基于凝血酶誘導(dǎo)自噬探討化瘀解毒法對(duì)缺血性中風(fēng)（瘀毒互結(jié)證）大鼠的影響

馬若夢(mèng)，鄧奕輝，彭珣，李鈺佳，陽(yáng)晶晶，李定祥?

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

全球范圍內(nèi)，卒中作為僅次于缺血性心臟病的第二大三級(jí)死亡原因［1］，其特征是急性腦部血液循環(huán)障礙，導(dǎo)致長(zhǎng)期殘疾和死亡，該病嚴(yán)重影響幸存者的生活質(zhì)量［2］。其中缺血性卒中約占所有卒中的87%［3］。中醫(yī)稱該病為“中風(fēng)”病，病機(jī)不外乎風(fēng)、火、痰、瘀、虛五端。本課題組以傳統(tǒng)中醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，結(jié)合前期研究基礎(chǔ)和各類成果，提出了本病新的病機(jī)理論，可概括為“瘀血阻滯，毒損腦絡(luò)”［4?8］，確立以化瘀解毒為治療大法［9］，并創(chuàng)立化瘀解毒方。

凝血酶是一種凝血因子，通過介導(dǎo)纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，在止血中起核心作用。凝血酶生成水平和活性在急性缺血性腦卒中與腦梗死嚴(yán)重程度明顯相關(guān)［10］。自噬在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，并參與了許多人類疾病的過程［11?12］。除了營(yíng)養(yǎng)因子缺乏、生長(zhǎng)因子撤離、高溫、缺氧及激素刺激可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生之外［13］，凝血酶也可誘導(dǎo)腦內(nèi)自噬的發(fā)生，從而加重腦損傷［14?16］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶與自噬指標(biāo)LC3Ⅱ/Ⅰ呈高度相關(guān)，在7 個(gè)不同缺血時(shí)相的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律相似。因此，本文從凝血酶誘導(dǎo)自噬從而介導(dǎo)腦損傷的角度，探討化瘀解毒法對(duì)缺血性中風(fēng)（瘀毒互結(jié)證）的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF 級(jí)雄性大鼠116 只，體質(zhì)量220～240 g，購(gòu)買于湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2019－0004。于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)：SYXK（湘）2015－0003，飼養(yǎng)及手術(shù)環(huán)境溫度控制在20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%。

1.2 藥物及制備

化瘀解毒方組方：黃芪40 g，川芎15 g，僵蠶10 g，地龍10 g，黃連5 g，黃芩5 g，梔子5 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診部提供。采用水浸泡中藥飲片40 min 左右，先武火煮沸，再文火熬制30 min，取藥渣按前法再煎煮1 次，兩次所得藥液混勻、過濾，濃縮為2 g/mL，于4 ℃保存。阿加曲班單水合物（阿拉丁公司，批號(hào)：A151030－100 mg）作為陽(yáng)性對(duì)照組，用DMSO 將阿曲班單水合物溶解并按稀釋3 倍標(biāo)準(zhǔn)，加入β－CD生理鹽水稀釋。

1.3 試劑與儀器

Anti－Thrombin 抗體（美國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：Ab92621）；LC3B 抗體（美國(guó)Proteintech 公司，批號(hào)：14600－1－AP）；環(huán)氧丙烷（上海邁瑞爾化學(xué)公司，貨號(hào)：M25514）；鋨酸（TED PELLA INC，貨號(hào)：18456）；戊二醛（雷根，貨號(hào)：DF0156）；透射電子顯微鏡（日本電子，批號(hào)：JEM1400）；搖床（其林貝爾，貨號(hào)：TS－92）。

1.4 分組和給藥

依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將116 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（SHAM 組），模型組（瘀毒互結(jié)缺血性中風(fēng)病證結(jié)合組，簡(jiǎn)稱IS－YD 組），化瘀解毒方組（HJF 組），阿加曲班組（ARG組）。按不同的缺血時(shí)相再分為IS－YD 12 h組、IS－YD 24 h組、HJF 12 h組、HJF 24 h組、ARG 12 h組、ARG 24 h 組，共7 組，其中假手術(shù)組8 只大鼠，其余每組各18只大鼠。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，于第4天開始給藥，HJF 組以11.33 g/（kg·d）劑量灌胃化瘀解毒方，ARG 組以11.16 mg/（kg·d）劑量灌胃阿加曲班單水合物，均為預(yù)防性給藥，每天1 次，連續(xù)7 d。假手術(shù)組和模型組分別灌服等量的生理鹽水。除假手術(shù)組外，其余各組使用角叉菜膠聯(lián)合干酵母混懸液注射的方法，制備瘀毒互結(jié)模型［17］。于第4 天灌胃中藥，腹腔注射角叉菜膠50 mg/kg，每天1 次，連續(xù)3 d，第4 天，皮下注射干酵母混懸液10 mL/kg。末次灌胃后24 h進(jìn)行造模，造模前12 h大鼠禁食、不禁水。

1.5 缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)證（IS－YD）模型制備

參考文獻(xiàn)［18］提出的可逆性大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）線栓法改良制作。選取體質(zhì)量220～240 g 的雄性SD大鼠，術(shù)前用10%水合氯醛按照0.35 mL/100 g劑量腹腔注射進(jìn)行麻醉。于頸部正中稍右側(cè)作切口，鈍性分離皮下組織，在靠近氣管肌旁，用黑色縫合線分離出與迷走神經(jīng)并行的右頸總動(dòng)脈（CCA），分離頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）與頸外動(dòng)脈（ECA），于頸總動(dòng)脈近心端插入頭端用石蠟包被的單絲尼龍魚線，長(zhǎng)度自CCA 分叉處約18～20 mm。假手術(shù)組除了不插入栓線，其余操作同模型組。術(shù)中需記錄插入栓線的時(shí)間，以此來確定缺血時(shí)相和取材時(shí)間。術(shù)后將大鼠置于飼養(yǎng)籠里，自由進(jìn)食和飲水。

1.6 神經(jīng)功能缺失評(píng)分

待動(dòng)物清醒后，參照Z(yǔ)EA LONGA 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分（NIHSS評(píng)分）。0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損；1 分：不能完全伸展左側(cè)前爪；2 分：向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3 分：向左側(cè)傾倒；4 分：不能自發(fā)行走且意識(shí)水平低下。1～3分為造模成功，否則棄之不用。

1.7 標(biāo)本采集與處理

1.7.1 取出完整腦組織

按組別選取20 只大鼠麻醉后，冰盒上快速斷頭，取出完整的腦組織，于?20 ℃速凍30 min，備用進(jìn)行TTC 染色。再選取38 只大鼠進(jìn)行麻醉，斷頭去腦，取出完整腦組織，置于多聚甲醛溶液中固定，備用進(jìn)行HE染色。

1.7.2 分離出皮質(zhì)、海馬

將術(shù)后蘇醒的38 只大鼠逐個(gè)進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分并作記錄，分別于缺血后12、24 h用水合氯醛麻醉大鼠，快速斷頭取腦分離出大腦皮質(zhì)和海馬，存放在?80 ℃冰箱里。用藥組于最后一次灌胃24 h 后處死大鼠，斷頭去腦，同樣分離出大腦皮質(zhì)和海馬，備用進(jìn)行Western blot 檢測(cè)。按組別選取20 只進(jìn)行麻醉處死后斷頭取腦，分離出皮質(zhì)和海馬，置于電鏡固定液中避光保存，等待透射電鏡觀察處理。

1.8 指標(biāo)檢測(cè)

1.8.1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

待動(dòng)物清醒后，參照Z(yǔ)EA LONGA 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，于各組隨機(jī)抓取5只大鼠做神經(jīng)功能缺失評(píng)分。

1.8.2 TTC染色觀察大鼠腦梗死體積占比

于?20 ℃冰箱中取冰凍鼠腦，置于腦槽為2 mm的腦切片模具中，在額極與枕極處放置兩片刀片以固定大腦，從視交叉處額極到枕極處連續(xù)切5 片，厚度均為2 mm，將切片轉(zhuǎn)移至2% TTC 溶液中染色，染色后梗死區(qū)變?yōu)榘咨?，非梗死區(qū)呈現(xiàn)紅色，為使每片腦片染色均勻，37 ℃水浴鍋中孵育15 min，且每5 min翻面，后于多聚甲醛溶液中固定，24 h 后拍照，拍照注意采用統(tǒng)一角度和高度，盡量保證統(tǒng)一光線。最后使用Image Pro Plus6.0 軟件分析計(jì)算腦梗死體積占比。

梗死體積占比（%）=梗死體積/整腦體積 × 100%

1.8.3 蘇木素－伊紅（HE）染色法觀察缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬病理形態(tài)改變

將完整腦組織取出之后，放入4 %多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切成超薄片，脫蠟，染色，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察并采集圖像。

1.8.4 Western blot 法檢測(cè)缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬凝血酶、LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)

分別剪取50 mg 的皮質(zhì)和海馬組織，加入500 μL裂解液（RIPA∶蛋白酶抑制劑=50∶1），于4 ℃預(yù)冷的生物樣品均質(zhì)量?jī)x中反復(fù)研磨充分裂解，4 ℃，12 000 r/min離心10 min；得到上清液。取100 μL 蛋白原液，加入25 μL 5 × loading buffer 混勻，沸水煮15 min。點(diǎn)樣、電泳、轉(zhuǎn)膜封閉后進(jìn)行孵育抗體，LC3B 兔抗（1∶2000）、Thrombin 兔抗（1∶1 000）、β－actin 鼠抗（1∶5 000），將膜與一抗一起孵育，4 ℃過夜，HRP 標(biāo)記的二抗（1∶8 000）次日孵育。

1.8.5 透射電子顯微鏡觀察缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬自噬超微結(jié)構(gòu)

按照固定、脫水、浸透、包埋、切片、染色、拍照的順序進(jìn)行操作。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，方差齊者，組間兩兩比較采用LSD 或SNK 法，方差不齊者，則選用Games－Howell 方法兩兩比較；若不符合正態(tài)性分布，則采用多樣本秩和檢驗(yàn)，即Kruskal－Wallis單因素ANOVA 分析。P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

在缺血后12、24 h，與SHAM 組比較，IS－YD 組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，表現(xiàn)為左側(cè)前爪內(nèi)收、提尾時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，向左側(cè)傾倒等，神經(jīng)功能缺失評(píng)分升高（P＜ 0.01）；與IS－YD組相較，ARG組和HJF組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分顯著降低（P＜ 0.01）。說明化瘀解毒方、阿加曲班可以減輕IS－YD大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠缺血后12、24 h神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s）

表1 各組大鼠缺血后12、24 h神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s）

注：與SHAM組比較，**P ＜ 0.01；與IS－YD 12 h組比較，#P ＜ 0.05；與IS－YD 24 h組比較，&P ＜ 0.05。

2.2 各組大鼠腦梗死體積比較

在缺血后12 h，與SHAM 組比較，IS－YD 組、HJF組、ARG 組的大鼠腦梗死體積占比均明顯增高（P＜ 0.01）；與IS－YD組相較，ARG組和HJF組大鼠腦梗死體積占比顯著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。在缺血后24 h，與SHAM 組比較，IS－YD 組、HJF組、ARG 組的大鼠腦梗死體積占比均明顯增高（P＜ 0.01）。給藥后，與模型組比較，ARG 組和HJF 組大鼠腦梗死體積占比顯著降低（P＜ 0.05）。說明化瘀解毒方、阿加曲班可以降低IS－YD大鼠腦梗死體積。結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦梗死體積占比比較

圖2 各組大鼠TTC染色結(jié)果比較

2.3 各組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)和海馬病理形態(tài)學(xué)比較

2.3.1 缺血側(cè)皮質(zhì)病理形態(tài)比較

SHAM 組大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列密集，胞漿豐富，染色均勻呈粉紅色，細(xì)胞核居中大且圓，核仁明顯，間質(zhì)正常；與SHAM 組比較，IS－YD 12 h、ISYD 24 h 組腦組織缺血側(cè)的大腦皮質(zhì)區(qū)形態(tài)被明顯破壞，可見大片神經(jīng)元壞死，排列稀疏、紊亂，細(xì)胞核皺縮或碎裂，胞漿濃縮染色加深，核仁不清，間質(zhì)水腫疏松，缺血區(qū)呈空泡樣變化。與模型組比較，HJF組和ARG 組以上部位病理形態(tài)損傷輕微，神經(jīng)元損傷程度降低，細(xì)胞染色較均勻，形態(tài)規(guī)整，排列較為整齊致密，空泡樣改變也較模型組均減輕。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)的HE染色圖（×200）

2.3.2 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)病理形態(tài)的比較

SHAM 組大腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，胞體形態(tài)規(guī)則，神經(jīng)細(xì)胞呈圓形或錐形，胞漿豐富，胞質(zhì)染色均勻，細(xì)胞核著色均勻呈藍(lán)紫色，核仁清晰。與SHAM組比較，IS－YD 12 h、IS－YD 24 h 組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂、部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞核固縮且深染，神經(jīng)元損傷多集中在CA2區(qū)；相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的HJF和ARG 組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷相對(duì)輕微，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)異常、細(xì)胞核固縮或溶解碎裂的數(shù)量有所減少。結(jié)果見圖4。

圖4 各組大鼠缺血側(cè)大腦海馬區(qū)的HE染色圖（× 200）

2.4 各組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)和海馬凝血酶、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)比較

2.4.1 缺血側(cè)皮質(zhì)、海馬區(qū)凝血酶表達(dá)比較

在缺血后12 h，與SHAM 組比較，IS－YD 組的凝血酶蛋白表達(dá)均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。與IS－YD 組比較，ARG 組兩個(gè)腦區(qū)的凝血酶蛋白表達(dá)顯著下降（P＜ 0.01），HJF 組皮質(zhì)區(qū)（P＜ 0.01）和海馬區(qū)（P＜ 0.05）凝血酶蛋白表達(dá)水平也同樣下降；在缺血后24 h，與SHAM 組比較，ISYD 組的凝血酶蛋白表達(dá)均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。與IS－YD 組相較，ARG 組兩個(gè)腦區(qū)的凝血酶蛋白表達(dá)顯著下降（P＜ 0.01），而HJF組皮質(zhì)區(qū)（P＜ 0.05）和海馬區(qū)（P＜ 0.01）凝血酶蛋白表達(dá)水平也降低。說明化瘀解毒方、阿加曲班可以抑制皮質(zhì)區(qū)凝血酶、LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)。結(jié)果見圖5～圖7。

圖5 兩個(gè)缺血時(shí)間點(diǎn)各組大腦皮質(zhì)區(qū)凝血酶蛋白表達(dá)水平比較

圖6 兩個(gè)缺血時(shí)間點(diǎn)各組大腦海馬區(qū)凝血酶蛋白表達(dá)水平比較

圖7 兩個(gè)缺血時(shí)間點(diǎn)、兩個(gè)腦區(qū)凝血酶的表達(dá)水平

2.4.2 缺血側(cè)皮質(zhì)、海馬區(qū)LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)比較

在缺血后12 h，與SHAM 組比較，IS－YD 組的大鼠大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)的LC3Ⅱ/Ⅰ比值表達(dá)均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。與IS－YD 組比較，ARG 組兩個(gè)腦區(qū)的LC3Ⅱ/Ⅰ比值表達(dá)顯著下降（P＜ 0.01），HJF 組皮質(zhì)區(qū)（P＜ 0.05）和海馬區(qū)（P＜ 0.01）LC3Ⅱ/Ⅰ比值表達(dá)水平也同樣下降；在缺血后24 h，與SHAM 組比較的結(jié)果同上。與IS－YD 組相較，HJF 組和ARG 組兩個(gè)腦區(qū)的LC3Ⅱ/Ⅰ比值表達(dá)顯著下降（P ＜0.01）。說明化瘀解毒方、阿加曲班可以抑制海馬區(qū)凝血酶、LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)。結(jié)果見圖8～圖10。

圖8 兩個(gè)缺血時(shí)間點(diǎn)、兩個(gè)腦區(qū)LC3Ⅱ/Ⅰ比值的表達(dá)水平

圖9 兩個(gè)缺血時(shí)間點(diǎn)各組大腦皮質(zhì)區(qū)LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平比較

圖10 兩個(gè)缺血時(shí)間點(diǎn)各組大腦海馬區(qū)LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平比較

2.5 各組大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)自噬超微結(jié)構(gòu)比較

SHAM 組皮質(zhì)和海馬區(qū)可見少量的自噬小體，未見明顯的自噬溶酶體及吞噬泡；IS－YD 12 h 組、ISYD 24 h 組發(fā)生自噬較嚴(yán)重，可見明顯的自噬小體、自噬溶酶體。與模型組比較，HJF組和 ARG組可見自噬小體、自噬溶酶體顯著減少，并未見吞噬泡。說明化瘀解毒方、阿加曲班可以抑制模型大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)、海馬區(qū)自噬的發(fā)生。結(jié)果見圖11、圖12。

圖11 各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)的自噬超微結(jié)構(gòu)（× 6 000）

圖12 各組大鼠缺血側(cè)大腦海馬區(qū)的自噬超微結(jié)構(gòu)（× 6 000）

3 討論

凝血酶在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活過程中，由不具備活性的前體凝血酶原裂解形成［19］，主要發(fā)揮止血功能［20］。研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶原的表達(dá)存在于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中［21?22］。生理水平的凝血酶影響神經(jīng)的發(fā)育和保護(hù)［23］，促進(jìn)腦組織活力，且對(duì)興奮性毒性有害因子有保護(hù)作用［24］。而高劑量的凝血酶則具有神經(jīng)毒性，能破壞血管，引發(fā)氧化應(yīng)激，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［25］。高水平的凝血酶活性不僅是有害的，且缺血半球的凝血酶活性和梗塞體積之間具備顯著相關(guān)性［10］。

自噬是大多數(shù)真核生物在進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞行為，是自噬溶酶體系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)異物、受損或老化細(xì)胞器的吞噬降解過程。通過及時(shí)清除受損細(xì)胞器，對(duì)維持細(xì)胞的自穩(wěn)狀態(tài)發(fā)揮重要作用。有證據(jù)表明［26?28］，自噬可參與腦卒中的發(fā)生和發(fā)展，在缺血性腦損傷期間被激活并且參與神經(jīng)元死亡的調(diào)節(jié)。然而自噬的作用復(fù)雜，其活性的增強(qiáng)在腦缺血過程中起有益作用還是有害作用尚未有定論且存在爭(zhēng)議，研究顯示，自噬在腦缺血發(fā)生和發(fā)展過程中，起到的是“雙刃劍”的作用［29］。適當(dāng)?shù)淖允煽梢越到饧?xì)胞自身內(nèi)容物供周圍細(xì)胞利用，挽救由于缺血瀕臨死亡的細(xì)胞，但另一方面，過度的自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。

營(yíng)養(yǎng)因子缺乏、高溫、缺氧、激素刺激，可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［13］，凝血酶也可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生［13?14，30］。HU等［14］研究發(fā)現(xiàn)，人耳內(nèi)注射凝血酶能特異性地提高Beclin 1 和LC3 這兩種自噬標(biāo)記物在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，并促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)而非神經(jīng)元內(nèi)自噬空泡的形成。在同側(cè)基底節(jié)中，耳內(nèi)注射凝血酶可增加LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化、組織蛋白酶D 水平和自噬空泡的形成。MU 等［31］采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，腦出血患者血漿凝血酶－抗凝血酶（TAT）復(fù)合物濃度與腦出血嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且血腫周圍區(qū)域的神經(jīng)元存在自噬，凝血酶可能參與了這些神經(jīng)元自噬的激活。亦有研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的炎癥因子分泌、氧化應(yīng)激和自噬均可被凝血酶加重，而SPRED2 基因敲除可抑制凝血酶。證明凝血酶通過激活SPRED2 介導(dǎo)的自噬作用加重星形膠質(zhì)細(xì)胞的缺血再灌注損傷［32］。提示凝血酶可激活腦內(nèi)自噬，加重腦損傷。

本課題組前期探討了缺血性腦卒中進(jìn)展過程中凝血酶、自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ在缺血2、4、8、12、24、48、72 h 7 個(gè)缺血時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中后凝血酶與自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)呈正相關(guān)，皮質(zhì)凝血酶與 LC3Ⅱ/Ⅰ的密切程度為56.7%，海馬二者的密切程度為 53.3%。且均在缺血12、24 h 達(dá)到高值，由此證明了凝血酶、自噬、缺氧缺血性腦損傷的變化三者之間均具有時(shí)間依賴性，同時(shí)為進(jìn)一步研究治療腦梗死篩選了最佳藥物反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，可用于指導(dǎo)下一階段中藥復(fù)方的干預(yù)。且高水平的凝血酶活性、過度發(fā)生的自噬會(huì)促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能缺損，加重腦梗死體積占比。

本實(shí)驗(yàn)采用阿加曲班作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，探討了化瘀解毒方對(duì)IS－YD大鼠的干預(yù)作用。結(jié)果表明，化瘀解毒方可顯著降低模型大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積占比，改善缺血側(cè)腦區(qū)病理形態(tài)學(xué)變化。此外，化瘀解毒方可抑制大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的凝血酶活性，下調(diào)相應(yīng)腦區(qū)自噬指標(biāo)LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)，并減少腦區(qū)自噬小體、自噬溶酶體、吞噬泡的數(shù)量。故認(rèn)為化瘀解毒方可能是通過抑制凝血酶的活性，下調(diào)了自噬的發(fā)生，從而減輕神經(jīng)功能損傷，發(fā)揮抗腦缺血作用。