布托啡諾聯(lián)合氟比洛芬酯預(yù)處理通過ANG(1-7)對小鼠肢體缺血再灌注誘發(fā)腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

李海英，張玉平，張 青，張立民

(1.河北省張家口市第二醫(yī)院麻醉科，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 張家口 075000；3.河北省張家口市第二醫(yī)院手術(shù)室，河北 張家口 075000)

缺血再灌注腎損傷是由于多種原因?qū)е履I臟缺血和血液灌注恢復(fù)后引起腎臟功能短期內(nèi)急劇下降或者喪失的臨床綜合征[1-2]，臨床常導(dǎo)致代謝廢物堆積，缺血再灌注腎損傷在住院患者中發(fā)病率達(dá)21%[3-4]。研究表明，氟比洛芬酯可以發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[5-6]，氟比洛芬酯復(fù)合舒芬太尼可以降低手術(shù)后的疼痛，降低組織損傷[7-8]，但是布托啡諾聯(lián)合氟比洛芬酯是否具有腎保護(hù)作用尚不清晰。TNF超家族成員14配體(TNF superfamily member 14 ligand，LIGHT)/ TNF超家族成員14(TNF superfamily member 14,HVEM)是一種腫瘤壞死因子超家族成員，通過皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)(Herpes virus entry medium，HVEM)實(shí)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可受到血管緊張素(1-7)[angiotensin (1-7)，ANG(1-7)]調(diào)控，腎臟損傷中發(fā)揮重要調(diào)控作用[9-10]，但在缺血再灌注引發(fā)腎臟損傷中的作用尚不清晰。因此本研究通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討布托啡諾聯(lián)合氟比洛芬酯預(yù)處理通過ANG(1-7)對肢體缺血再灌注誘發(fā)腎損傷的保護(hù)作用及對LIGHT/HVEM信號通路的干預(yù)作用，為臨床治療缺血再灌注腎損傷提供理論基礎(chǔ)。

1 材 料 與 方 法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 45只8～10周齡雄性SPF級BABL/c小鼠，體重(20±2)g，購于北京智飛綠竹生物制藥有限公司(SYXK(京)2021-0070)。小鼠飼養(yǎng)條件：溫度18～22 ℃，相對濕度40%～60%，噪音85分貝以下，氨濃度15 mg/m3以下，通風(fēng)換氣8 次/h。

1.2藥品與試劑 氟比洛芬酯注射液(國藥準(zhǔn)字H20041508) 購于北京泰德制藥有限公司；布托啡諾注射液(國藥準(zhǔn)字H20020454)購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；戊巴比妥鈉，≥98%購于北實(shí)縱橫科學(xué)公司。伊紅染色液購于北京威斯騰生物有限公司，蘇木素染色液購于武漢賽維爾公司，DAB顯色液購于英國Abcam公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購于日本Takara生物公司，Trizol裂解液購于日本 Takara 生物公司。蛋白上樣緩沖液(5X) 購于上海碧云天生物有限公司，小鼠ANG(1-7)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(E-EL-M2681c)購于武漢Elabscience公司。

1.3儀器設(shè)備 超低溫冰箱購于Thermo Scientific 公司，實(shí)時(shí)定量PCR熒光擴(kuò)增儀購于美國 Bio-rad 公司，低速搖床購于湖南平凡儀器有限公司，石蠟切片機(jī)購于德國Leica公司，攤片烤片機(jī)購于湖北泰維科技有限公司，電動(dòng)組織勻漿機(jī)購于上海靜信實(shí)業(yè)有限公司，Western blot電泳儀購于美國Bio-rad公司，光學(xué)顯微鏡購于德國Leica 公司，凝膠成像系統(tǒng)購于法國Vilber 公司。

1.4方法

1.4.1小鼠肢體缺血再灌注腎損傷模型的建立 小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和試驗(yàn)組，每組15只。試驗(yàn)組小鼠實(shí)驗(yàn)前12 h采用腹腔注射氟比洛芬酯(50 mg/kg)和布托啡諾(1 mg/kg)，對照組和模型組注射等量生理鹽水。造模時(shí)小鼠腹腔注射5%戊巴比妥鈉麻醉，模型組和試驗(yàn)組小鼠雙后肢根部行橡皮套結(jié)扎術(shù)，缺血2 h后用手術(shù)剪剪斷橡皮圈，雙手按摩雙側(cè)后肢血流進(jìn)行血流灌注4 h。對照組小鼠不進(jìn)行結(jié)扎手術(shù)，其他操作一致，48 h后各組小鼠用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測。

1.4.2HE染色及病理評分 將小鼠左側(cè)腎組織浸泡于10%甲醛中，常規(guī)病理組織切片制備，對各組大鼠血管內(nèi)皮進(jìn)行固定包埋后切片，脫蠟覆水，蘇木精染色5 min，5%乙酸1 min，伊紅染色1 min，脫水：70%、80%、90%、100%酒精各10 s，二甲苯1 min，通風(fēng)處自然晾干再封片，于顯微鏡下進(jìn)行檢查,根據(jù)腎小管間質(zhì)半定量評分法對腎炎癥細(xì)胞浸潤、腎間質(zhì)水腫和腎小管損傷分別進(jìn)行半定量分析的標(biāo)準(zhǔn)評分，腎小管上皮細(xì)胞扁平化的存在(1分)，小管刷狀緣消失(1分)，細(xì)胞膜泡出現(xiàn)(1分或2分)，間質(zhì)水腫(1分)，胞漿空泡化(1分)，細(xì)胞壞死(1分或2分)，管腔梗阻出現(xiàn)管型或碎片(1或2分)，正常腎小管為0分。

1.4.3小鼠腎功能指標(biāo)檢測 各組小鼠眼眶采血0.8～1.0 mL，1 000 r/min 10 min離心，分離血清，將血清置于全自動(dòng)生化分析儀中檢測小鼠血清中血清肌酐(serum creatinine，Scr)和尿素氮(urea nitrogen,BUN)水平。

1.4.4酶聯(lián)免疫吸附測定檢測小鼠血清和腎臟組織ANG(1-7)表達(dá)水平 分離小鼠血清以及右側(cè)腎臟組織勻漿上清液后，嚴(yán)格按照小鼠ANG(1-7)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明進(jìn)行，對應(yīng)板孔中加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品工作液或樣本后，立即每孔加入50 μL生物素化抗體工作液，37 ℃孵育45 min，棄掉板內(nèi)液體，洗板3次，每孔加入100 μL HRP酶結(jié)合物工作液，37 ℃孵育30 min，棄掉板內(nèi)液體，洗板5次，每孔加入90 μL底物溶液，37 ℃孵育15 min，每孔加入50 μL終止液，立即在450 nm波長下讀數(shù)，處理數(shù)據(jù)。

1.4.5qPCR檢測各組小鼠腎臟組織LIGHT和HVEM mRNA表達(dá)水平 將腎臟組織研磨后，無酶條件下加入1 mL TRIZOL提取總RNA，后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s， 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共38個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。每個(gè)樣品重復(fù)3次檢測，利用2-△△ct相對定量法計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的相對表達(dá)量，采用內(nèi)參GAPDH對其標(biāo)準(zhǔn)化處理。

表1 qPCR檢測LIGHT和HVEM mRNA表達(dá)引物序列Table 1 Primer sequences of LIGHT and HVEM mRNA expression detected by qPCR

1.4.6Western blot 檢測各組小鼠腎臟組織LIGHT和HVEM mRNA表達(dá)水平 將各組小鼠腎臟組織置于組織勻漿器內(nèi)勻漿后，用1 mL RIPA蛋白裂解液在冰上提取總蛋白，采用BCA法對蛋白濃度進(jìn)行測定。加入5×SDS的蛋白上樣緩沖液煮沸后分裝于EP管，儲存于-80 ℃?zhèn)溆?。聚丙烯酰胺凝膠電泳條件為：濃縮膠電壓80 V 15 min，分離膠電壓120 V 2 h，后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉。加入特異性一抗LIGHT(1∶1 000，ab271185，abcam，英國)、jagged1(1∶1 000，ab109536，abcam，英國)、Notch1(1∶2 000，ab52627，abcam，英國)和β-actin (1∶5 000，ab6276，abcam，英國)于4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，加入特異性的羊抗兔二抗(1∶2 000)，孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，采用ECL化學(xué)發(fā)光液曝光顯影，使用Photoshop圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠腎組織HE染色比較病理損傷情況 通過HE染色確認(rèn)各組大鼠腎臟病理情況，對照組小鼠腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常，不存在炎癥細(xì)胞浸潤；與對照組比較，模型組小鼠腎組織損傷嚴(yán)重，腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，管腔明顯擴(kuò)張，出現(xiàn)上皮細(xì)胞水腫和脫落，部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、壞死，腎間質(zhì)存在大量炎性細(xì)胞浸潤，管腔見大量上皮細(xì)胞碎片和紅細(xì)胞管型；與模型組比較，試驗(yàn)組小鼠腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張充血減輕，少見腎小管管腔擴(kuò)張、腎間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤和腎小管上皮細(xì)胞碎片等損傷表現(xiàn)(圖1)。

圖1 各組小鼠腎組織HE染色比較病理損傷情況(HE ×400)

2.2各組小鼠腎功能指標(biāo)比較和病理損傷評分比較 通過大生化確認(rèn)各組小鼠腎臟腎功能指標(biāo)水平，與對照組比較，模型組小鼠Scr和BUN水平、病理損傷評分顯著升高；與模型組比較，試驗(yàn)組小鼠Scr和BUN水平、病理損傷評分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腎功能指標(biāo)比較和病理損傷評分比較Table 2 Comparison of renal function indexes and pathological damage scores of mice in each group

2.3各組小鼠外周血和腎臟組織ANG(1-7)表達(dá)水平比較 通過酶聯(lián)免疫吸附測定檢測各組小鼠外周血和腎臟組織ANG(1-7)表達(dá)水平，與對照組比較，模型組小鼠血清和腎臟組織ANG(1-7)表達(dá)水平降低；與模型組比較，試驗(yàn)組小鼠血清和腎臟組織ANG(1-7)表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠外周血和腎臟組織ANG(1-7)表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of ANG (1-7) expression levels in peripheral blood and kidney tissues of mice in each group

2.4各組小鼠腎臟組織LIGHT-HVEM mRNA表達(dá)水平比較 通過qPCR檢測各組小鼠腎臟組織LIGHT-HVEM mRNA表達(dá)水平，與對照組比較，模型組腎臟組織LIGHT-HVEM mRNA表達(dá)水平顯著升高；與模型組比較，試驗(yàn)組腎臟組織LIGHT-HVEM mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

表4 各組小鼠腎臟組織LIGHT-HVEM mRNA表達(dá)水平比較Table 4 Expression level of LIGHT-HVEM mRNA in kidney tissue of mice in each group

2.5各組小鼠腎臟組織LIGHT-HVEM 蛋白表達(dá)水平比較 通過Western blot檢測各組小鼠腎臟組織LIGHT-HVEM蛋白表達(dá)水平，與對照組比較，模型組腎臟組織LIGHT-HVEM 蛋白表達(dá)水平顯著升高；與模型組比較，試驗(yàn)組腎臟組織LIGHT-HVEM蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表5。

表5 各組小鼠腎臟組織LIGHT-HVEM 蛋白表達(dá)水平比較Table 5 Expression level of LIGHT-HVEM protein in kidney tissue of mice in each group

3 討 論

腎缺血再灌注損傷是由各種原因?qū)е碌哪I臟灌注不足所致，伴隨著一系列連貫的細(xì)胞事件發(fā)生，包括活性氧釋放、凋亡、壞死、炎癥細(xì)胞的浸潤和活性介質(zhì)的釋放，常導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷，臨床常見于各種類型休克、急性腎動(dòng)脈阻斷或腎臟移植等臨床治療過程[11-12]。組織損傷后會(huì)引發(fā)肌酐急速升高、尿少或無尿等癥狀，若得到積極治療并病情得到控制，一般臨床腎功能恢復(fù)較好[13-14]。

布托啡諾為阿片受體部分激動(dòng)劑，主要激動(dòng)κ1受體，臨床主要用于中度至重度疼痛(如腎或膽絞痛等)的止痛，或者術(shù)后、外傷、癌癥止痛[12]。通過大數(shù)據(jù)Meta分析證實(shí),布托啡諾對依托咪酯所致肌陣攣的預(yù)防作用[13]，也研究表明,布托啡諾聯(lián)合右美托咪定可有效治療成人燒傷患者的疼痛，但是布托啡諾聯(lián)合氟吡洛芬脂的臨床作用尚不清晰[15]。氟吡洛芬脂是一種非甾體抗炎藥，主要通過抑制前列腺素合成酶起作用，具有鎮(zhèn)痛、抗炎及解熱作用，對多組織器官具有抗炎保護(hù)作用[16]。氟比洛芬酯與復(fù)方雙氯芬酸鈉分別聯(lián)合間苯三酚可以有效治療腎絞痛[17],氟比洛芬酯聯(lián)合“復(fù)元方”縮短患者住院時(shí)間,減少患者術(shù)后并發(fā)癥、提高器官功能、減輕手術(shù)應(yīng)激、改善腫瘤患者預(yù)后及延長患者的生存時(shí)間，但是氟比洛芬酯聯(lián)合布托啡諾是否能夠發(fā)揮腎臟保護(hù)作用尚不清晰，因此本研究通過構(gòu)建小鼠肢體缺血再灌注模型，確定了缺血再灌注后小鼠出現(xiàn)了典型的腎損傷病理結(jié)果，氟比洛芬酯聯(lián)合布托啡諾預(yù)處理可以顯著降低小鼠腎臟組織損傷，降低炎性細(xì)胞浸潤，維持組織結(jié)構(gòu)完整，通過大生化分析Scr和BUN進(jìn)一步證實(shí)了這種腎臟保護(hù)作用及腎功能提升作用；同時(shí)氟比洛芬酯聯(lián)合布托啡諾預(yù)處理顯著提升了外周血和腎臟組織ANG(1-7)表達(dá)水平。ANG(1-7)具有舒張血管,調(diào)節(jié)血壓的作用，是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的一種內(nèi)源性七肽，在組織細(xì)胞中的抗炎和抗纖維化活性而具有組織保護(hù)作用[16]，對腎臟損傷具有積極作用，由此提示氟比洛芬酯聯(lián)合布托啡諾可能通過提升ANG(1-7)水平，降低了組織缺氧,降低組織氧化損傷，同時(shí)降低炎癥反應(yīng)，降低組織炎性損傷，進(jìn)而發(fā)揮腎組織的保護(hù)作用。

Light/HEVM信號通路編碼的蛋白質(zhì)在激活炎癥和抑制性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用[18]，Light/HEVM可以受到ANG(1-7)調(diào)控參與先兆子癇小鼠模型的病理生理學(xué)的炎癥過程，但是否參與到缺血再灌注腎損傷中尚不清晰。本研究通過qPCR和Western blot證實(shí)氟比洛芬酯聯(lián)合布托啡諾使用會(huì)抑制小鼠Light和HEVM信號通路蛋白表達(dá)，提示出對Light/HEVM信號通路的抑制作用，降低炎性通路的炎性反應(yīng)，可以抑制炎性細(xì)胞的浸潤，降低病理損傷，提示氟比洛芬酯聯(lián)合布托啡諾可能通過ANG(1-7)提高組織抗炎性損傷，抑制炎性通路Light/HEVM的激活，降低了炎癥反應(yīng)中淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞從外周向組織引流，進(jìn)而降低組織纖維化和組織炎性損傷，維持腎臟組織的正常組織和結(jié)構(gòu)功能，發(fā)揮腎保護(hù)作用。

綜上所述，氟比洛芬酯聯(lián)合布托啡諾可能通過ANG(1-7)提高組織抗炎性損傷，其機(jī)制可能與抑制炎性通路Light/HEVM的激活有關(guān)?？梢赃M(jìn)一步通過體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)探究氟比洛芬酯聯(lián)合布托啡諾對炎癥因子的調(diào)控作用，為臨床治療提供分子依據(jù)。