續(xù)進行，這種現(xiàn)象在低濃度時則不會發(fā)生，因此在實驗中應選擇合適的啟動子以控制sgRNA和Cas9的表達量。此外，Svitashev等[109]的研究表明在體外先將Cas9和sgRNA組裝成復合物Cas9 RNP后再導入受體中也有利于降低脫靶效應。

4 展 望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的基因編輯技術是近些年最有力的基因編輯技術之一。哺乳動物中利用CRISPR/Cas9技術篩選致病菌和毒素的研究方法已得到廣泛應用，在昆蟲中亦有報道[110]。在Perrimon教授團隊開發(fā)的果蠅S2R+細胞全基因CRISPR/Cas9文庫基礎上[111]，董民教授團隊開發(fā)了一種質粒介導的sgRNA文庫轉染，通過位點特異性重組實現(xiàn)穩(wěn)定整合，研究結果表明，在免疫細胞中表達的Vsg是發(fā)光桿菌（Photorhabdusluminescens）Tc毒素的特異性受體；Vsg敲除的果蠅血細胞對該毒素具有抗性。此研究為農(nóng)業(yè)昆蟲及媒介傳染病昆蟲靶向毒素和病原菌的鑒定提供了全新的研究方案。雖然在模式昆蟲和許多非模式昆蟲中都已初步建立了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，但與基因敲除相比，基因敲入研究鮮有報道，這可能是因為CRISPR/Cas9系統(tǒng)對基因組DNA靶向切割后，雖然通過同源重組修復能夠實現(xiàn)目的片段的插入，但整合效率和成功率依然很低，未來的基因敲入系統(tǒng)還需要繼續(xù)探索優(yōu)化。

CRISPR/Cas9基因組編輯技術在近些年發(fā)展迅速，由于在此基礎上構建的基因驅動（gene drive）系統(tǒng)在理論上能驅動性狀的變化趨勢，因此可用于調(diào)控害蟲種群的性別比例，為害蟲防治提供新策略[112]?；瘜W殺蟲劑的不合理使用不僅危及人類健康，也使許多害蟲對化學殺蟲劑產(chǎn)生強烈的抗藥性，從而引起更加嚴重的藥劑濫用，造成惡性循環(huán)。基因驅動策略是一個重要的發(fā)展方向?；蝌寗硬呗允侵柑囟ɑ蛟诜N群中偏向性地遺傳給下一代的現(xiàn)象，最早由帝國理工大學遺傳學家Austin Burt在2003年提出[113]，其原理是基于歸巢內(nèi)切酶或人工核酸酶構建而成的驅動系統(tǒng)。目前基于CRISPR/Cas9構建的基因驅動系統(tǒng)已在斯氏按蚊（Anopheles stephensi）[114]、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）[115]等昆蟲上成功建立了理論模型，為降低瘧疾傳播風險提供理論支撐。然而，由于這種技術的應用存在不可控性，一旦在種群中廣泛擴散，可能對生物種群和生態(tài)鏈造成破壞，因此，建立安全、可控、高效及穩(wěn)定的基因驅動系統(tǒng)有待科學家繼續(xù)研究。

目前，利用CRISPR/Cas9工具開展的昆蟲相關工作主要集中在鑒定功能基因和實驗優(yōu)化改良等基礎研究上；新型和多樣CRISPR/Cas9體系的不斷發(fā)展與構建，將會推動農(nóng)業(yè)害蟲的綠色防控工作得到高度重視與快速推進，基于CRISPR/Cas9構建的基因驅動系統(tǒng)的安全性也將得到持續(xù)關注。