辣椒泛素結(jié)合酶變體類似蛋白基因克隆及其與氮吸收利用的相關性分析

王春萍 張世才 李怡斐 楊小苗 段敏杰 黃啟中 黃任中 吳紅

（1重慶市農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所逆境農(nóng)業(yè)研究重慶市市級重點實驗室， 重慶 401329；2重慶市農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所， 重慶 401329）

泛素修飾并降解蛋白質(zhì)是真核生物調(diào)節(jié)細胞活動與功能的重要途徑，在植物細胞生理和對環(huán)境條件的反應中具有廣泛作用［1］。泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)主要由泛素、泛素激活酶（Ub-activating enzyme， UBA 或E1）、泛 素 結(jié) 合 酶（Ub-conjugating enzyme， UBC 或E2）、泛素連接酶（Ub ligase， E3）、去泛素化酶和靶蛋白組成［2］。E2在E1與E3之間起協(xié)調(diào)作用，能將E1激活的泛素分子轉(zhuǎn)移到底物或E3［3-4］。所有E2都含有一個由150～200個氨基酸組成的含有一個半胱氨酸活性位點的UBC結(jié)構(gòu)域。UEVs（ubiquitin E2 variants）在氨基酸序列和結(jié)構(gòu)上與E2相似，但UBC結(jié)構(gòu)域缺乏半胱氨酸活性位點，不能與泛素直接結(jié)合，因此其功能與E2不同［5］。已有研究證明UEVS可通過與E2形成復合物催化底物泛素化［6-7］。

關于酵母、動物和人類UEVs的功能已有較多報道，但該蛋白家族在植物中的功能最早只在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有較深入報道，近年來在水稻（Oryza sativa）、番茄（Solanum lycopersicum）、短柄草（Brachypodium distachyon）等植物中也開展了一些研究。如在擬南芥中，COP10在植物的光形態(tài)建成中起著重要作用［5-7］，AtUEV1D能夠增強DNA損傷的耐受性［8］；番茄Suv能與Fin3/SI-Ubc13-2協(xié)同調(diào)控煙草對丁香假單胞菌的免疫［9］；在短柄草中，BdUev1B和BdUev1C參與DNA損傷反應，BdUev1A可能參與亞細胞結(jié)構(gòu)定位等生理活動［10］；在水稻中鑒定出4個參與DNA損傷修復的OsUEV1［11］，其中OsUEV1B參與磷的代謝途徑［12］?？梢?，目前關于UEVs功能的研究較多集中于DNA損傷修復方面，其在非生物逆境方面的作用鮮有報道。

基于重慶市農(nóng)業(yè)科學院辣椒研究團隊前期獲得的低氮脅迫下辣椒差異轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［13］，本研究克隆了辣椒（Capsicum annuum）UEVs類似蛋白基因，命名為CaUev1DL，構(gòu)建該基因過表達載體，轉(zhuǎn)化至煙草（Nicotiana tabacum）后進一步對T2代轉(zhuǎn)基因煙草進行低氮脅迫后的表型和生理分析，推測該基因在耐低氮中的作用，以期為其功能研究和在基因工程中的運用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

基因克隆所用材料為重慶市農(nóng)業(yè)科學院辣椒研究團隊保存的簇生朝天椒自交系750-1。遺傳轉(zhuǎn)化材料為本氏煙草。

1.2 CaUev1D-L基因的克隆和生物信息分析

根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)注釋到的辣椒ubiquitinconjugating enzyme E2 variant 1D-like基因，從NCBI數(shù)據(jù)庫（https：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕）中搜索其全基因序列（LOC107877293），設計該基因全長PCR擴增引物CaUev1D-L-F （5′-ATGACTCTCGATTCAGGA-3′）和CaUev1D-L-R （5′-TCACCCATTTTCTTCAAC-3′），以辣椒自交系750-1的葉片cDNA為模板進行PCR擴增。總反應體系20 μL：DNA模板1 μL、2×TaqMaster Mix （上海Novoprotein） 10 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 7 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。將擴增出的相應基因片段利用同源重組的方式無縫連接到改造后的表達載體pBI121上（在原pBI121上的T-DNA插入?yún)^(qū)域增加35S∶GUS∶NPTII融合基因，用于卡納霉素篩選和GUS染色鑒定）。連接產(chǎn)物通過熱激發(fā)轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，并通過PCR菌落鑒定，篩選陽性克隆子進行測序。

利用Protparam （http：∕∕web.expasy.org∕protparam） 在線分析基因編碼蛋白氨基酸的理化性質(zhì)，利用SOPMA （https：∕∕www.expasy.org∕proteomics_sopma） 和Phyre2 （http：∕∕www.sbg.bio.ic.ac.uk∕phyre2）進行蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)預測。

1.3 CaUev1D-L基因煙草轉(zhuǎn)化

提取陽性克隆子菌落的表達載體pBI121質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)。將篩選出的農(nóng)桿菌EHA105菌株浸染煙草無菌苗葉片（約1 cm2）傷口，經(jīng)共培養(yǎng)、抗性篩選、生根和移栽等過程獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)2次繁殖后獲得T2代種子。

1.4 轉(zhuǎn)基因煙草T2代植株低氮處理

挑選飽滿一致且無病蟲害的煙草種子，均勻放入盛有濾紙的培養(yǎng)皿中，加入蒸餾水，保持培養(yǎng)皿中濾紙濕潤，置于人工氣候箱，25～28 ℃黑暗條件下發(fā)芽。將發(fā)芽的種子用蒸餾水清洗后分單株移到裝有基質(zhì)的穴盤中培養(yǎng)，基質(zhì)配比椰糠∶珍珠巖∶蛭石體積比為5∶3∶2，用營養(yǎng)液定量澆灌，待植株長至兩葉一心時進行低氮處理，營養(yǎng)液配方參照辣椒低氮處理方法［14］。各處理營養(yǎng)液pH值為6.2～6.4，每5 d更換一次營養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度為25～28 ℃，每天光照12 h，光照強度為200 μmol·m-2·s-1，空氣相對濕度為70%～80%。每個處理設3次重復，每個重復10株植株。

1.5 低氮脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植株CaUev1D-L基因的表達分析

低氮處理28 d后分別取對照和處理材料的功能葉，液氮處理后于-80 ℃保存，或直接提取RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Bio-Rad）對RNA進行去基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。用Bio-Rad CFX96 Real-Time System熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR，反應體系20 μL：iQ SYBR Green Supermix （美國Bio-Rad） 10 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板1.0 μL，ddH2O補足體積。每個樣品重復3次。內(nèi)參基因為煙草Tubulin基因（LOC107800889）。

1.6 低氮脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植株形態(tài)和植株干物質(zhì)積累分析

處理28 d后，分別測定每棵植株的株高、莖粗、葉片數(shù)、葉綠素相對含量（soil and plant analyzer development，SPAD）值、根系形態(tài)、莖葉干重、根干重，并根據(jù)以下公式計算單株干重、根冠比：

2 結(jié)果與分析

2.1 CaUev1D-L基因的克隆及序列分析

根據(jù)前期辣椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)注釋到的低氮脅迫下差異表達基因（ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1D-like）為參考序列設計引物，以辣椒材料750-1的葉片cDNA為模板對該基因進行PCR擴增，獲得全長為402 bp的編碼序列，命名為CaUev1D-L（圖1）。該基因編碼133個氨基酸，相對分子質(zhì)量為15.09 kDa，等電點為5.35。利用NCBI的CD search（Conserved Domain Search Service）對CaUev1D-L蛋白的結(jié)構(gòu)功能域進行預測，發(fā)現(xiàn)其18～102氨基酸區(qū)間為UBC結(jié)構(gòu)域。

圖1 CaUev1D-L基因的核苷酸序列和對應的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence of CaUev1D-L

2.2 CaUev1D-L蛋白的結(jié)構(gòu)特征分析

利用SOPMH在線預測CaUev1D-L蛋白的二級結(jié)構(gòu)，其中無規(guī)則卷曲所占比例最多（43.61%），其次是延展鏈（29.32%），α螺旋（19.55%），β轉(zhuǎn)角（7.52%）。利用Phyre2進一步預測H蛋白的三級結(jié)構(gòu)，參照模板為c2hlwA，一致性和覆蓋率分別為100%和96%，從結(jié)構(gòu)組成上看，以無規(guī)則卷曲為主，與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果一致（圖2）。

圖2 CaUev1D-L蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測模型Fig.2 Tertiary structure prediction model of CaUev1D-L

2.3 CaUev1D-L蛋白的多序列比對和系統(tǒng)進化分析

將CaUev1D-L的氨基酸序列與辣椒（XP_016546430.1）、煙草（XP_016434792.1）、番茄（NP_001306880.1）和馬鈴薯（XP_006339155.1）等4種茄科作物的Uev1D（ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1D）氨基酸進行比對。結(jié)果表明，在氨基酸序列末端CaUev1D-L比4個Uev1D少14個氨基酸，在UBC結(jié)構(gòu)域與4個Uev1D有6個氨基酸的差異，而4個Uev1D的序列十分保守（圖3）。進一步利用MEGH7.0軟件中的Neighbor-joining方法分析CaUev1D-L蛋白在不同植物物種之間的進化關系。結(jié)果顯示，CaUev1D-L蛋白與辣椒的幾個同源蛋白同處于同一進化分支上，與其他物種相距較遠，與辣椒Uev1D不在同一進化分支上（圖4）。

圖3 CaUev1D-L與部分茄科作物Uev1D氨基酸序列比對結(jié)果Fig.3 Amino acid sequence comparison between CaUev1D-L and Uev1D of some Solanaceae crops

圖4 CaUev1D-L氨基酸序列的系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of amino acid sequence of CaUev1D-L

2.4 CaUev1D-L基因功能分析

2.4.1 不同氮素水平下CaUev1D-L基因的表達特點 分別對正常氮水平和20%氮水平下CaUev1D-L在轉(zhuǎn)基因煙草和相應野生型煙草葉片的表達情況進行分析。結(jié)果表明，在兩種氮水平下CaUev1D-L在野生型植株的表達量都非常低，而在轉(zhuǎn)基因植株的表達量顯著提高，說明目標基因在轉(zhuǎn)基因植株中能夠穩(wěn)定高表達（圖5）。

圖5 不同氮素水平下CaUev1D-L表達情況Fig.5 Expression of CaUev1D-L under different nitrogen levels

2.4.2 不同氮素水平下轉(zhuǎn)CaUev1D-L基因煙草植株形態(tài)特點 在正常施氮素水平下，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)CaUev1D-L基因植株的株高、莖粗、葉片數(shù)、SPAD值和根長等5個形態(tài)指標值均與野生型植株差異不顯著（圖6）。在低氮脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草植株的根長顯著大于野生型植株，其余4個形態(tài)指標在兩植株之間差異不顯著（圖7）。

圖6 正常氮水平下煙草植株的形態(tài)特點Fig.6 Morphological characteristics of tobacco plants under normal nitrogen level

圖7 低氮水平下煙草植株的形態(tài)特點Fig.7 Morphological characteristics of tobacco plants under low nitrogen level

2.4.3 不同氮素水平下轉(zhuǎn)CaUev1D-L基因煙草干物質(zhì)積累特點 在正常氮素水平下，轉(zhuǎn)CaUev1D-L基因煙草植株莖葉干重顯著小于野生型煙草植株（圖8）。但在低氮水平下，轉(zhuǎn)基因植株的莖葉干重和根干重顯著大于野生型植株（圖9），說明在低氮水平下CaUev1D-L的過量表達能夠促進氮的吸收利用。

圖8 正常氮水平下轉(zhuǎn)基因煙草植株干物質(zhì)積累特點Fig.8 Dry matter accumulation characteristics of transgenic tobacco plants under normal nitrogen level

圖9 低氮水平下轉(zhuǎn)基因煙草植株干物質(zhì)積累特點Fig.9 Dry matter accumulation characteristics of transgenic tobacco plants under low nitrogen level

3 討論

不同的泛素鏈具有不同的拓撲結(jié)構(gòu)和功能，如Lys48-泛素鏈導致蛋白質(zhì)降解，Lys63-泛素鏈通常參與信號轉(zhuǎn)導［15-16］。Ubc13基因參與了多種生命活動，如Ubc13在擬南芥的DNA損傷反應［8］、頂端優(yōu)勢［17］、鐵代謝［18］、生長素信號轉(zhuǎn)導［19］、低溫脅迫反應［20］以及免疫反應［21］等過程都發(fā)揮著重要作用。鑒于在植物中發(fā)現(xiàn)了多個UEV基因，且這些基因的表達水平和功能都存在差異，有學者推測，在Ubc13-Uev復合體中真正起調(diào)節(jié)作用的是UEVs蛋白。UEVs蛋白可能參與多種調(diào)節(jié)過程［10-11，22］，UEVs在氮素代謝途徑中的研究還未見報道。重慶市農(nóng)業(yè)科學院辣椒研究團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，Uev1D類似蛋白基因（LOC107877293）能夠響應辣椒苗期低氮脅迫反應［13］，因此本研究克隆了該基因，命名為CaUev1D-L，并對其功能進行了研究。

本研究結(jié)果表明，在正常氮水平下，過表達辣椒CaUev1D-L導致煙草的干物質(zhì)積累顯著下降，而在低氮水平下，轉(zhuǎn)基因煙草的干物質(zhì)量積累顯著增加，初步判斷CaUev1D-L參與了氮代謝調(diào)控途徑，且在低氮脅迫下促進了氮素的吸收利用。氮代謝途徑可分為三個過程：吸收、同化和再分配［23-24］。氮的再分配過程要經(jīng)歷蛋白質(zhì)的降解，泛素化途徑是蛋白質(zhì)降解的主要途徑，因此，蛋白質(zhì)的泛素化與氮代謝途徑具有緊密聯(lián)系。Peng等［25］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個低氮適應性調(diào)節(jié)蛋白NLA，該蛋白屬于RING型E3連接酶［26］。與野生型植株相比，nla基因突變體植株表現(xiàn)出對低氮十分敏感且早衰，這是由于nla基因突變改變了NLA蛋白的亞細胞定位，導致其不能與泛素結(jié)合酶8（AtUBC8）結(jié)合，從而影響了其正常行使功能。后續(xù)研究表明，nla基因突變體早衰是由于植物體中磷（Pi）過量積累所致，且nla基因突變體表型特征與PHO2突變體表型相同，而PHO2是一種E2結(jié)合酶［27-30］，說明氮代謝與磷代謝具有密切相關性，同時反映了E2與氮代謝的相關性。本研究通過超表達方法證明CaUev1D-L參與了氮代謝途徑，再次表明了E2家族成員與氮代謝的相關性。但CaUev1D-L參與氮代謝的機理尚不清楚，后期還需對其作用機理和調(diào)控網(wǎng)絡進行深入研究。

另外，本研究對比了辣椒、煙草、番茄和馬鈴薯等品種的Uev1D，其UBC結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列完全一致，只在蛋白的氨基酸末端有較低的多態(tài)性。然而CaUev1D-L在上游、UBC結(jié)構(gòu)域以及末端與Uev1D都存在差異，且比Uev1D末端少了14個氨基酸差異，由此推測CaUev1D-L與Uev1D的功能可能存在較大差異。

4 結(jié)論

本研究從辣椒中克隆了CaUev1D-L基因，該基因編碼的蛋白與茄科作物的Uev1D蛋白氨基酸序列末端和UBC結(jié)構(gòu)域都存在差異，與辣椒的Uev1D蛋白不在同一進化分支，推測CaUev1D-L與Uev1D的功能可能存在差異。轉(zhuǎn)CaUev1D-L基因煙草植株在正常氮水平下莖葉干重顯著小于野生型植株，在低氮水平下莖葉干重和根干重顯著大于野生型植株，初步判斷該基因參與了氮代謝調(diào)節(jié)途徑，且在低氮水平下能夠促進植物對氮的吸收利用。