小兒過(guò)敏性紫癜性腎炎SOCS-3及HMGB1與Th17/Treg細(xì)胞失衡的關(guān)系

馬志華，布力布麗·巴哈提，阿布來(lái)提·阿不都哈爾

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒急危重癥醫(yī)學(xué)科，新疆 烏魯木齊 830054)

過(guò)敏性紫癜性腎炎(henoch-schonlein purpura nephritis，HSPN)作為一種小兒免疫性血管炎，臨床表現(xiàn)為血尿異?；蛘呒毙阅I炎綜合征、甚至出現(xiàn)腎功能衰竭，通常被學(xué)者認(rèn)為與體液免疫、細(xì)胞免疫等存在聯(lián)系[1]。T細(xì)胞亞群中的輔助性T細(xì)胞(helper T cell 17，Th17)細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulate T cell，Treg)細(xì)胞分別發(fā)揮促進(jìn)和抑制免疫炎癥反應(yīng)的作用，此2種相互拮抗的細(xì)胞比例失衡會(huì)導(dǎo)致多種疾病，也參與到了HSPN的病情進(jìn)展過(guò)程中，且隨著HSPN急性發(fā)展，Th17/Treg失衡越嚴(yán)重，因此探究患兒機(jī)體內(nèi)與Th17/Treg失衡相關(guān)因素對(duì)改善預(yù)后有重要價(jià)值[2-3]。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白3(suppressor of cytokine signaling-3，SOCS-3)作為細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的信號(hào)通路中十分關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，可通過(guò)抑制細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)細(xì)胞因子的過(guò)度刺激，而高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)作為晚期炎性介質(zhì)的一種，能通過(guò)活化的免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌，使得受損的細(xì)胞被動(dòng)釋放至細(xì)胞外，隨后遷移至炎癥器官和組織與相應(yīng)受體，均對(duì)患兒機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生重要作用，但目前臨床對(duì)其與Th17/Treg表達(dá)相關(guān)性的研究較少[4-5]。本研探討小兒過(guò)敏性紫癜性腎炎SOCS-3及HMGB1與Th17/Treg細(xì)胞失衡的關(guān)系，報(bào)告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2018年1月—2020年1月本院收治的實(shí)行干預(yù)治療的HSPN患兒100例為HSPN組，男性54例，女性46例；年齡3～12歲，平均(7.12±1.07)歲；另選取同時(shí)期過(guò)敏性紫癜患兒100例為對(duì)照組，男性52例，女性48例；年齡3～12歲，平均(6.85±1.21)歲。2組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。所有患兒家屬均知情同意且簽署知情同意書(shū)。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) ①依據(jù)《紫癜性腎炎的診治循證指南(試行)》[6]對(duì)HSPN的描述，過(guò)敏性紫癜病程6個(gè)月內(nèi)，肉眼血尿或1周內(nèi)3次鏡下血尿紅細(xì)胞≥3個(gè)/高倍視野，24 h尿蛋白定量>150 mg或尿蛋白/肌酐>0.2；②學(xué)齡前期及學(xué)齡期，3～12歲；③均為初診，且既往無(wú)治療史。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn) ①腦、心、肝功能經(jīng)檢查存在明顯異常；②入組前30 d 內(nèi)采取其他方式進(jìn)行過(guò)相關(guān)治療；③合并先天免疫缺陷、過(guò)敏性疾病或惡性腫瘤；④合并其他原因引起的腎炎。

1.4方法 ①淋巴細(xì)胞檢測(cè)：于2組入院用藥前采集其空腹靜脈血5 mL，分別加入3個(gè)無(wú)菌肝素抗凝管，血液采集均為無(wú)菌操作下完成，采集結(jié)束后立刻進(jìn)行下一步處理，采用流式細(xì)胞法對(duì)血液中Th17比例及Treg進(jìn)行檢測(cè)；儀器為美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FACSCantoTMII流式細(xì)胞儀，試劑盒為配套。②HMGB1檢測(cè)：取血液以1 500 r/min速度離心后采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)血清HMGB1水平進(jìn)行檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度作為Y軸，畫(huà)出能作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程進(jìn)行計(jì)算；儀器為T(mén)hermo公司生產(chǎn)的FC型酶標(biāo)儀，試劑盒為配套。③SOCS3 mRNA檢測(cè)：取剩余部分血液采用密度梯度離心法將其分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞來(lái)檢測(cè)SOCS3 mRNA表達(dá)，嚴(yán)格按照mRNA提取步驟將外周血單個(gè)細(xì)胞中的mRNA進(jìn)行提取，然后將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在0.2 mL的EP管里進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后采用實(shí)時(shí)熒光聚合酶聯(lián)定量分析法(polymerase chain reaction，PCR)對(duì)其表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件為95 ℃持續(xù)1 min變性，再95 ℃持續(xù)10 s，58 ℃持續(xù)2 s，72 ℃持續(xù)20 s，共40個(gè)循環(huán)，將β-actin作為內(nèi)參基因，SOCS3 mRNA表達(dá)水平為目的基因Ct值與內(nèi)參基因β-actin Ct值的差異，為基因相對(duì)表達(dá)量，PCR儀器為杭州漢澤儀器有限公司提供的ABI Prism 7500型。

1.5觀察指標(biāo) ①比較2組HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Treg檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算Th17/Treg水平。②利用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic，ROC)分析HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg預(yù)測(cè)HSPN發(fā)生的價(jià)值；根據(jù)HSPN患兒各指標(biāo)表達(dá)繪制曲線，計(jì)算每個(gè)測(cè)量指標(biāo)的下曲線面積，下曲線面積>0.5即表示該指標(biāo)具有診斷效能，越接近于1則表明其診斷效能越高；該曲線上有一個(gè)截?cái)帱c(diǎn)(橫縱坐標(biāo)之和的最大值)，截?cái)帱c(diǎn)對(duì)應(yīng)數(shù)值為該測(cè)量項(xiàng)目診斷閾值[7]。③通過(guò)Person系數(shù)分析HMGB1、SOCS3 mRNA與Th17、Treg、Th17/Treg的相關(guān)性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，利用ROC分析HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg預(yù)測(cè)HSPN發(fā)生的價(jià)值，相關(guān)性分析以Person系數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組細(xì)胞因子表達(dá)情況比較 HSPN組HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Th17/Treg高于對(duì)照組，Treg水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 2組細(xì)胞因子表達(dá)情況比較Table 1 Comparison of cytokine expression between two groups

2.2各細(xì)胞因子預(yù)測(cè)患兒發(fā)生HSPN的ROC分析 經(jīng)ROC分析，HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg預(yù)測(cè)患兒發(fā)生HSPN的曲線下面積分別為0.944、0.924、0.942、0.973、0.955，見(jiàn)表2，圖1。

表2 各細(xì)胞因子預(yù)測(cè)患兒發(fā)生HSPN的ROC分析Table 2 ROC analysis of cytokines in predicting HSPN in children

圖1 HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg預(yù)測(cè)患兒發(fā)生HSPN的ROC曲線

2.3HSPN患兒SOCS-3及HMGB1與Th17/Treg細(xì)胞失衡的相關(guān)性分析 HMGB1、SOCS3 mRNA與Th17、Th17/Treg呈明顯正相關(guān)，與Treg呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 HSPN患兒SOCS-3及HMGB1與Th17/Treg細(xì)胞失衡的相關(guān)性分析Table 3 Correlation between SOCS-3, HMGB1 and Th17/Treg cell imbalance in children with HSPN

3 討 論

兒童HSPN主要發(fā)生于學(xué)齡前，以秋冬季節(jié)居多，其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，但普遍認(rèn)為可能是免疫蛋白介導(dǎo)的免疫復(fù)合物沉積在血管壁，引起免疫損傷而導(dǎo)致血管壁通透性增高，使得血液和淋巴液滲出，引起多部位病變[8]。目前研究認(rèn)為HSPN患兒在急性期時(shí)可能存在免疫應(yīng)答失衡，導(dǎo)致Th17細(xì)胞異?；罨?，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生減少或者反應(yīng)不足，從而誘導(dǎo)B細(xì)胞過(guò)度活化，免疫蛋白A合成異常增高，機(jī)體分泌過(guò)多的炎癥細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控并引起自身免疫損傷[9]。

本研究結(jié)果顯示，HSPN組HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Th17/Treg顯著高于對(duì)照組，Treg水平顯著低于對(duì)照組，提示HSPN患兒體內(nèi)HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Th17/Treg、Treg均會(huì)呈現(xiàn)異常表達(dá)。HMGB1是廣泛分布于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的核內(nèi)非組蛋白，在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合DNA以穩(wěn)定核小體、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù)，在細(xì)胞膜上表達(dá)則能促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)和血小板激活，放大炎性信號(hào)進(jìn)而引起炎性反應(yīng)失控，從而增加HSPN患兒臨床癥狀[10]。SOCS 蛋白家族抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制有多種，不同的SOCS蛋白發(fā)揮負(fù)反饋的調(diào)節(jié)機(jī)制不同，SOCS3對(duì)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化的作用最重要，主要通過(guò)抑制JAK絡(luò)氨酸激酶的活性而發(fā)揮作用，抑制白介素12/STAT4信號(hào)通路，抑制Th1分化，促進(jìn)Th2的分化，引起免疫損害進(jìn)而促使患兒發(fā)病[11]。Th17細(xì)胞主要通過(guò)分泌細(xì)胞因子白細(xì)胞介素17、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素23等發(fā)揮促炎作用，誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子和趨化因子表達(dá)招募和活化中性粒細(xì)胞，引起組織細(xì)胞浸潤(rùn)和破壞，從而促進(jìn)HSPN的發(fā)生及發(fā)展[12]。Treg細(xì)胞具有免疫能力和免疫抑制，抑制由趨化因子和巨噬細(xì)胞炎癥性蛋白質(zhì)產(chǎn)生而活化的單核細(xì)胞，抑制中性粒細(xì)胞的募集和活化，分泌顆?；倪策?，誘導(dǎo)效應(yīng)淋巴細(xì)胞凋亡，并抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的缺乏，從而使得Th17增高，機(jī)體免疫失調(diào)，使得血管壁累積大量中性粒細(xì)胞，引起廣泛血管炎，促進(jìn)HSPN的發(fā)病[13]。

經(jīng)ROC分析，HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg預(yù)測(cè)HSPN患兒的曲線下面積分別為0.944、0.924、0.942、0.973、0.955，提示HMGB1、SOCS3 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg均能對(duì)HSPN的發(fā)生作出一定預(yù)測(cè)。ROC曲線越是凸?fàn)睿浇咏笊?，表示診斷值越大，曲線將敏感度和特異度以圖示方法結(jié)合在一起，從而準(zhǔn)確反映各指標(biāo)特異度和敏感度的關(guān)系，且不固定分類(lèi)界值，允許中間狀態(tài)存在，幫助使用者結(jié)合專(zhuān)業(yè)知識(shí)來(lái)對(duì)漏判及誤判可能性進(jìn)行權(quán)衡，選擇最佳截?cái)嘀底鳛橐鸹純喊l(fā)生HSPN的血清預(yù)測(cè)參考值[14]。

經(jīng)相關(guān)性分析，HMGB1、SOCS3 mRNA與Th17、Th17/Treg呈明顯正相關(guān)，與Treg呈明顯負(fù)相關(guān)，經(jīng)相關(guān)性分析，HMGB1、SOCS3 mRNA與Th17/Treg失衡存在明顯相關(guān)性。Th17、Treg均為CD4+T細(xì)胞的重要亞型，兩者分化緊密相關(guān)，在炎性環(huán)境下Treg能轉(zhuǎn)化為T(mén)h17及其它效應(yīng)T細(xì)胞，使得其失去免疫抑制功能，還可能受代謝作用調(diào)節(jié)，缺氧誘導(dǎo)因子1α能感受細(xì)胞的缺氧狀態(tài)并上調(diào)糖酵解途徑相關(guān)基因以支持Th17細(xì)胞的分化[15]。HMGB1可能通過(guò)直接作用于Th17細(xì)胞和 Treg細(xì)胞或經(jīng)其他免疫細(xì)胞(樹(shù)突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞)間接作用來(lái)調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡[16]。周天等[17]的研究認(rèn)為，HMGB1能刺激離體髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素23并促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素17A，與本研究結(jié)果相符。SOCS3一方面可通過(guò)調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞可以共同抑制Th17的分化，另一方面通過(guò)抑制白細(xì)胞介素6和白細(xì)胞介素23介導(dǎo)的STAT3信號(hào)途徑和白細(xì)胞介素4介導(dǎo)的STAT6途徑負(fù)調(diào)控Th17的分化[18]。Th17細(xì)胞表達(dá)SOCS3，抑制Th17細(xì)胞的生成，形成負(fù)反饋通路，這可能是機(jī)體的一種保護(hù)性反射，避免了Th17細(xì)胞過(guò)多導(dǎo)致的過(guò)度炎癥。

綜上所述，HMGB1、SOCS3 mRNA與Th17、Th17/Treg呈明顯正相關(guān)，與Treg呈明顯負(fù)相關(guān)，其可能通過(guò)引起Th17/Treg失衡來(lái)影響HSPN患兒病情的進(jìn)展，需引起臨床醫(yī)師密切關(guān)注。